Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Gen microarrays zijn krachtige tools in gen expressie profilering bij een genoom-brede niveau. Deze technologie heeft toepassing in een verscheidenheid van biologische disciplines, waaronder ontwikkelingsbiologie en toxicologie. In deze video, we detail een protocol voor de wereldwijde genexpressie analyse met behulp van een uitgebreid oligonucleotide microarray platform voor de zebravis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peterson, S. M., Freeman, J. L. Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform. J. Vis. Exp. (30), e1471, doi:10.3791/1471 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Gene microarray technologie maakt kwantitatieve meting en gen expressie profilering van transcriptie niveaus op een genoom-brede basis. Gene microarray technologie wordt gebruikt in tal van biologische disciplines in een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder de wereldwijde genexpressie analyse in relatie tot ontwikkelingsfase, een ziekte staat, en in toxische reacties. Hierin hebben we onder meer een demonstratie van de wereldwijde genexpressie analyse met behulp van een uitgebreide zebravis-specifieke oligonucleotide microarray platform. De zebravis expressie microarray platform bevat 385.000 probes, 60 baseparen lang, te ondervragen 37.157 doelen met maximaal 12 sondes per doel. Voor dit platform, was alles cDNA en genomisch informatie beschikbaar voor de zebravis verzameld uit verschillende databases waaronder genomische Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu), en ZFIN (http://www.zfin.org). Als gevolg daarvan deze expressie-array biedt volledige dekking van de huidige zebravis transcriptoom. De zebravis expressie microarray werd gedrukt door Roche NimbleGen (Madison, WI). Deze technische demonstratie omvat de tl-etikettering van een cDNA product, hybridisatie van de gelabelde cDNA product aan de microarray platform, en de reeks scannen voor signaal acquisitie het gebruik van de een kleuranalyse strategie.

Protocol

Deel 1: Fluorescerende Labeling van cDNA

De Cy3 kleurstof gebruikt in de microarray experiment is gevoelig voor foto-degradatie. De procedure moet plaatsvinden in een minimale hoeveelheid licht. De etikettering protocol werd aangepast van de BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual 1.

  1. De reagentia voor de etikettering reactie zijn opgeslagen bij -20 ° C. Van de BioPrime Array CGH Genomic Labeling System dooi 2,5 maal de Random Primer Buffer, 10x dCTP mix, en nuclease-vrij water. Ook dooi de Cy3-dCTP kleurstof. Na het ontdooien, kort centrifuge alle reagentia voor gebruik.
  2. Een afzonderlijke etikettering reactie zal moeten worden ingevuld voor elk cDNA monster worden geanalyseerd. In een 0,6 ml dikwandige buizen toe te voegen 500 ng cDNA, 40 pi 2,5 maal de Random Primer Buffer en nuclease-vrij water tot een totaal volume van 86 ul te bereiken.
  3. Meng goed en kort centrifuge. Incubeer reactie gedurende 5 minuten bij 100 ° C op een thermocycler.
  4. Onmiddellijk overdracht reactie in een ijsbad slurry gedurende 10 minuten.
  5. Aan elke buis en voeg 10 ul 10X dCTP mix, 2 ui 1 mM Cy3-dCTP en 2 pl Exo Klenow DNA-polymerase. De Exo Klenow DNA-polymerase moet worden overgelaten in de vriezer totdat het nodig is en moet altijd worden bewaard op ijs.
  6. Goed mengen reactie en kort centrifuge.
  7. Incubeer reactie bij 37 ° C gedurende 16 uur in een thermocycler.

Deel 2: Neerslag van gelabelde cDNA

  1. Alvorens verder te gaan in het protocol zet de NimbleGen Hybridisatie-systeem en laat het systeem equilibreren tot 42 ° C.
  2. Voor elke reactie, plaats een Microcon kolom in een 1,5 ml buis. Voeg 300 ul 0.1X SSC om elke kolom, gevolgd door de inhoud van de etikettering reactie (100 pl).
  3. Centrifugeer de buis met de kolom op 16.100 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  4. Gooi de stroom door, die kan lichtroze van kleur, en voeg nog eens 300 ul 0.1X SSC naar kolom.
  5. Herhaal centrifugatie bij 16.100 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  6. Gooi de stroom door en voeg een extra 300 ul 0.1X SSC naar kolom.
  7. Centrifugeer bij 16.100 xg gedurende 12 minuten bij 4 ° C.
  8. Gooi doorstromen. De doorstroming moet duidelijk zijn na deze laatste wassen en je moet in staat zijn om de roze gemerkte cDNA te zien op de kolom.
  9. Breng 100 ul nuclease-vrij water kolom. Verwijder kolom uit de 1,5 ml tube en omkeren kolom in een nieuwe 1,5 ml buis.
  10. Centrifugeer bij 2300 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C. De gelabelde cDNA moet worden gerehydrateerd in het water dat zich heeft opgehoopt op de bodem van de buis.
  11. Gebruik een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant om DNA-concentratie berekenen en kleurstof incorporatie evalueren door de berekening van de basis om verhouding kleurstof waar de nucleotide aan Cy3 verhouding is gelijk aan de A 260 / A-550 vermenigvuldigd met 23,15. De basis om kleurstof verhouding moet tussen 50 en 80.
  12. Als cDNA als voldoende bestempeld, hoeveelheid 6 ug van gelabelde cDNA in een nieuwe 1,5 ml buis.
  13. Meng in 0.1X volume van 3 M NaOAc, pH 5,2 en 1x volume isopropanol. Laat mengsel in het donker incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  14. Volgende centrifuge het monster bij 16.100 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  15. Verwijder voorzichtig het supernatans zonder verstoring van de DNA-pellet, die moet roze van kleur zijn.
  16. Voer een ethanol te wassen door het toevoegen van 500 pi 70% EtOH en meng door voorzichtig omkeren.
  17. Centrifugeer monster op 16.100 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  18. Verwijder de bovenstaande vloeistof, omkeren van de buis, en laat de pellet drogen gedurende 5 minuten. Bij deze stap de pellet kan worden opgeslagen bij -20 ° C indien gewenst of het protocol kan worden voortgezet tot de hybridisatie stap.

Deel 3: hybridisatie

De hybridisatie procedure is aangepast van Guide de Roche NimbleGen Arrays gebruikershandleiding voor de analyse van genexpressie 2.

  1. Los de pellet in 5 pi van nuclease-vrij water.
  2. Zodra het pellet opgelost is toe te voegen hybridisatie componenten vermeld in tabel 1. Hybridisatie componenten zijn afkomstig uit de Roche NimbleGen Hybridization Kit. Nadat alle onderdelen zijn toegevoegd het totale volume moet nu in totaal 18 pl. Meng goed en kort draaien de buis om de inhoud te verzamelen op de bodem.
  3. De volgende stap is om de gelabelde cDNA denatureren door het op een warmte-blok bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
  4. Onmiddellijk overdracht van de buis naar de NimbleGen Hybridisatie System, terwijl de arrays worden bereid in de volgende stappen.
  5. Microarrays moet altijd zorgvuldig worden behandeld en bewaard volgens de instructies van de fabrikant. Roche NimbleGen raadt het opslaan van hun expressie arrays in het donker met droogmiddel bij kamertemperatuur.
  6. Laad de array naar de Precision Mixer Alignment Tool (PMAT) voorzien in de NimbleGen reeks verwerking accessoires.
  7. <li> Plaats een X1 mixer op de PMAT en verwijder de zelfklevende strip met een tang. Sluit de PMAT. Druk op de mixer door het gat in de PMAT en langzaam open, zodat de array en mixer los te maken van de PMAT.
  8. Stevig druk uitoefenen met de Brayer rond de buitenkant van de mixer om de afdichting ervoor te zorgen dat de array is voltooid en eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats de array-mixer complex op het hybridisatie-systeem op te warmen.
  9. Met behulp van een verplaatsing pipet, voeg langzaam 15 ul van de gelabelde monster in de vulpoort. Dit is het gat in het midden van de mixer. Van toepassing zijn langzame en gestage druk om de pipet, zodat het monster gelijkmatig verspreidt zich door de mixer zonder luchtbellen. Veeg de overtollige monster uit de haven gaten en afdichting patrijspoorten met plakstrips.
  10. Sluit de vergrendeling en start het mengen van de hybridisatie-oplossing met behulp van het programma B op de NimbleGen Hybridization System. Laat microarrays te hybridiseren voor 16-20 uur.

Deel 4: Post-hybridisatie wast en Scannen van Microarray

Het wassen en het scannen procedure is een bewerking van de Guide Roche NimbleGen Arrays gebruikershandleiding voor de analyse van genexpressie 2.

  1. Zodra hybridisatie is bijna afgerond bereiden wassen buffers zoals aangegeven in tabel 2. Pre-Wash Buffer warme IA tot 42 ° C in een waterbad.
  2. Zet GenePix 4000B serie scanner en laat de scanner op te warmen voor ongeveer 15 minuten voor gebruik.
  3. Giet de voorverwarmde Wash Buffer IA in een schaal.
  4. Verwijder de array-mixer complex van de NimbleGen Hybridisatie systeem en schuif in de mal (meegeleverd in de NimbleGen reeks verwerking accessoires). Dompel de montage in de voorverwarmde Wash Buffer IA en zorgvuldig mixer verwijderen door afpellen van dia.
  5. Verwijder de array van jig en schud gedurende 15 seconden in Wash Buffer IA.
  6. Snel de array naar een dia rek in de kamer temperatuur Wash Buffer IB. Krachtig bewegen de schuif rek voor 2 minuten.
  7. Breng de schuif rek in Wash Buffer II en schud gedurende 1 minuut.
  8. Breng de schuif rek in de Wash Buffer III en schud gedurende 15 seconden.
  9. Breng de array naar de glijbaan droog centrifuge en spin gedurende 2 minuten om alle vocht te verwijderen. Ga verder met scannen.
  10. Het wordt aanbevolen om de array onmiddellijk scan, omdat de kleurstof is gevoelig voor licht en ozon.
  11. Down loaden van de array, barcode, in de GenePix 4000B serie scanner.
  12. Open de GenePix Pro software en ga verder met het scannen van de array. De Roche NimbleGen gen-expressie-arrays gebruik maken van een een kleur hybridisatie strategie. Als gevolg hiervan slechts een golflengte nodig is voor het scannen. Scan Cy3 fluorescentie-signaal met behulp van de 532 nm laser. Open de hardware-instellingen dialoogvenster en stel PMT de waarde van de 532 nm laser op een waarde van 500.
  13. In de hardware-instellingen dialoogvenster ingesteld vermogen op 100%, pixelgrootte tot 5 micron, lijnen om gemiddeld tot een, en focus positie 0 micron.
  14. Voer een voorbeeldscan en stel scangebied.
  15. Uit te voeren scan.
  16. Zodra het scannen is voltooid controleert het beeld histogram. Idealiter 1e-5 genormaliseerde telt moet op 65.000 verzadiging grens betekent dat ~ 1-2% van de functies zijn verzadigd. Als de genormaliseerde telt minder dan 1e-5, verhogen de PMT te krijgen en opnieuw scannen van de dia. Als de genormaliseerde telt groter zijn dan de 1e-5, verminderen de PMT te krijgen en opnieuw scannen van de dia.
  17. Zodra het scannen is voltooid de afbeelding opslaan. Het wordt aanbevolen om een ​​standaard naamgeving voor afbeeldingen kiezen voor het gemak in de referentie. Het beeld kan nu worden geladen in de data-analyse programma van de voorkeur voor data normalisatie en het berekenen van de intensiteit waarden.

Representatieve resultaten

U kunt eerst beginnen om de efficiëntie van de Cy3 fluorescentie labeling reactie van de cDNA beoordelen wanneer het begin van het wassen met 0.1X SSC. Tijdens elke volgende wasbeurt de stroom door moet minder roze van kleur met de laatste doorstromen duidelijk. Bovendien moet de Cy3-gelabeld cDNA product zichtbaar zijn op de kolom tijdens deze wasstappen. Als de stroom door is fel roze van kleur of er is geen roze product op de kolom, dit is een goede indicatie dat de etikettering reactie niet correct verlopen. De etikettering reactie kan worden beoordeeld kwantitatief met behulp van de NanoDrop ND-1000 spectrofotometer om de concentratie van de gelabelde DNA en de basis te verven ratio (figuur 1) te bepalen. De etikettering reactie geeft regelmatig ten minste 10 ug van gelabelde DNA in ons laboratorium. Kleurstof opname kan worden berekend met behulp van een eenvoudige basis / dye-verhouding waarbij de nucleotide aan Cy3 verhouding is gelijk aan de A 260 / A-550 vermenigvuldigd met 23,15. Waarden tussen 50 tot 80 geven voldoende kleurstof opnemen in de etikettering reactie. Indien de etikettering reactie geeft een lage concentratie van DNA of een slechte opname kleurstof, hybridisatie van het monster op de microarray wordt niet aanbevolen en etikettering reactie dient te worden herhaald.

Beoordeling van de kwaliteit van de hybridisatie kan worden uitgevoerd door het evalueren van het beeld histogram en de gescande afbeelding van de microarray (figuur 2). Acceptabele hybridisaties hebben 1-2% van verzadigd functies (dat wil zeggen, waardoor 1e-5 genormaliseerd telt bij de 65.000 verzadiging limiet) met de PMT-waarde in de buurt van 500. Als de PMT waarde moet drastisch worden aangepast van 500 naar 1e-5 genormaliseerd telt bereiken aan het 65.000 verzadiging te beperken, geeft dit aan het algemeen slechte hybridisatie van de gelabelde cDNA aan de microarray. Kwaliteit van de gegevens zal bestaan ​​indien deze gegevens wordt voortgezet door middel van latere analyse. Hybridisatie kwaliteit kan ook kwalitatief worden beoordeeld door het bekijken van beelden van de gescande array (figuur 3). De Roche NimbleGen Hybridisatie Kit bevat een afstemming oligo mengsel van Cy3-en Cy5-gelabelde 48mer oligonucleotiden die hybridiseren aan afstemming functies op de arrays. Kwalitatieve beoordeling van de intensiteit van de afstemming oligo's naar andere functies op de array maakt een kwaliteitscontrole van de hybridisatie efficiëntie van de fluorescent gelabelde cDNA op de array. Na verdere analyse kan een scatterplot van uw geanalyseerde gegevens worden gebruikt om de relatieve niveaus van genexpressie te bepalen en om genen die differentieel uitgedrukt tussen de monsters (figuur 4) te identificeren.

Thumbnail van Figuur 1
Figuur 1. Een NanoDrop spectrum van cDNA gemerkt met Cy3. Gemerkte cDNA opbrengst en kleurstof opname kan worden beoordeeld met behulp van een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.

Thumbnail van Figuur 1
Figuur 2. Een GenePix histogram voor microarray-scan. Kwaliteit van de hybridisatie kan worden beoordeeld door de evaluatie van het beeld histogram. Acceptabele hybridisaties hebben 1-2% van de functies verzadigd met 1e-5 genormaliseerd telt bij de 65.000 verzadiging grens met de PMT-waarde in de buurt van 500. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.

Figuur 3
Figuur 3. Een gescande afbeelding microarray. Hybridisatie kwaliteit kan worden beoordeeld door het bekijken van de gescande afbeelding van de microarray. Het beeld moet worden onderzocht op de aanwezigheid van stof of andere storende factoren te verbieden visualisatie van elke functie en dus het voorkomen van nauwkeurige berekening van de fluorescentie-intensiteit van de functie. De intensiteit van de uitlijning oligos kan worden vergeleken met de andere functies op de array hybridisatie efficiëntie te beoordelen.

Figuur 4
Figuur 4. Een spreidingsdiagram van een geanalyseerd microarray experiment. Het doel van deze procedure is het identificeren van genen die differentieel uitgedrukt in uw monsters. Microarray data kan verder worden geanalyseerd en bekeken in een scatterplot van genen die differentieel uitgedrukt te visualiseren.

Tabel 1. Componenten van Roche NimbleGen Hybridisatie Kit toe te voegen voor hybridisatie stap 2.

Bestanddeel Volume
Monster (opgelost in water) 5 pl
2X hybridisatiebuffer 9 pl
Hyb A 3,6 pl
Alignment Oligo 0,4 pl
Totale volume 18 pl

Tabel 2. Wash buffers te worden voorbereid voor het wassen van arrays na hybridisatie.

Bestanddeel Wasbuffer IA * Wash Buffer IB Wash Buffer II Wash Buffer III
Water 225 ml 225 ml 225 ml 225 ml
10X Wash Buffer I, II of III 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml
1 M DTT 25 pi 25 pi 25 pi 25 pi
Totale volume 250 ml 250 ml 250 ml 250 ml

* Pre-warm tot 42 ° C

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Veel microarray-protocollen, inclusief de hier beschreven, gebruik fluorescente kleurstoffen als een middel van het meten en kwantificeren van hybridisatie. De Cy3 fluorescente kleurstof is gevoelig voor foto-en ozon degradatie. Het wordt aanbevolen dat de procedure worden gevoerd in een minimale belichting. Bovendien kunnen kleine stofdeeltjes interfereren met hybridisatie en scannen. Bijzondere aandacht moet worden besteed om er zeker van het werkgebied is schoon en vrij van stof.

Er zijn veel alternatieven voor de etikettering protocol beschreven in deze procedure. Het wordt aanbevolen om de verschillende etiketterings-protocollen worden getest om de optimale etikettering procedure te bepalen voor elke specifieke expressie microarray platform. De procedure aangetoond hier is geoptimaliseerd voor deze specifieke expressie-array platform gedrukt door Roche NimbleGen. Daarnaast hebben we gevonden op het etiket protocol gedetailleerd in de Handleiding voor Roche NimbleGen Array gebruiker bij net zo goed te werken. Voorzichtigheid is geboden indien de toepassing van dit protocol om andere expressie-array platformen, in het bijzonder van andere fabrikanten, zoals hybridisatie eigenschappen zijn grotendeels beheerst door de druktechnieken van het platform.

Koppeling deze uitdrukking reeks protocol om onze RNA isolatie en cDNA-synthese-protocol routinematig levert reproduceerbare hoge kwaliteit genexpressie array data in ons laboratorium. Dit is een belangrijk doel voor alle expressie array-analyses in dat de uiteindelijke kwaliteit van de gegevens is uiteindelijk afhankelijk van de kwaliteit van deze eerste stappen. Minder dan optimale resultaten op een van deze stappen die leiden tot de uiteindelijke expressie array analyse zal belemmering vormen voor de kwaliteit van de definitieve gegevens.

De procedures die in deze video van fluorescerende etiket van de cDNA om aan te geven acquisitie is een standaard procedure voor expressie array analyse onafhankelijk van de experimentele vraag. De richting waarin om door te gaan voor de analyse van de expressie array data onderstaande afbeelding acquisitie is grotendeels afhankelijk van elke specifieke experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Array Microcentrifuge Dryer ISC Bioexpress C-1303-T
BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Invitrogen 18095-011
Cyanine 3-dCTP PerkinElmer, Inc. NEL576
GenePix 4000B Molecular Devices GENEPIX 4000B
Microcon YM-30 EMD Millipore 42411
NimbleGen Array Processing Accessories Roche Group 5223539001
NimbleGen Hybridization Kit Roche Group 5223474001
NimbleGen Hybridization System 4 Roche Group 5223652001
NimbleGen Wash Buffer Kit Roche Group 5223504001
X1 Mixers Roche Group 5223725001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. Version C. (2004).
  2. Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. Version 3 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics