Transfer jądra do komórki jajowej myszy

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ten film i protokół mają pomóc nauki transfer jądra.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Transfer jądra do zapłodnione komórki jajowej może przywrócić potencjału rozwojowego do zróżnicowanych komórek. To pokazuje, że procesy leżące u podstaw rozwoju, różnicowania i starzenie się są epigenetyczne, a nie genetyczne procesy. Odwracalności tych procesów otwiera ekscytujące perspektyw w zakresie badań podstawowych, a w bardziej odległej przyszłości, w medycynie regeneracyjnej. U myszy, embrionalnych komórek macierzystych mogą być uzyskane ze sklonowanych zarodków etapie preimplantacyjnej. Takie embrionalne komórki macierzyste mają zdolność do prowadzić do wszystkich typów komórek dorosłego organizmu. Co ważne, te komórki są genetycznie identyczne z dawcą. Jeśli zastosowanie do człowieka, pozwoli na wyprowadzenie komórek macierzystych od pacjenta. Komórki te mogą następnie być zróżnicowane w których to dotyczy typ komórek pacjenta oraz badania in vitro, lub stosowane w celu zastąpienia uszkodzonych lub brakujących ogniw. Badanie transfer jądra u myszy pozostaje istotne, ponieważ mogą nas informować o zasadach jądrowej przeprogramowania. Ten film i towarzyszący mu protokół mają pomóc nauki transfer jądra u myszy, metoda opracowana początkowo w grupie prof Yanagimachi (Wakayama et al. 1998).

Protocol

Przetwory:

  1. Szczegółowy opis superowulacja i mikrokropla kultury zarodka można znaleźć gdzie indziej 2.
  2. Przygotować naczynie Petriego z mikrokropel pożywce zarodków (np. KSOM, Chemicon). Pokrywa z oleju mineralnego (partii oleju mineralnego powinny być testowane na zgodność z kultury zarodków). Uzyskania temperatury 37 ° C w powietrzu plus 5% CO 2. (W Thermo-Electron 3110 wody inkubator z płaszczem lub odpowiednik)
  3. Przygotować naczynie do izolacji komórek jajowych: krople Miejsce hepes buforowane CZB i hialuronidazy (0,1% w / v, Sigma) w jednej połowie naczynia i HCZB w drugiej połowie. Pokrywa z oleju mineralnego. Trzymaj danie ciepłe na podgrzewanym etapie mikroskopem rozwarstwienie.
  4. Przygotowanie mikroskopu: Umieść gospodarstwa pipety z zewnętrznej średnicy około 50 μ m (nieco mniejsza niż średnica oocytu), i otwarcie około 20 μ m w jedną pipetkę posiadacza. Pipety Holding łatwe do wykonania wraz z niezbędnym wyposażeniem, igła ściągacza (Sutter Instruments) i microforge (Narishige), ale mogą być również zakupione od Humagen.

    Ładowanie 3-5 l rtęci μ do ogona mikropipety (średnica wewnętrzna 8 m μ). Unikać rozlania rtęci. Przygotuj danie z kilku małych kropli każdego z 11% w / v PVP (poliwinylopirolidon) w HCZB i 5 μ g / ml cytochalazyna B w HCZB. Użyj pokrywę płytki Petriego, a nie danie się jako pokrywy ma krótkie obręczy, która nie będzie kolidować z ruchem w gospodarstwie i pipety wyłuszczenie. Wyrównaj gospodarstwa pipety pipety wyłuszczenie w spadku HCZB. Nabrać trochę HZCB do końcówki pipety gospodarstwa.
  5. Przygotowanie komórek dawcy dużej mierze zależy od typu komórek i eksperyment badacz zamierza wykonywać. Ogólnie rzecz biorąc, komórek dawcy powinni być leczeni enzym proteolityczny, takich jak trypsyna i trzymano na lodzie w celu zmniejszenia lepkości do transferu.
  6. Humanitarnie eutanazji myszy 14-15 godzin po podaniu hCG. Jajowodów zbiorów i wnikliwie je w ciepłe krople HCZB-hialuronidazy. Po ok.. 5 min, komórek jajowych będzie przede wszystkim wolny od komórek wzgórka. Powinny one być następnie przemyto kilka razy w HCZB, następnie przemywa się jeszcze w pre-zrównoważoną krople KSOM, i przechowywane w inkubatorze do wyłuszczenie.

Wyłuszczenie

Manipulacje są wykonywane z hydraulicznym mikromanipulatorów (Narishige) na mikroskop odwrócony, takich jak Nikon TE200. Mikromanipulatora piezo (Primetech) jest używana do wiercenia osłonki przejrzystej. Płaskiego wyłuszczenie i pipety przenieść można kupić Humagen. Oczyścić i nasmarować pipety wyłuszczenie w PVP spada o wydaleniu mikroskopijnych kropelek rtęci i aspiracji i wydalenia PVP. Aby zapobiec lepkości igły, sama procedura powinna być wykonywana między każdej grupy komórek jajowych, które są enukleowanym lub przeniesione.

Miejsce małej grupy komórek jajowych do HCZB-cytochalazyna spadek B. Wielkość grupy powinna być dostosowana do poziomu doświadczenia badacza. Oocytów nie powinny być trzymane na scenie dłużej niż 20-30 min. Przenieś instrumenty HCZB-cytochalazyna B kropli. Gospodarstwa pipety pipety wyłuszczenie powinny zostać dostosowane do dostosowania się do płaszczyzny równikowej z komórki jajowej. Będzie to możliwe, jeżeli w gospodarstwie pipety ma zewnętrzną średnicę, która jest nieco mniejsza niż się komórki jajowej. Obracanie oocytów do inaczej załamania wrzeciona metafazy widać. Jeśli początkujący nie widać wrzeciona, metafazy płyty można zidentyfikować przy użyciu DNA barwnika Hoechst i oświetlenie UV, jednak, że nie jest zgodne z zasadami efektywności rozwoju embrionalnego. Umieść metafazy wrzeciona godzinie 3 i przytrzymać go dobrze z pipety gospodarstwa. Zastosuj impulsów piezo do penetracji osłonki przejrzystej. Dotknij metafazy płyta z pipety wyłuszczenie. Po opór wrzeciona metafazy może być "czuł", odciągnąć wrzeciona i wyciągnąć igłę. Cytoplazmie oocytu jest płynna, trzpień metafazie jednak porusza się w gąszczu przy dotknięciu z pipety. Spróbuj zmniejszyć ilość cytoplazmy, która została usunięta z wrzecionem. Po grupy oocytów został enukleowanym, umyć je przez pożywce zarodków i umieścić je w inkubatorze do transferu. Niektóre enukleowanym oocytów nie powinny zostać przeniesione, ale powinno być aktywowane i służą jako kontrola wyłuszczenie. Te oocytów będzie fragment ciągu kilku godzin, co oznacza udane wyłuszczenie.

Transfer jądra

Komórek miejsce w PVP rozwiązanie (11% PVP w HCZB). Jeśli wielu klonów aresztowania na etapie 1-komórek, stężenie PVP powinna zostać obniżona do 5% lub mniej. Komórek Mix oraz with PVP. Zebrać komórki za pomocą pipety o średnicy wewnętrznej nieco mniejszej niż średnica komórki. Błonę komórki powinien się na aspiracje. W niektórych przypadkach powtarzających się wydalenia i aspiracji, a także stosowanie delikatnych impulsów piezo może być używany do rozbijania komórek dawcy. Nowy spadek komórek dawcy powinny być z każdej grupy komórek jajowych zostało przeniesione, jak komórki dawcy stają się lepkie, po pewnym czasie. Wstrzyknąć podzielone komórki dawcy wkrótce po zerwaniu membrany. Transferu, skupić się na płaszczyźnie równikowej z oocytu się zamiast płaszczyzny równikowej warstwy przejrzystej i ustaw transfer i pipety gospodarstwa w tej samej płaszczyźnie. Trzymaj oocytów w tym część jej cytoplazmy mocno. Penetracji osłonki przejrzystej za pomocą impulsów piezoelektrycznych. Doprowadzić jądra dawcy do końcówki pipety, a następnie naciśnij końcówki pipety niemal do przeciwnej stronie enukleowanym oocytów, blisko pipety gospodarstwa, co głęboka bruzda w oocytu. Nabrać niewielką ilość cytoplazmy komórki jajowej do pipety, zastosować jeden słaby puls piezo do przerwania błony komórki jajowej, wysuwa jądra dawcy, wyciągnąć igłę szybko podczas zasysania w błonie cytoplazmatycznej na prawej stronie bruzdy. Przez jednoczesne wycofanie igły i aspiracji, powinno być możliwe, aby zamknąć otwór pozostawiony przez NT. Ta "technika usuwania otwór zmniejszy liczbę komórek jajowych, które lizy w NT. Umyć zrekonstruowany oocytów w KSOM i zwrócić je do inkubatora przez 1-3 godzin.

Aktywacja oocytów

Przygotuj połowę naczynia z kropelek wapnia wolne MCZB, a druga połowa z kropelkami wapnia wolne MCZB oraz 10 mM Sr 2 + oraz 5 μ g / ml cytochalazyna B hamuje polarnych wyciskanie ciała. Równowagi przez 30 min. poniżej 5% CO 2 w powietrzu. Umyć zarodków NT oraz w wolne od wapnia MCZB a następnie umieścić je w małych grupach w różnych kropli jonów wapnia MCZB. Powrót naczynie do inkubatora i kultury przez 5-6 godzin. Do kontroli sztucznego protokołu aktywacji i warunków hodowli zarodków, nie enukleowanym oocytów powinny być stosowane. Będą rozwijać się jako zarodki partenogenetyczne. Po aktywacji, myć embrionów poprzez KSOM i miejsce zarodków w inkubatorze do hodowli długoterminowej. Przedjądrzy powinny być widoczne w tym czasie, co wskazuje na udany transfer.

Pożywki zarodka Cookbook

Sole Mistrza

Zacznij 980 ml ​​ultra H 2 O w sterylnych 1 butelka L

Dodaj suche składniki:

NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886
KCl 360 mg (5 mM) Sigma P-5405
MgSO 4 • 7H 2 O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773
KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655
EDTA 2na 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635
Glukozy (D) 1000 mg (5,5 mm) Sigma G-6152

Dodaj płynnych składników

Na-mleczan (kwas mlekowy) 5,3 ml & nbsp; Sigma 44263
Pen'Strep 10 ml Gibco 15140-122

Na Sole MCZB fotografii:

Filtr sterylizacji 500 ml soli mistrza (dobry na 3-4 miesięcy; przechowywać w temperaturze 4 ° C)

Na Sole HCZB fotografii:

Start z 500 ml soli mistrza

Dodać 50 mg PVA (na zimno rozpuszczalny; Sigma P-8136)

Mieszać przez 30-60 min i (dobre 3 miesiące; przechowywać w temperaturze 4 ° C) sterylny filtr

Ca + + Darmowe MCZB (do aktywacji oocytów w 5% CO 2)

Start z 99 ml soli MCZB ręki

Dodaj suche składniki:


NaHCO3 211 mg Sigma S-5761

Na-pirogronian (kwas pirogronowy) 3 mg Sigma P-4562

L-glutamina 15 mg Sigma G-8540

Albuminy surowicy wołowej (BSA) 500 mg Sigma-3311

Swirl, aż wszystkie składniki są rozpuszczone, sterylny filtr.

HCZB (do mikromanipulacji w otaczającej atmosferze)

Start z 99 ml soli HCZB ręki

Dodaj suche składniki:


Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784

NaHCO3 42 mg Sigma S-5761

Dodaj płynnych składników:

128 mM CaCl2 (18.8g / l) 1 ml Sigma C-7902

Doprowadzić pH do 7.5 za pomocą 1 N HCl

Swirl aż do rozpuszczenia, sterylny filtr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Powodzenia!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

DE pragnie podziękować dr Ukryj Akutsu za podzielenie się swoją NT sztuczki i dr Stephen Sullivan i Garrett Birkhoff do krytycznej lektury protokołu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 ml master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics