ES células derivadas de células de las Culturas neuroepiteliales
Summary
Derivación de los precursores neuroepiteliales de células madre embrionarias (ES) las células utilizando células estromales derivadas de la actividad de inducción (SDIA).
Abstract
Células madre embrionarias tienen el potencial de diferenciarse en células de todas las capas germinales, que los convierte en una herramienta atractiva para el desarrollo de nuevas terapias. En general, la diferenciación de las células madre embrionarias sigue el concepto de generar primero las células progenitoras inmaduras, lo que puede ser propagado y diferenciarse en fenotipos celulares maduros. Esto también se aplica ES células derivadas de la neurogénesis, en el que el desarrollo de las células nerviosas después de dos pasos principales: en primer lugar, la derivación y la expansión de inmaduros precursores neuroepiteliales y la segunda, su diferenciación en células maduras neural. Un método común para producir progenitores neurales de células madre embrionarias se basa en el cuerpo embrioides (EB) la formación, lo que revela la diferenciación de las células de todas las capas germinales incluyendo neuroectodermo. Un método alternativo y más eficiente para inducir el desarrollo de células neuroepiteliales utiliza células estromales derivadas de la actividad de la inducción (SDIA), que se puede lograr mediante el cultivo de células madre embrionarias cooperación con los huesos del cráneo derivadas de la médula las células del estroma (1). Tanto, la formación de EB y SDIA, revelan el desarrollo de la roseta-como las estructuras, que se cree que se asemejan en el tubo neural y / o progenitores neurales como la cresta. Los precursores neuronales pueden ser aislados, ampliado y diferenciado aún más hasta convertirse en neuronas específicas y las células gliales con las condiciones definidas por la cultura. Aquí se describe la generación y el aislamiento de rosetas como en los experimentos de co-cultivo con la línea de células del estroma MS5 (2-5).
Protocol
Discussion
Este protocolo demuestra los diferentes pasos en la creación y aislamiento de células neuroepiteliales de células madre embrionarias humanas con SDIA. La aplicación de este método es múltiple y se ha utilizado en muchos protocolos para producir neuronas específicas (por ejemplo 1, 2, 5-9). Las rosetas se cree que se asemejan a las células del tubo neural con un fenotipo anterior (2, 5, 10) y también contienen células progenitoras de la cresta neural (11, 12). Además, conservan un cierto nivel de plasticidad, ya que pueden ser mod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| alpha-MEM | Gibco | 12571 | ||
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829 | ||
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828 | ||
| MEM non-essential amino acid solution | Gibco | 12383 | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | ||
| N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| mitomycin-C | Sigma | M0503 | ||
| gelatine type-A | Sigma | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 0.01 % solution | |
| laminin | Sigma | L-2020 | ||
| fibronectin | Sigma | F2006 | ||
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 1 ml syringe with 27 1/2 G needle | Becton Dickinson | 309623 | ||
| N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
| Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20 % Knockout serum replacement +1% MEM non-essential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
| α-MEM media | medium | α-MEM + 10 % FBS + 2 mM L-glutamine + 1%penicillin/streptomycin | ||
| MS5 | cell line | stromal cells | ||
| Microscope | ||||
| 6 well plates | for tissue culture |
References
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
- Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
- Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
- Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
- Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
- Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
- Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
- Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
- Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
- Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).
