Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte der gesamten Mount-Immunhistochemie im Hühnerembryo unter Verwendung von HRP-konjugierten Sekundärantikörpern. Zuerst wird der Embryo in para-Formaldehyd fixiert. Dann wird die endogene Peroxidaseaktivität gestillt.

Der Embryo wird dann in einem primären Antikörper inkubiert. Nach mehreren Wäschen wird der Embryo in einem sekundären Antikörper inkubiert, der an HRP konjugiert ist. Die Farbreaktion wird mit DAB-Substrat sichtbar gemacht und die Antikörperfärbung erscheint orange. Der Vorteil dieser Methode gegenüber der Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern besteht darin, dass Embryonen für die Wachsschnitte aufbereitet werden können und somit Antigenstellen im Querschnitt untersucht werden können.

Hallo, ich bin Delphine vom Labor von FIN am Center for Environmental and Genomic Medicine in Texas a und m in Houston. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung von hormonellen Antikörpern, Färbungen in Wangenembryonen mit HRP-konjugierten Antikörpern. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die Morphologie von Embryonen nach einer Behandlung mit Antiepileptika zu untersuchen.

Fangen wir also an: Um eine Immunhistochemie des gesamten Mount an Hühnerembryonen durchzuführen. Öffnen Sie zuerst ein Ei, indem Sie mit einer Pinzette auf die Schale klopfen und Stücke der Schale entfernen. Entfernen Sie das dicke Albumin mit einer Pinzette und kippen Sie den Dottersack mit einer groben Pinzette so, dass der Embryo nach oben zeigt.

Zünden Sie dann eine feine Schere zusammen, um ein Quadrat Dottersack um den Embryo zu schneiden. Nehmen Sie den Embryo mit einem Löffel aus dem Eigelb und legen Sie ihn in eine Schale mit PBS unter einem Seziermikroskop. Entfernen Sie vorsichtig die Membranen im Eigelb und geben Sie den Embryo in eine frische Schale, die PBS enthält.

Nach dem Transfer des Embryos wird der Embryo mit einer Pinzette und Insektennadeln festgesteckt und das PBS abgesaugt. Ersetzen Sie dies durch 4%PFA in PBS und lassen Sie den Embryo eine Stunde bei Raumtemperatur fixieren, um eine mögliche mikrobielle Kontamination zu minimieren. Verwenden Sie D deionisiertes H2O, wenn alle folgenden Schritte nach der Fixierung des Embryos ausgeführt werden, aspirieren Sie die Fixierlösung und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß als chemischen Abfall.

Füllen Sie die Schüssel mit BS. Schneiden Sie anschließend mit einem Mikrodissektionsmesser ein Quadrat um den Embryo herum, um zusätzliche embryonale Membranen zu entfernen. Entfernen Sie Insektenstifte mit einer Pinzette, nachdem die Stifte entfernt wurden. Verwenden Sie eine Weidepipette mit stumpfen Enden, um den Embryo in ein Szintillationsfläschchen mit PBT zu übertragen.

Waschen Sie den Embryo dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBT. PBT aus dem Szintillationsfläschchen entfernen und durch PBTX mit 0,3 %H 2 0 2 ersetzen, um die potentielle endogene Peroxidase zu inaktivieren. Zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Mutator inkubieren.

Waschen Sie den Embryo zuerst dreimal für jeweils 10 Minuten, dann dreimal für jeweils 30 Minuten mit PBT. Den Embryo mit Antikörpern zu färben. Beginnen Sie damit, den Embryo eine Stunde lang in Blockierungspuffer oder 1%BSA 1%NGS zu waschen.

Wir verwenden NGS, weil der sekundäre Antikörper in der Ziege gezüchtet wird. Nach der Inkubation wird der Mutator eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, der Primärantikörper wird eins zu eins in Blockpuffer verdünnt und der Embryo wird in dieser Lösung zwei Tage lang bei vier Grad Celsius inkubiert. Auf Mutator.

Der Verdünnungsfaktor des Primärantikörpers hängt von der Wahl des Primärantikörpers ab. Hier verwenden wir einen Antikörper aus der Hybridbank DOMA der Entwicklungsstudien, der als Super Natin zur Verfügung gestellt wird. Wir verdünnen es eins zu eins in Blockierungspuffer.

Führen Sie als Nächstes drei 10-minütige Wäschen in PBT durch, gefolgt von drei einstündigen Wäschen in PBT. Nach dem Waschen den Sekundärantikörper um eins auf 2.500 in Blockpuffer verdünnen. In diesem Fall konjugierte Peroxidase Ziege Anti-US-IgG und inkubierte den Embryo in dieser Lösung über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem Mutator.

Führen Sie drei 10-minütige Waschungen in PBT durch, gefolgt von drei einstündigen Waschungen in PBT, um die Farbreaktion des gefärbten Embryos zu entwickeln. Die ersten beiden 20-minütigen Wäschen in Tris-Puffer 100 Millimolar Tris, HCL pH 7,4. Entfernen Sie anschließend die letzte TS-Pufferwäsche aus dem Fläschchen mit dem Embryo und ersetzen Sie es durch fünf Milliliter DAB-Lösung.

Lassen Sie es 20 Minuten lang im Dunkeln auf dem Mutator. Entsorgen Sie die Einor-Spitze in dem Eimer mit einer 10%igen Bleichlösung. Um DAB zu dekontaminieren, fügen Sie 16 Mikroliter hinzu.

Stamm H 2 0 2 in die Durchstechflasche mit den Embryonen in DAB. Bewahren Sie es im Dunkeln auf Überwachen Sie die Reaktion nach 10 Minuten unter dem Mikroskop, wenn die Farbreaktion abgeschlossen ist. DAB in einem Bleicheimer entsorgen und durch fünf Milliliter ersetzen.

Leitungswasser. Führen Sie als Nächstes zwei 10-minütige Wäschen in PBS durch, um sie für die Fotografie und das Wachsschneiden zu verarbeiten. Dehydrieren Sie den gefärbten Embryo in einer Ethanol-Serie, 25%50%75% und 100% für jeweils 10 Minuten.

Ersetzen Sie nach der Dehydrierung das Ethanol durch 0,5 bis einen Milliliter Zedernholzöl. Dadurch wird der Embryo durchscheinend für die Fotografie in Zedernholzöl. Nach dem Fotografieren den Embryo wieder in das Fläschchen legen und das Zedernholzöl durch 100%iges Ethanol ersetzen.

Ersetzen Sie schließlich Ethanol durch 5% schnelles grünes FCF in 100% Ethanol und inkubieren Sie es drei Minuten lang. Dieser Schritt macht die Embryonen für die Histologie sichtbar. Ersetzen Sie die schnelle grüne FCF-Lösung durch 100%iges Ethanol und Verfahren für die Histologie.

Hier sind drei Beispiele für gefärbte Embryonen. Diese Embryonen im Stadium 11 sind mit 15,3 B neun markiert oder nicht. Einer davon ist ein knotenstrangspezifischer Antikörper, der im Labor von Jane Dod und Tom Gessel entwickelt wurde.

Nach zwei Minuten in DAB ist der Embryo immer noch transparent. Nach 20 Minuten in DAB erscheint eine leichte Beschriftung im Knotencord. Nach 40 Minuten ist schließlich die Beschriftung des Knotenstrangs abgeschlossen.

In diesem Beispiel zeigen wir, wie PAC seven, ein Antikörper, der in Tom Jessels Labor entwickelt wurde, frühe Stadien des Neuralrohrverschlusses sowie die aus dem Mittelhirn austretenden kranialen Neuralleistenzellen erkennt. Hier wird der Embryo mit einer Croc 20-Sonde aus dem Labor von David Wilkinson markiert, gefolgt von keinem einzigen Antikörper. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Immunhistochemie des gesamten Mount durchführen, um Embryonen zu deaktivieren.

Dieses Verfahren kann auch bei Embryonen angewendet werden, die zuvor für die In-situ-Hybridisierung des gesamten Mount aufbereitet wurden. In diesem Fall fixieren Sie den Embryo nach der In-situ-Hybridisierung kurz für eine Stunde und fahren Sie dann mit der Antikörperfärbung fort. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.