Contagem e determinação da viabilidade das células em cultura

Determinar o número de células e cultura é importante na padronização das condições de cultura e na realização de experimentos onde são necessários números precisos de células. Aqui mostraremos como contar células usando um hemocitômetro e calcular a concentração de células presentes em suspensão. Também mostraremos como determinar o número de células viáveis presentes em sua cultura com o Trian Blue Viability Assay.

Olá, sou Ricky aqui no Laboratório do Dr.LAN na Rede de Laboratórios de Patologia Molecular no leste do Tennessee. Hoje vou mostrar como contar células e suspensões e como determinar sua viabilidade. Para preparar o hemocitômetro para contagem de células, primeiro você deseja limpar sua superfície e a lamínula que o acompanha com etanol a 70%.

A lamínula e o slide devem estar limpos, secos e livres de fiapos, impressões digitais e marcas d'água. Em seguida, molhe levemente as bordas do hemocitômetro com água da torneira e pressione a lamínula por cima dele. A lamínula deve repousar uniformemente sobre a área de contagem de prata.

Agora estamos prontos para a suspensão celular para preparar a suspensão celular para contagem. Primeiro, se as células forem cultivadas em culturas de monocamada, separe as células da superfície da placa usando tripsina, como visto no vídeo para colar células. Uma vez que as células tenham se desprendido da placa, dilua-as conforme necessário para obter uma suspensão uniforme.

Certifique-se de dispersar quaisquer aglomerados na suspensão ao usar o hemocitômetro. Recomenda-se uma contagem máxima de células de 20 a 50 células por um milímetro quadrado. Quando estiver pronto para carregar o hemocitômetro com sua amostra de células, use um micropipetador para transferir a suspensão celular para a borda da câmara de contagem do hemocitômetro.

Segure a ponta da pipeta sob a lamínula e dispense uma gota de suspensão. A suspensão será puxada sob a lamínula por ação capilar. Depois de encher a primeira câmara, encha a segunda câmara de contagem e você estará pronto para contar suas células antes de começar a contar.

As células permitem que as células se assentem por alguns minutos. Também ajuda a eliminar o excesso de líquido depois que as células se acomodam. Você pode visualizar a lâmina no microscópio com uma ampliação de cem vezes.

Você deve ver a grande área central da grade, que é delimitada por um conjunto de três linhas paralelas. As subdivisões dentro da grande área central também são delimitadas por três linhas paralelas e cada subdivisão é dividida em 16 quadrados menores por linhas simples. As células dentro desta área devem ser distribuídas uniformemente sem aglomeração.

Se as células não estiverem distribuídas uniformemente, lave e recarregue. O hemocitômetro usa um contador portátil para contar as células em cada uma das quatro células de contagem de quadrados centrais e de canto. Tocar a linha média da linha tripla na parte superior e esquerda dos quadrados não contava as células que tocavam a linha média das linhas triplas na parte inferior ou direita do quadrado.

Repita as contagens para a outra câmara de contagem. Depois de contar as células, você pode determinar o número de células por mililitro. Para fazer isso, pegue a contagem média de células por quadrado e multiplique pelo fator de diluição e por 10.000 para obter o número de células em sua amostra.

Multiplique as células por mililitro pelo volume total da suspensão celular da qual a amostra foi colhida. Agora estamos prontos para determinar a viabilidade de nossa suspensão. Para determinar o número de células viáveis em sua amostra, usaremos o azul D trian primeiro combinando 0,5 mililitros de 4% trian blue 0,03 mils, HBSS e 0,1 mils da suspensão celular em um pequeno tubo bem misturado e deixe o tubo repousar por cinco minutos antes de carregar o hemocitômetro.

As células viáveis não devem ser coradas, mas as células mortas aparecerão azuis sob o hemocitômetro. Conte o número total de células e o número total de células viáveis, células não coradas e calcule a porcentagem de células viáveis em sua amostra. Quando terminar, descontamine a lamínula no hemocitômetro enxaguando com etanol a 70% e depois com água deionizada.

Deixe secar ao ar e guarde-o até uso futuro. Acabamos de mostrar como determinar o número e a viabilidade de suas células cultivadas. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com todos os seus experimentos.