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Modèle murin de la maladie de Parkinson: de lésion dopamine 6-OH au test comportemental

Biology

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Summary

La maladie de Parkinson est causée par la perte de l'innervation dopaminergique dans le striatum, qui peut être induite expérimentalement par la 6-OH-dopamine. Nous décrivons comment effectuer une lésion stéréotaxique et de surveiller l'apomorphine induit un comportement de rotation chez la souris. Ce modèle est utile et fiable pour les tests de nouvelles thérapies pour la maladie de Parkinson.

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da Conceição, F. S., Ngo-Abdalla, S., Houzel, J., Rehen, S. K. Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test. J. Vis. Exp. (35), e1376, doi:10.3791/1376 (2010).

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Abstract

La maladie de Parkinson (MP) affecte au moins 6,5 millions de personnes dans le monde entier, indépendamment du sexe, les frontières sociales, ethniques, économiques ou géographiques. Les symptômes principaux, tels que tremblements, rigidité et bradikinesia, développer lorsque environ 3 / 4 des cellules dopaminergiques sont perdus dans la substantia nigra, et ne parviennent pas à fournir pour la douceur, la régulation coordonnée des circuits moteurs du striatum. La dépression et les hallucinations sont fréquentes, et la démence survient finalement dans 20% des patients. À ce moment, il n'existe aucun traitement pour retarder ou arrêter la progression du Parkinson. Plutôt, les médicaments actuellement disponibles visent plus vers la réduction de ces symptômes. De nouvelles stratégies chirurgicales peuvent passer réversiblement sur les circuits fonctionnellement endommagé par la stimulation électrique des structures cérébrales profondes, mais bien que la stimulation cérébrale profonde est une avancée majeure, il ne convient pas à tous les patients. Il reste donc nécessaire de tester de nouvelles approches de thérapie cellulaire dans des modèles précliniques.

Sélective des perturbations des voies dopaminergiques neurotoxiques peuvent être reproduites par l'injection de 6-hydroxydopamine (6-OHDA) ou MPTP (1-méthyl-4-phényl-1 ,2,3,6-tertahydropyridine) alors appauvrissant la drogue et l'oxydation qui endommagent les produits chimiques peuvent également reproduire les caractéristiques spécifiques de PD chez les rongeurs. Contrairement à la MPTP, 6-OHDA, provoquent des lésions massives perte irréversible des neurones, et peut être uni-ou bilatérale. Le modèle lésion 6-OHDA est fiable, conduit à des déficits moteurs robustes, et est la plus largement utilisée après 40 années de recherche dans rats1. Comme les interactions entre les cellules greffées et l'hôte peut désormais être étudié plus à fond dans des souris plutôt que chez le rat, le modèle a été transposé à des souris 2,3, où il a été récemment caractérisée 4.

Dans cette vidéo, nous démontrons comment une lésion gauche nigro-striatale voie de souris anesthésiées par lentement livrer 2,0 uL de 6-OHDA par un stéréotaxique inséré micro-seringue aiguille. La perte de l'apport dopaminergique survient en quelques jours, et les déficiences fonctionnelles peuvent être surveillés au cours post-opératoire des semaines et des mois par des rotations d'animaux notation induite par les agents dopaminergiques 5. Ici, nous montrons tout le corps rotations controlatérales survenant 10 minutes après une administration unique sous-cutanée d'apomorphine, mesurée un mois après la lésion. Les résultats et les inconvénients sont discutés ci-dessous.

Protocol

Tous les produits chimiques stockés sous forme solide, comme le 6-OHDA et apomorphine, ont été dilués dans de l'eau d'injection stérile et filtrée dans une hotte à flux laminaire, pour éviter toute contamination. En outre, les neurotoxines et substances neuro ont été entreposés, préparés, manipulés et éliminés conformément aux règlements établis par les directives internationales 6 et le Comité de biosécurité locales.

1 - L'anesthésie et la chirurgie

Adulte souris mâles Swiss (25-30g) sont une prémédication par l'atropine (0,2 mg / kg, sc) pour réduire le tonus vagal puis anesthésiés avec une injection intrapéritonéale de kétamine (90-120 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) . L'animal est placé sur un coussin chauffant à commande électronique (Insight) pour assurer la température du corps est maintenue à 37 ° C, que l'induction de la sédation prend quelques minutes. Le niveau d'anesthésie est vérifiée tout au long de la procédure en testant l'absence de réflexe de retrait. Dosage anesthésique devrait être ajusté pour chaque souche / colonie. Selon l'animal et la durée de l'intervention chirurgicale, des doses supplémentaires de la kétamine peut être nécessaire. Après cela, une solution saline (NaCl 0,9%) est appliqué sur les deux yeux afin de protéger les cornées de s'assécher et de tester l'absence de réflexe de clignement dans ce premier moment. La fourrure sur la tête entière est rasée avec une tondeuse à assurer le minimum de contact avec les zones non stériles. L'anesthésie locale (xylocaïne) est appliquée aux barres d'oreille pour éviter la gêne. Une seule fois de retrait et de réflexe de clignement ont disparu, indiquant le niveau d'anesthésie est assez profond pour la chirurgie (phase 3), l'animal est placé sur le cadre stéréotaxique utilisant embouchure et de barres d'oreilles spécialement conçu pour cette espèce (Insight). Une fois positionated, d'une pommade ophtalmologique (Marca) est appliqué pour protéger les yeux des animaux à travers toute la chirurgie. C'est seulement après être sûr que les yeux sont correctement protégés, la procédure continuera avec la désinfection de la peau de la région chirurgicale en répétant trois applications de l'iode povidone suivie par 70% d'éthanol, en utilisant des tampons stériles cotons Après, bon positionnement des barres oreille est assurée par des tests pour les mouvements latéraux de la tête (la tête ne doit pas bouger afin de s'assurer que les barres sont solidement fixées). Une bonne inclinaison de la tête dorsoventral sera vérifiée ultérieurement où les repères du crâne sont révélés. Une incision sagittale (1,5 cm) est fait avec un scalpel stérile (# 15 lames). Le périoste sur la zone d'intérêt est légèrement gratté avec une lame neuve, et l'os est essuyée avec le regard stérile et tampons de coton, de découvrir repères du crâne: bregma est défini comme le point d'intersection des sutures sagittale et coronale, tandis lambda est le point d'intersection de la suture sagittale et la ligne de meilleur ajustement passant par les parties gauche et droite de la suture lambdoïde. La pointe d'une aiguille de référence alignés verticalement est d'abord remis à zéro à la bregma, à l'examen au microscope chirurgical, puis déplacé à toucher le point lambda. Si la tête est correctement positionnée, lambda devrait être au même niveau dorso-ventrale que bregma, et les deux points de repère doivent être éloignés de 4,2 mm sur l'axe rostro-caudal. Sinon, les barres oreilles et nez devrait être desserrer et la tête inclinée délicatement autour de l'axe interaural, afin d'atteindre la position désirée, qui définit le «crâne plat» de référence pour les mesures stereotaxical. La pointe de l'aiguille de référence est alors positionné aux coordonnées souhaitées: antéro-postérieure (AP 0.5 mm) et latérales (L -2,0 mm, gauche). L'emplacement est marqué sur le crâne et une petite taille (1,2 mm de diamètre) le trou est ouvert avec un foret stérilisés, en utilisant l'action intermittente pour empêcher la chaleur de la région. Des fragments osseux sont soigneusement enlevés avec une curette dentaires et lavé avec de stériles chaude de NaCl 0,9%. Le stérilisée 5 pl seringue Hamilton (26s jauge; 0,47 mm de diamètre extérieur) est chargé avec la solution de 6-OHDA (ou d'un véhicule pour les animaux de contrôle) et alignés verticalement dans l'appareil de stéréotaxie. La pointe de l'aiguille (de type 2 ou 12 coniques °) est alors insérée dans le trou ouvert, jusqu'à toucher la surface piales, pour déterminer la référence de la coordonnée dorso-ventrale. Une fois déterminée cette coordonnée, l'aiguille est descendu lentement pour atteindre les coordonnées du striatum (AP: 0,5; L: -2,0 et DV: -3,0 mm, en dessous de la surface piales 7). La solution de 6-OHDA (10 ug 6-OHDA dans NaCl 0,9% avec de l'acide ascorbique 0,02%), qui a été préparée et filtrée dans une hotte à flux laminaire, et doit être protégé de la lumière par des feuilles d'aluminium pendant toute la procédure, est ensuite injecté à un débit de 0.1μL/min. Pour les animaux de contrôle, un volume égal de véhicule (0,02% d'acide ascorbique et 0,9% de NaCl dans l'eau stérile) est injecté. Une fois l'ensemble de 2,0 uL a été injecté, la seringue est maintenu en place pendant 5 min avant d'être très lentement rétracté par le cerveau, dans pas moins que dans les 5 minutes. Le crâne est nettoyé et l'incision est refermée à l'aide d'une suture # Nylon 6-0 (Shalon). Pour prendre un supplémentairesoins contre l'infection, un onguent antibiotique local, comme la néomycine, peut être appliqué sur la peau suturée. Les animaux sont retirés de la trame, étant donné 0,5 ml de solution saline (sc.) pour prévenir la déshydratation, et gardé au chaud et sous surveillance étroite jusqu'à la guérison complète. Ils sont alors logés avec nourriture et eau ad libitum. Analgésique est ajouté à la bouteille d'eau potable pour les deux premiers jours après la chirurgie (donné une consommation d'eau moyenne quotidienne de 5,5 ml, et une dose recommandée de 0,03 mg d'ibuprofène / g de poids corporel / jour, ajouter 0,82 ml de 20 mg / ml Ibuprofène-Abbott suspension à 100 ml d'eau potable). Souris guérissent habituellement sans délai de la procédure, l'errance et d'atteindre des boulettes de nourriture de l'eau facilement. Dans tous les cas de malaise apparent, ou tout signe d'infection, les animaux doivent être euthanasiés conformément aux directives locales.

2 - test comportemental

Bien déficience motrice peut être observée après une semaine, un intervalle post-lésionnelle d'un mois est autorisée avant quantification fiable avec le test de rotation. L'animal reçoit une injection sous-cutanée d'apomorphine agoniste DA (0,5 mg / kg), et est placé dans un cylindre opaque de 30 cm de diamètre, placé à 45 cm en dessous de la caméra d'enregistrement. Il est important d'enlever tous les résidus et les odeurs des animaux préalablement testés avant chaque test. Après une période d'habituation 5 min, ses mouvements sont enregistrés sur une période de 5 min. Les deux contre-ipsilatérale et du corps entier de rotation sont mesurés et comparés au groupe témoin (véhicule injectés). Si la procédure a été correctement effectuée, les animaux de contrôle ne présentent aucune rotation, tandis que la 6-OHDA animaux lésés commence à tourner sur le côté controlatéral, puisque l'agoniste active principalement dans le striatum dénervé supersensibles sur le côté lésé. Animaux score de plus de 7 tours (affichant au moins 7 rotations du corps entier controlatéral par minute) sont considérés comme des succès lésé. L'animal peut être renvoyés en toute sécurité à leur logement 30 min après le test, qui peut être répété chaque semaine. Dans nos mains, à moins de 5% des souris lésées affiché des taux de rotation optimales.

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Discussion

Vaste lésion unilatérale de la voie nigro-striatale peut être réalisé de manière fiable chez la souris par une seule injection stéréotaxique de 6-OHDA dans le striatum. L'étendue de la lésion peut être vérifiée post-mortem par immunohistochimie de la tyrosine hydroxylase (qui catalyse la limitation du débit stade de la synthèse de DA, à savoir la conversion de la L-tyrosine en dihydroxyphénylalanine), comme illustré dans la vidéo.

In vivo, les rotations controlatérales induites par l'apomorphine est un meilleur prédicteur de la lésion striatale maximale que l'amphétamine induit une rotation ipsilatérale 8. Ainsi, les conséquences fonctionnelles de la lésion peut être surveillé pendant plusieurs mois par une mesure simple de l'apomorphine induit rotations controlatérales.

Le taux de réussite est d'environ 95%. Il est nettement plus élevé que ce qui est habituellement rapportés pour des rats (50-70%), dans lequel vaste déplétion dopaminergique nécessite des injections multiples de la neurotoxine et augmente le taux de mortalité. Chez les souris, les conditions expérimentales doivent être normalisées en sélectionnant les animaux de l'appariement de poids, et en utilisant uniquement fraîchement préparés 6-OHDA solution. Bien que d'autres groupes peuvent utiliser des concentrations différentes et / ou des volumes de neurotoxine, nous avons constaté que 2 ml d'une 5 mg / ml solution saline de 6-OHDA (contenant de l'acide ascorbique 0,02% pour éviter l'oxydation) sont les plus efficaces pour lésion maximale. Alternativement, les injections sous-maximal pourrait être utile pour imiter la dégénérescence progressive des terminaisons dopaminergiques qui se produit chez les humains, en particulier dans les formes juvéniles et l'apparition précoce de PD 9.

Lésions MPTP peut conduire à une guérison spontanée, et est en outre sensible à sexe, âge, et la souche. Une étude récente indique que ce n'est pas le cas pour les 6-OHDA lésions chez les souris, qui produisent massivement et à long réductions durables de la teneur résiduelle DA au sein du striatum, ainsi que du nombre de TH cellules positives dans la substantia nigra dans tous les 10 souris testées.

A l'heure actuelle, le modèle lésion 6-hydroxydopamine de Parkinson - qui a été largement utilisé pendant 40 ans chez les rats -, peuvent être transposées de manière fiable à des souris. Nous espérons que cette vidéo sera utile à d'autres groupes, et ainsi réduire le nombre d'expériences et d'animaux nécessaires pour la recherche préclinique sur les nouvelles thérapies cellulaires pour le PD 11.

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Disclosures

Des expériences ont été effectuées en conformité avec les Lignes directrices internationales pour les soins et l'utilisation des mammifères dans les neurosciences et la recherche sur le comportement

Acknowledgements

Soutenu par la Fundação de Amparo une Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) et Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico e Científico (CNPq). Nous sommes reconnaissants aux lecteurs anonymes dont les commentaires nous ont aidés à améliorer à la fois le manuscrit et la vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride König 90-120 mg/Kg
Xylazine hydrochloride König 10 mg/Kg
Atropine Sulfate Isofarma Isofarma
6 – Hydroxydopamine Hydrochloride Sigma-Aldrich 5 μg/μL
L - Ascorbic Acid USB Corp., Affymetrix 0.2%
Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) AstraZeneca 5%
50 mg
Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) Altana Pharma 5 mg/g + 250 Ul/g
R-(-)-Apomorphine hydrochloride Sigma-Aldrich 0.5 mg/Kg
GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose Novartis AG
0.33%
Ibuprofen Abbott Laboratories 4 mg/ 100 ml drinking water
Povidine Johnson Diversey
R-(-)-Apomorphine hydrochloride Sigma-Aldrich 0.5 mg/Kg

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References

  1. Ungerstedt, U. 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).
  2. Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease. J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).
  3. Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).
  4. Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., Höglinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice. Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).
  5. Ungerstedt, U. 6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome. Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).
  6. Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. National Academies Press. Comissão de Biosegurança, CCS-UFRJ. 209 (2003).
  7. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. (1997).
  8. Hudson, J. L., Horne, C. G. van, Strömberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res. 626-6167 (1993).
  9. Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions. Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).
  10. Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).
  11. Isacson, O. Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease. JoVE. 3, (2007).

Comments

14 Comments

  1. I would like to read the paper
    Could you sent it to me?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2010 - 3:10 PM
  2. Sorry for take so long to answer. I didn`t know that the pdf wasn`t avaiable on "free-trial" access. Just send me your email adress, ok ?
    Fabio

    Reply
    Posted by: Fabio C.
    April 16, 2010 - 3:58 AM
  3. Could you send the paper and video to me?
    Thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 1, 2011 - 4:01 AM
  4. Dear Wei Cao, Thanks for your interest. Please send your email so that I can send you a PDF.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 11, 2011 - 2:17 PM
  5. The papar is very interesting. Could you send it to me?
    Thank you very much!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 10, 2011 - 5:02 AM
  6. I want to read the paper... Could you sent it to me?
    thank you so much..... my email adress: kimjin006@gmail.com......
    thanks

    Reply
    Posted by: J K.
    July 14, 2010 - 6:15 AM
  7. hey that´s nice. please sent me the paper

    best, alanjmejia@inbox.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2010 - 6:21 PM
  8. Olá Fábio,

    Sou professora em Belém e estou trabalhando com o modelo de 6-OHDA em camundongos. Vc poderia me enviar uma cópia do seu artigo? Meu email é esyamada@ufpa.br. Obrigada!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2010 - 9:47 PM
  9. Hi, Would you like to send your paper , please.
    Well I´ve just started to work with 6-OHDA parkinson´s disease model. I checked your video from jove and its pretty nice but I am performing my model using rats. I noticed that you consider that if 6-OHDA is yellow is oxidate and when it is brown is ok. But when I mix the solution ( water destilled + ascorbic) with 6-OHDA dŒs not turn inmediately to brown ,. is it ok???. should I use when it is brown??.

    Reply
    Posted by: alan jesus m.
    December 28, 2010 - 5:49 PM
  10. Reply
    Posted by: alan jesus m.
    December 28, 2010 - 5:50 PM
  11. could you please send me the paper?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2011 - 1:19 PM
  12. Could you tel me if there any film about this article is?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 10, 2011 - 7:15 PM
  13. Dear Fabio,

    Please could I have the paper and videos? I've just started with 6-OHDA-lesion rats and I'm in blind. Many thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2011 - 2:30 PM
  14. Hello all,

    Thank you for your interest in viewing this article. Should you not have access to the entire content through subscription, please feel free to request a subscription through your institution by using the link below,
    http://www.jove.com/recommend.php
    Alternatively, you may contact our libraries department for further assistant at Library@jove.com

    cheers!

    Reply
    Posted by: Leiam C.
    April 20, 2011 - 3:52 PM

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