में दिल की धड़कन visualizing ड्रोसोफिला

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

तकनीक लार्वा और वयस्क में दिल की धड़कन visualizing के लिए आवश्यक

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the Beating Heart in Drosophila. J. Vis. Exp. (31), e1425, doi:10.3791/1425 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

इससे पहले कि आप शुरू

वयस्क दिल

  1. हौसले से कृत्रिम (आह) hemolymph 108mM ना युक्त समाधान + कश्मीर 5mm +, 2mm 2 Ca +, 8mm 2 MgCl, 1mm नाह से 2 4 पीओ, 4mm 3 NaHCO, 10mm sucrose, 5mm Trehalose, 5mm HEPES (7.1 पीएच, सभी अभिकर्मकों तैयार सिग्मा रसायन). sucrose और Trehalose प्रशीतित शेयर समाधान से आह करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए सिर्फ पहले का उपयोग करने के क्रम में बैक्टीरियल संदूषण रोकने के.
  2. कमरे के तापमान और कम से कम 15 मिनट के लिए हवा बुदबुदाती द्वारा समाधान आक्सीजन के साथ मिलना मुख्यालय लाओ.
  3. कई ठीक capillaries (जैसे ग्लास capillaries, 100ul, VWR) वसा को हटाने के लिए आवश्यक खींचो.

लारवल दिल

  1. Sylgard - लेपित coverslips: Sylgard समाधान के 50 - 70μl के बारे में एक 22x22mm coverslip पर एक दंर्तखोदनी हस्तांतरण का उपयोग कर. 65 डिग्री सेल्सियस रात खत्म Sylgard कठोर चलो.
  2. Broadie और पीटा बफर (; पीएच 7.15 Broadie और पीटा, 1993 देखें 135mm NaCl, 5mm KCl, 4mm 2 MgCl 2mm 2 CaCl, 5mm TES, 36mm Sucrose) तैयार.
  3. Histoacryl गोंद को लागू करने के लिए आवश्यक उपकरण तैयार. सबसे पहले, कई ठीक capillaries (जैसे विज्ञान उत्पाद GB100T8P) खींचो. ट्यूब में छोटे अंत डालने से एक छोटे से प्लास्टिक टयूबिंग (Tygon, 1 / 32 ") के साथ एक 1.5ml विंदुक टिप कनेक्ट. दूसरे सिरे को अपने व्यापक खोलने के साथ एक केशिका डालें. Histoacryl गोंद के साथ प्लास्टिक टिप में गोंद और कोमल चूषण की एक बूंद में केशिका सूई से केशिका लोड. जब गोंद के साथ काम कर रहे एक हाथ में एक दूसरे केशिका गिलास केशिका गोंद की नोक से अत्यधिक गोंद को दूर करना चाहिए. गोंद तरल है जब तक यह सेकंड के एक जोड़े के भीतर buffered खारा जहां यह कठोर के साथ संपर्क में आता है है. हालांकि, यह आम तौर पर लंबे समय पर्याप्त प्लास्टिक गोंद केशिका सिरे से या के लिए है जबकि यह नमूना के लिए आवेदन हटाया जाना रहता है.

अर्ध - वयस्क फ्लाई से बरकरार ड्रोसोफिला हार्ट

  1. वयस्क ड्रोसोफिला मक्खियों 2-5 मिनट के लिए फ्लाई झपकी (केरोलिना जैव आपूर्ति कं) के साथ anesthetized हैं. केयर अब निवेश के लिए फ्लाई झपकी में मक्खियों को नहीं छोड़ करने के लिए लिया जाना चाहिए. ठंडा करने के लिए लघु अवधि के जोखिम भी मक्खियों anesthetize किया जा सकता है लेकिन सीओ 2 के रूप में यह अब दिल की दर और rhythmicity पर स्थायी प्रभाव है की सिफारिश नहीं है.
  2. Anesthetized मक्खियों रखा पृष्ठीय पक्ष नीचे एक पेट्री डिश में पेट्रोलियम जेली की एक पतली परत के साथ लेपित,. पंख और शरीर में हाइड्रोफोबिक छल्ली reversibly "छड़ी" जेली लेकिन अगर जरूरत है मक्खी repositioned किया जा सकता है. यह बाद जोड़तोड़ के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है.
  3. एक प्रारंभिक कटौती वसंत कैंची की एक घुमावदार जोड़ी (# Roboz 5611) का उपयोग किया जाता है. कैंची ब्लेड पैरों के नीचे रखा जाता है और गर्दन के निकट छाती की पृष्ठीय सतह के नीचे की ओर angled है. एक एकल में कटौती के साथ सिर, उदर तंत्रिका कॉर्ड, और पैर को हटा रहे हैं. तैयारी तो एक oxygenated, कृत्रिम (आह) hemolymph समाधान में डूबे हुए है.
  4. वसंत कैंची का प्रयोग पेट (उदर 7 और 8 खंडों के शामिल) के पीछे टिप एक एकल कटौती के साथ हटा दिया जाता है. यह पेट के दोनों किनारों के साथ पार्श्व कटौती करने के लिए पहुँच प्रदान करता है और पीछे पेट और पेट की छल्ली के बीच कनेक्शन को तोड़ करता है. उदर पेट की छल्ली के मुक्त प्रालंब तो निकाल दिया जाता है.
  5. चरण 3 और 4 में पेट की पूर्वकाल और कूल्हों कनेक्शन तो पेट अंगों को अब केवल tracheols द्वारा जगह में आयोजित कर रहे हैं कटे हैं. पेट और अन्य उदर अंगों को आमतौर पर एक एकल जौहरी (Roboz, 55 #) संदंश और कोमल tugging का उपयोग कर जन के रूप में हटाया जा सकता है है. आंतरिक अंगों को निकालना दिल की धड़कन अभी भी पृष्ठीय वसा निकायों द्वारा घिरा छल्ली से जुड़ी ट्यूब से पता चलता है.
  6. वसा शरीर प्रकाश माइक्रोस्कोप में काफी अपारदर्शी रहे हैं फलस्वरूप यह अक्सर आवश्यक है इस वसा के कुछ दूर क्रम में दिल ट्यूब स्पष्ट रूप से देखने. यह एक liposuction तकनीक का उपयोग कर पतले तैयार कांच capillaries के द्वारा पूरा किया है. Capillaries मानक विंदुक डांड़ी (उदाहरण Sutter P-97 पिपेट डांड़ी) का उपयोग किया जाता है और फिर एक वैक्यूम स्रोत से जुड़ी (Tygon, 1 / 16 ") प्लास्टिक टयूबिंग में डाला. इस प्रणाली के दिल ट्यूब के चारों ओर से अतिरिक्त वसा को बंद चूषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सक्शन बल टिप व्यास के लिए आनुपातिक है तो व्यास में 40 माइक्रोन से बड़ा सुझावों के साथ pipettes इस्तेमाल किया जा नहीं करना चाहिए. चरम देखभाल दिल ही छूने से बचने और करने के लिए लिया जाना चाहिए, क्योंकि दिल के पीछे भाग बहुत नाजुक है कि क्षेत्र पूरी तरह से बचा जाना चाहिए है.
  7. वयस्क ड्रोसोफिला दिल ट्यूब और अब उजागर पिटाई चाहिए सकता है. यदि आवश्यक हो छल्ली और संलग्न दिल धीरे पेट्रोलियम जेली की छल्ली उठाने और ध्यान से इसे वापस नीचे tamping, फिर से हृदय के ऊतकों के साथ किसी भी संपर्क से बचने के द्वारा repositioned किया जा सकता है. टी मेंअपनी बात तैयारी स्नान ताजा AHL समाधान के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. यह तैयारी oxygenation के साथ 20-30 मिनट के लिए किसी भी जोड़तोड़ से पहले संतुलित करने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए. यदि तैयारी के लिए 60 मिनट से अधिक समय के लिए बनाए रखा जा रहा है यह ताजा AHL साथ perfused होना चाहिए.

Immobilizing ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए ड्रोसोफिला लार्वा

  1. Histoacryl गोंद की एक बूंद Sylgard coverslips के प्रत्येक कोने के करीब रखें. गोंद बूँदें B & B बफर के 50μl जोड़ें जो कठोर तुरन्त जाएगा. गोंद स्लाइड पर बफर रखेंगे - B & B के साथ चिपके स्पॉट के बीच स्थान भरें.
  2. एक भटक L3 लार्वा लो और 2 मिनट के लिए बर्फ पर गीले टिश्यू पेपर के एक टुकड़े पर यह जगह. यह नीचे अपने आंदोलन धीमी हो जाएगी. फिर बफर और यह पृष्ठीय पक्ष (इस लार्वा कि छोटा दांत बेल्ट अभाव की ओर है) के साथ पूरबी में लार्वा हस्तांतरण. जल्दी सिर क्षेत्र और Sylgard के बीच कुछ गोंद लागू होते हैं. गोंद कठोर बहुत जल्दी होगा और बढ़ने से लार्वा के सिर को रोकने के.
  3. संदंश का प्रयोग ध्यान से पीछे spiracles द्वारा पशु ले लो और धीरे यह खिंचाव. लार्वा के दोनों पक्षों के साथ पीछे आधा गोंद को लागू करने के द्वारा इस स्थिति में लार्वा को ठीक करें. शरीर दीवार मांसपेशियों द्वारा छल्ली के आगे आंदोलन को कम करने के लिए, जानवर के flanks अधिक गोंद जोड़ने. लार्वा अब इस स्थिति में तय हो गई है. coverslip एक छोटे पेट्री AHL या पीबीएस के साथ भरा पकवान में रखा जा सकता है है. दिल धड़कता है अब शरीर दीवार आंदोलनों से हस्तक्षेप के बिना दर्ज किया जा सकता है.

प्रतिनिधि परिणाम:

अर्द्ध बरकरार वयस्क ड्रोसोफिला दिल rhythmically घंटे के लिए विच्छेदन के बाद जब ताजा, oxygenated मुख्यालय में रखा मारेगा (पूरक डेटा देखें, Ocorr, एट अल, 2007). एक प्रतिनिधि उदाहरण 1 मूवी में दिखाया गया है. 3 Rd instar लार्वा और युवा (1 - 3 सप्ताह के बाद eclosion) मक्खियों से दिल - 3 हर्ट्ज आम तौर पर 1 के बीच एक दरों पर नियमित रूप से दिल की धड़कन एक्ज़िबिट. फिर भी, ये दिल अभी भी oxygenated AHL में घंटे के लिए अनायास हरा करने में सक्षम हैं, 3 सप्ताह आम तौर पर और अधिक अतालता से बड़े मक्खियों. वयस्क मक्खियों कि विच्छेदन की प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में क्षतिग्रस्त हो रहे हैं में दिल आमतौर पर चरम कसना के स्थानीयकृत क्षेत्रों है कि आराम करने में असमर्थ हैं दिखा. फलस्वरूप इस तरह की तैयारी के लिए क्षतिग्रस्त हो माना जाता है और त्याग, दिल की धड़कन 1 हर्ट्ज की तुलना में धीमी दर शायद ही कभी उम्र के 3 सप्ताह की तुलना में छोटी मक्खियों में मनाया जाता है.

यहाँ क्लिक करें 1 मूवी डाउनलोड - एक सप्ताह पुरानी वयस्क wildtype (W 1118 प्रयोगशाला तनाव) मक्खी उजागर पेट दिल ट्यूब दिखा (बाईं ओर पूर्वकाल). नियमित, लयबद्ध संकुचन नोट. ऊपरी दाहिने हाथ कोने में अपारदर्शी क्षेत्रों शेष पेट वसा शरीर हैं, दिल के दोनों तरफ गोल कोशिकाओं pericardial कोशिकाओं रहे हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ड्रोसोफिला मॉडल के लिए एक शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण है कि वैज्ञानिक embryological विकास से सीखने और स्मृति को लेकर सवालों की एक किस्म का पता करने के लिए इस्तेमाल किया गया है साबित हो गया है. हाल ही में इस बहुमुखी मॉडल जीव के लिए उड़ान भरने में दिल समारोह की आनुवांशिकी की जांच इस्तेमाल किया गया है. वयस्क ड्रोसोफिला में दिल फिजियोलॉजी यों के प्रयास का एक संख्या पेट छल्ली के माध्यम से बरकरार मक्खियों की गई टिप्पणियों पर भरोसा है. इन तरीकों के अधिकांश दृश्य प्रेक्षण या परिवर्तन की रिकॉर्डिंग पर प्रकाश तीव्रता ट्रांसमीटर में भरोसा है पेट के माध्यम से एक एकल पैरामीटर, हृदय की दर यों. इन विधियों कई सीमाएं हैं: आमतौर पर केवल दिल की पूर्वकाल अंत मनाया जा सकता है, मनाया जा रहा है क्या दिल संकुचन के लिए माध्यमिक वसा शरीर के आंदोलन है, और दिल के लिए तंत्रिका इनपुट बरकरार है. वयस्क अर्द्ध बरकरार तैयारी हृदय की दर के अलावा में मानकों की एक संख्या के कामकाज मात्रा का ठहराव की अनुमति दिल के एक बड़े हिस्से के एक अधिक विस्तृत दृश्य प्रदान करता है. यह electrophysiological या ऑप्टिकल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जौव लेख देखें, 1435) रिकॉर्डिंग प्रक्रियाओं. इसके अलावा, इस तैयारी histological जोड़तोड़ के लिए उपयुक्त है (जौव लेख, 1435 को देखें). यह भी पीसीआर के लिए एक अपेक्षाकृत स्वच्छ हृदय ऊतक का नमूना के रूप में निकाला जा सकता है, पश्चिमी सोख्ता, माइक्रोएरे विश्लेषण, आदि

ड्रोसोफिला में वयस्क दिल इस विच्छेदन के प्रयोजनों के लिए है, आसानी से alary मांसपेशियों के एक नेटवर्क के द्वारा पेट के पृष्ठीय छल्ली करने के लिए तय. इस प्रकार यह संभव है को दूर सिर और उदर झूठ बोल तंत्रिका कॉर्ड काटना, और तब दिल को नुकसान पहुँचाए बिना आंतरिक अंगों को निकालने के. हालांकि, चरम देखभाल के चरण 3 में लिया जा चाहिए केवल पेट की बहुत टिप में कटौती के रूप में दिल को पेट खंड 5 / 6 में फैली है और एक पेसमेकर कक्ष या कक्षों निस्संदेह इस क्षेत्र में मौजूद है.

देखभाल भी विच्छेदन के दौरान दिल को छू से बचने लिया जाना चाहिए. यदि दिल के साथ संपर्क संदिग्ध है तैयारी खारिज किया जाना चाहिए. मॉडरेट चूषण आमतौर पर दूर वसा और tracheols कि दिल ट्यूब के बेहतर दृश्य, लेकिन अत्यधिक चूषण के लिए दिल के चारों ओर कुछ भी दिल को नुकसान पहुंचा सकता suffices. चूषण बल विंदुक liposuction के लिए इस्तेमाल किया टिप के आकार के द्वारा मुख्य रूप से नियंत्रित है, लगभग 40 microns से अधिक सुझावों से परहेज किया जाना चाहिए.

वयस्क में विपरीत, ड्रोसोफिला लार्वा में दिल ट्यूब अपेक्षाकृत शरीर गुहा के चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र है. इस प्रकार एक अर्द्ध बरकरार लार्वा दिल तैयारी ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग तकनीकों के लिए कठिनाइयों प्रस्तुत करता है. आवरण के translucency कारण यह संभव है बरकरार brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग लार्वा में दिल कल्पना. गोंद तकनीक यहाँ वर्णित किसी भी विकास मंच के लार्वा immobilizes है और एक निश्चित स्थिति में दिल रहता है. यह एक अपेक्षाकृत स्थिर दिल ट्यूब की रिकॉर्डिंग परमिट. हार्ट ऐसे immobilized लार्वा द्वारा दर्ज संकुचन बाद ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग जौव 1435 में वर्णित तकनीक से विश्लेषण किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से एक अनुदान द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved) Roboz Surgical Instruments Co. RS-5611 Good for gross cuts (Step 3)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight) Roboz Surgical Instruments Co. RS-5620
Dumont #55 forceps Fine Science Tools 11295-51
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11295-10
Glass Capillaries, 100ul VWR international 53432-921
Glass Capillaries, fine Science Products GB100T8P
Pipette Puller Sutter Equipment P-97 Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing Tygon 1/16” inner diameter for 100μl capillaries
Plastic tubing Tygon 1/32” inner diameter for small capillaries
Histoacryl® tissue adhesive B. Braun Medical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
  2. Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics