ES células derivadas de células de las Culturas neuroepiteliales

Biology

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Summary

Derivación de los precursores neuroepiteliales de células madre embrionarias (ES) las células utilizando células estromales derivadas de la actividad de inducción (SDIA).

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Karki, S., Pruszak, J., Isacson, O., Sonntag, K. C. ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (1), e118, doi:10.3791/118 (2006).

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Abstract

Células madre embrionarias tienen el potencial de diferenciarse en células de todas las capas germinales, que los convierte en una herramienta atractiva para el desarrollo de nuevas terapias. En general, la diferenciación de las células madre embrionarias sigue el concepto de generar primero las células progenitoras inmaduras, lo que puede ser propagado y diferenciarse en fenotipos celulares maduros. Esto también se aplica ES células derivadas de la neurogénesis, en el que el desarrollo de las células nerviosas después de dos pasos principales: en primer lugar, la derivación y la expansión de inmaduros precursores neuroepiteliales y la segunda, su diferenciación en células maduras neural. Un método común para producir progenitores neurales de células madre embrionarias se basa en el cuerpo embrioides (EB) la formación, lo que revela la diferenciación de las células de todas las capas germinales incluyendo neuroectodermo. Un método alternativo y más eficiente para inducir el desarrollo de células neuroepiteliales utiliza células estromales derivadas de la actividad de la inducción (SDIA), que se puede lograr mediante el cultivo de células madre embrionarias cooperación con los huesos del cráneo derivadas de la médula las células del estroma (1). Tanto, la formación de EB y SDIA, revelan el desarrollo de la roseta-como las estructuras, que se cree que se asemejan en el tubo neural y / o progenitores neurales como la cresta. Los precursores neuronales pueden ser aislados, ampliado y diferenciado aún más hasta convertirse en neuronas específicas y las células gliales con las condiciones definidas por la cultura. Aquí se describe la generación y el aislamiento de rosetas como en los experimentos de co-cultivo con la línea de células del estroma MS5 (2-5).

Protocol

Paso 1

  1. Placa de mitomicina-C ggrowth inhibido (10 mg / ml durante 2,5 horas) MS5 las células a una densidad de 70.000 / cm2 en recubiertos de gelatina (0,01% durante 30 minutos) 6 placas en α-MEM medios de comunicación.
  2. Cuando las células se unen y se han formado una monocapa (sobre el crecimiento de la noche), cambiar a SRM.
  3. Manualmente aislar colonias de células ES de los cultivos de células ES mediante una jeringa con una aguja de 27 G ½.
  4. Tritrurate las colonias con cuidado con una punta de 1 ml y una placa azul en baja densidad en el MS5 células (normalmente 2-3 colonias por placa y 6).

Nota: Las células madre embrionarias también se puede tomar de la propagación enzimática con colagenasa y tripsina.

Paso 2

  1. Crecen las células madre embrionarias en el MS5 alimentadores durante 14-21 días hasta roseta que contienen la formación de colonias.


Nota: los medios de comunicación cambian a menudo. Las rosetas son por lo general en los bordes exteriores de las colonias y su formación puede ser mucho mayor si 300-500 ng / ml Noggin se añade a la SRM (3). En algunos protocolos de diferenciación, SRM se pueden intercambiar con N2-A los medios de comunicación y se complementa con el crecimiento y otros factores para promover la especificación de células (2-5).

Paso 3

  1. Aislar y recoger las rosetas con una aguja de 27 ½ G con un microscopio.

Nota: Evite cortar y recoger el MS5 las células del estroma. Si las colonias están llenos de rosetas, también se puede aislar a toda la colonia.


Paso 4

  1. Aspirar los grupos de rosetas, los tritrurate cuidadosamente con la punta de 1 ml azul, y la placa que en la poli-L-ornitina (0,001%) y fibronectina (1 mg / ml) o laminina (1 mg / ml) con cubierta de 6 pozos N2-A los medios de comunicación suelen complementarse con bFGF (20 ng / ml). Las rosetas se reforma y expansión.

Nota: Para mejorar la supervivencia de las células, se puede placa pequeños grupos en las gotas para aumentar la densidad celular. Este paso también puede ser modificada por que complementa la N2-A los medios de comunicación, con un crecimiento adicional u otros factores para promover la especificación de células (2-5).

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Discussion

Este protocolo demuestra los diferentes pasos en la creación y aislamiento de células neuroepiteliales de células madre embrionarias humanas con SDIA. La aplicación de este método es múltiple y se ha utilizado en muchos protocolos para producir neuronas específicas (por ejemplo 1, 2, 5-9). Las rosetas se cree que se asemejan a las células del tubo neural con un fenotipo anterior (2, 5, 10) y también contienen células progenitoras de la cresta neural (11, 12). Además, conservan un cierto nivel de plasticidad, ya que pueden ser modelados por factores específicos en condiciones de cultivo definido. Por lo tanto, los progenitores SDIA derivados neural puede dar lugar a muchos tipos de células del sistema nervioso central y periférico que los convierte en herramienta útil para la derivación de las diferentes poblaciones de células neuronales en los paradigmas de la diferenciación de células ES.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030
alpha-MEM GIBCO, by Life Technologies 12571
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
Knockout-DMEM GIBCO, by Life Technologies 10829
Knockout serum replacement GIBCO, by Life Technologies 10828
MEM nonessential amino acid solution GIBCO, by Life Technologies 12383
DMEM/F12 GIBCO, by Life Technologies 11330
N2-A supplement Stem Cell Technologies 07152
Mitomycin-C Sigma-Aldrich M0503
Gelatine type-A Sigma-Aldrich G1890
poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957 0.01% solution
Laminin Sigma-Aldrich L-2020
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen 13256
1 mL Syringe with 27 1/2 G needle BD Biosciences 309623
N2-A media medium DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement media (SRM) medium Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM media medium α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin
MS5 cell line stromal cells
Microscope
6-well Plates for tissue culture

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References

  1. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. Where can we get MS5 stromal cell line?

    Sergey Akimov, JHU SOM

    Reply
    Posted by: Sergey A.
    June 24, 2010 - 12:00 PM
  2. Just now noticed your comment. I believe the easiest way to obtain MS5 cells is via DSMZ - (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures; http://www.dsmz.de). The MS5 line is internal DSMZ no."ACC 441".

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 27, 2011 - 8:32 AM

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