Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform

Summary

Gen microarrays zijn krachtige tools in gen expressie profilering bij een genoom-brede niveau. Deze technologie heeft toepassing in een verscheidenheid van biologische disciplines, waaronder ontwikkelingsbiologie en toxicologie. In deze video, we detail een protocol voor de wereldwijde genexpressie analyse met behulp van een uitgebreid oligonucleotide microarray platform voor de zebravis.

Abstract

Gene microarray technologie maakt kwantitatieve meting en gen expressie profilering van transcriptie niveaus op een genoom-brede basis. Gene microarray technologie wordt gebruikt in tal van biologische disciplines in een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder de wereldwijde genexpressie analyse in relatie tot ontwikkelingsfase, een ziekte staat, en in toxische reacties. Hierin hebben we onder meer een demonstratie van de wereldwijde genexpressie analyse met behulp van een uitgebreide zebravis-specifieke oligonucleotide microarray platform. De zebravis expressie microarray platform bevat 385.000 probes, 60 baseparen lang, te ondervragen 37.157 doelen met maximaal 12 sondes per doel. Voor dit platform, was alles cDNA en genomisch informatie beschikbaar voor de zebravis verzameld uit verschillende databases waaronder genomische Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu), en ZFIN (http://www.zfin.org). Als gevolg daarvan deze expressie-array biedt volledige dekking van de huidige zebravis transcriptoom. De zebravis expressie microarray werd gedrukt door Roche NimbleGen (Madison, WI). Deze technische demonstratie omvat de tl-etikettering van een cDNA product, hybridisatie van de gelabelde cDNA product aan de microarray platform, en de reeks scannen voor signaal acquisitie het gebruik van de een kleuranalyse strategie.

Protocol

Deel 1: Fluorescerende Labeling van cDNA De Cy3 kleurstof gebruikt in de microarray experiment is gevoelig voor foto-degradatie. De procedure moet plaatsvinden in een minimale hoeveelheid licht. De etikettering protocol werd aangepast van de BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual 1. De reagentia voor de etikettering reactie zijn opgeslagen bij -20 ° C. Van de BioPrime Array CGH Genomic Labeling System dooi 2,5 maal de Random Primer Buffer, 10x dCTP mix, en n…

Discussion

Veel microarray-protocollen, inclusief de hier beschreven, gebruik fluorescente kleurstoffen als een middel van het meten en kwantificeren van hybridisatie. De Cy3 fluorescente kleurstof is gevoelig voor foto-en ozon degradatie. Het wordt aanbevolen dat de procedure worden gevoerd in een minimale belichting. Bovendien kunnen kleine stofdeeltjes interfereren met hybridisatie en scannen. Bijzondere aandacht moet worden besteed om er zeker van het werkgebied is schoon en vrij van stof.

Er zijn …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Array Microcentrifuge Dryer		ISC Bioexpress	C-1303-T
BioPrime Array CGH Genomic Labeling System		Invitrogen	18095-011
Cyanine 3-dCTP		PerkinElmer	NEL576
GenePix 4000B		Molecular Devices	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30		Millipore	42411
NimbleGen Array Processing Accessories		Roche NimbleGen	5223539001
NimbleGen Hybridization Kit		Roche NimbleGen	5223474001
NimbleGen Hybridization System 4		Roche NimbleGen	5223652001
NimbleGen Wash Buffer Kit		Roche NimbleGen	5223504001
X1 Mixers		Roche NimbleGen	5223725001