יישום הופסק זרימה שיטות קינטיקס לחקור את מנגנון הפעולה של חלבון תיקון DNA

Published 3/31/2010
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Msh2-MSH6 אחראית ליזום תיקון של טעויות שכפול ה-DNA. כאן אנו מציגים גישה קינטיקה חולף לקראת הבנה איך זה עובד חלבון קריטי. הדו"ח ממחיש הפסיקה זרימת ניסויים למדידת מחייב DNA מצמידים ו קינטיקה ATPase הבסיסית Msh2-MSH6 מנגנון הפעולה של תיקון דנ"א.

Cite this Article

Copy Citation

Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. J. Vis. Exp. (37), e1874, doi:10.3791/1874 (2010).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ניתוח חלוף הקינטית היא הכרחית להבנת פעולתו של מקרומולקולות ביולוגיות, שכן גישה זו מניבה מידע מכניסטית כולל ריכוזי אתר פעיל וקבועים שיעור מהותי השולטים פונקציה macromolecular. במקרה של אנזימים, למשל, מדידות מצב חולף או קבוע מראש לזהות ולאפיין אירועים בודדים במסלול התגובה, ואילו מדידות מצב יציב רק תשואה יעילות קטליטית סגוליות הכוללת. אירועים בודדים כגון חלבונים או חלבונים אינטראקציות ליגנד וקצב הגבלת שינויי קונפורמציה לעתים קרובות להתרחש זמנים אלפית השנייה, וניתן למדוד ישירות על ידי זרימה עצר כימי להרוות שיטות הזרימה. בהינתן האות האופטי כגון פלואורסצנטי, הפסיקה זרימת משמש ככלי רב עוצמה ונגיש להתקדמות ניטור התגובה מן המצע מחייב לשחרר את המוצר 1,2 מחזור קטליטי.

כאן אנו מדווחים יישום הפסיקה זרימת קינטיקה לחקור את מנגנון הפעולה של Msh2-MSH6, דנ"א אוקריוטים לתקן החלבון מזהה בסיס חוסר התאמה זוג והחדרת / מחיקה לולאות ב-DNA אותות אי התאמה לתקן (MMR) 3-5. בעשותו כן, Msh2-MSH6 מגדילה את הדיוק של שכפול ה-DNA על ידי שלושה סדרי גודל (תדר שגיאה יורדת מ ~ 10 -6 to10 -9 בסיסים), ובכך מסייע לשמור על שלמות הגנומי. באופן לא מפתיע, תפקוד לקוי האדם Msh2-MSH6 קשורה לסרטן שאינן polyposis תורשתית המעי הגס וסוגי סרטן אחרים סדיר 6-8. כדי להבין את מנגנון הפעולה של חלבון ה-DNA הזה קריטי מטבולית, אנו לחקור את הדינמיקה של האינטראקציה Msh2-MSH6 עם דנ"א תואמים, כמו גם את פעילות ATPase כי דלקים פעולותיה MMR. ה-DNA מחייבת נמדדת במהירות ערבוב Msh2-MSH6 עם ה-DNA המכיל 2-aminopurine (2-AP) fluorophore הסמוכים G: T התאמה וניטור הגידול וכתוצאה מכך הקרינה 2-aminopurine בזמן אמת. ה-DNA דיסוציאציה נמדדת על ידי ערבוב מראש יצרו Msh2-MSH6 G: T (2-AP) מורכב התאמה עם DNA מלכודת ללא תווית וירידה ניטור הקרינה במשך הזמן 9. טרום יציב ATPase קינטיקה המדינה נמדדים על פי השינוי פלואורסצנציה של 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl) אתיל) אמינו) קרבוניל) coumarin) שכותרתו חלבון פוספט הכבילה (MDCC-PBP) על פוספט מחייב ( Pi) שפורסמו על ידי Msh2-MSH6 הבאים הידרוליזה ATP 9,10.

מהנתונים עולה מחייב המהירה של Msh2-MSH6 ל-G: התאמה T היווצרות של חיים ארוכים Msh2 MSH6-G: T מורכבות, שבתורה גוררת בדיכוי הידרוליזה של ATP וייצוב של החלבון בצורת ATP הנכנס . קינטיקה התגובה לספק תמיכה ברורה ההשערה כי ה-ATP, מחויב Msh2-MSH6 אותות תיקון DNA על הכריכה זוג בסיס תואמים בתוך הסליל הכפול.

פ 'נח בירו ו Jie Zhai תרמו במאמר זה שווה.

Protocol

א מדידה של קינטיקס עקידת Msh2 MSH6-DNA

1. לדוגמה לקראת הניסוי Msh2-DNA MSH6 קינטיקה מחייב

הכנה של ריאגנטים לניסוי הקרינה מבוסס DNA הקינטית מחייב זרימה עצרו דומה לניסוי שיווי משקל על fluorometer. אכן מחייב ניתוח שיווי משקל יש לבצע תחילה להעריך את קבוע דיסוציאציה (K D) לאינטראקציה על מנת לייעל את התנאים התגובה לניתוח קינטית. הפסיקה זרימת ניסויים דורשים כמויות גדולות יותר של חומרים ביולוגיים לעומת ניסויים שיווי משקל או מצב יציב, ולכן הגישה אינו ריאלי ביותר כאשר מיליגרם כמויות נמוכות של חלבון זמינים 11,12 ו כמויות דומות של ligands ניתן להכין או לרכוש.

  1. אנחנו מעל להביע ס cerevisiae Msh2-MSH6 ב E. coli וכמויות מיליגרם לטהר של החלבון על ידי חילופי יונים בעזרת כרומטוגרפיה (איור 1) 11.
  2. ריאגנטים DNA עם או בלי fluorophore 2-Aminopurine יכול להיות מסונתז כימית. אנו לרכוש 37 נוקלאוטיד יחיד תקועים אורך DNAs שונה עם Aminopurine-2 ו לחשל שני גדילי דנ"א משלימים להכין דופלקס עם Aminopurine-2 הסמוכה G: התאמה T (איור 2). הדנ"א יכול להיות מטוהרים על ידי היצרן או במעבדה על ידי denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide; האחרון בדרך כלל נותן תשואה גבוהה יותר.
  3. עבור קינטיקה הדנ"א מחייב, להכין G נפרדים: T (2-AP) DNA ו-Msh2 MSH6 דגימות חלבון במאגר ה-DNA מחייבת (20 mM טריס-HCl, pH 8.0, 5 מ"מ MgCl 2, 100 mM NaCl). Msh2-MSH6 ריכוזי DNA הם 0.8 מיקרומטר ו 0.12 מיקרומטר, בהתאמה, אשר מניב 0.4 מיקרומטר ו 0.06 ריכוזי הסופי מיקרומטר בניסוי ערבוב אחד עם יחס 1:01 ערבוב. עבור ה-DNA דיסוציאציה קינטיקה, להכין דגימה אחת המכילה 0.8 מיקרומטר Msh2-MSH6 ו 0.12 מיקרומטר G: T (2-AP) DNA, ועוד מדגם עם 8 מיקרומטר ללא תווית G: T-DNA כמו מלכודת בחינם Msh2-MSH6. הכן ולאחסן את דגימות על הקרח. בשנת התגובות האלה, ריכוז החלבון הוא הרבה מעל 10 ננומטר K D לאינטראקציה Msh2-MSH6-DNA ו-DNA ריכוז מספיק עבור אות הקרינה החזקה (נקבע באופן אמפירי). נפח של μl 400 לפי המדגם מספיק כדי להשיג כ -10 עקבות קינטית (טבלה 1).
  4. השתמש כימיקלים באיכות גבוהה כי הם ללא זיהומים ניאון החלבון, DNA, וההכנות חיץ. סנן את כל מאגרי דרך הממברנה 0.2 מיקרומטר כדי למנוע סתימת עצר זרימה עם חלקיקים.
  5. אם fluorophore סופג האור הנראה, הכנה הניסוי חייב להתבצע בתנאים באור נמוך.

2. כלי כהכנה Msh2 MSH6-DNA מחייבת קינטיקה

המכשיר הפסיק זרימה היא די פשוטה בעיקרון. היא משתמשת מנוע לנסוע במהירות לדחוף שני פתרונות ב מזרקים הכונן לתוך מכשיר ערבוב, הפתרון מעורב אז זורם לתוך התא תצפית לצורך איסוף נתונים (איור 3). אנו משתמשים KinTek עצר זרימה, הדורש נפח דגימה נמוכים, מאפשרת זיהוי יחיד או ערבוב רציף של המגיבים, של מגוון רחב של אותות אופטיים, והיא קלה מאוד לשימוש. הפסיקה זרימת מכשירים זמינים מיצרנים אחרים גם כן.

  1. על מנת להכין את המכשיר הפסיק זרימה לניסויים, לוודא את המחשב בקר כבויים. הפעל באמבט מים במחזור מוגדר טמפרטורת הסביבה (25 מעלות; C) כדי לקרר את המנורה. להצית את המנורה. הגדר את monochromator הגל עירור הרצוי (315 ננומטר במקרה של Aminopurine-2). לסובב את הגלגל חריץ לרוחב החריץ הרצוי (אמפירית fluorophore גבוה האיזון עירור עם photobleaching נמוך). הפעל את הבקר ואת המחשב. הפעל באמבט מים במחזור למלא את הז'קט מים אשר שומרת על המגיבים בטמפרטורה הרצויה במהלך הניסוי (30 ° C במקרה של cerevisiae ס Msh2-MSH6).
  2. לאחר מכן, לבצע את תוכנית הפסיקה זרימה. הפעל את הגלאי של בחירה, אשר במקרה זה הוא צינור מכפיל (PMT) עם מסנן התערבות מתאימה fluorophore (350 ננומטר חתוכים מסנן במקרה של Aminopurine-2). החל מתח PMT. למדוד את הזרם האפל לתקן כל רעש רקע חשמליים.
  3. הפסיקה זרימת מזרקים הכונן הנייד תצפית יש לשטוף לפני העמסת דגימות. הגדר את טעינת Sample Valve לעמדת הטעינה. ממלאים מזרק עם 1ml מים, deionized מסונן, לצרף אותו אל נמל הטעינה הנמצא מתחת המזרק הכונן, ידני לדחוף מים בין שני מזרקים כמה פעמים. חזור על התהליך פעמיים מזרק כל כונן לשמש בניסוי. בשלב הבא, למלא את הכונן מזרקים עם מים לשטוף את התא תצפית. החלף את שסתום טוען לדוגמא לתפקיד אש. השתמש כונן מזרק התאםהפקודה, אשר שולטת על מנוע כונן, ולהפחית את צלחת כונן לדחוף מים דרך התא תצפית אל קו היציאה. הקפד לא לדחוף את הבוכנה עד הסוף של מזרק את הכונן. הרם את לוח הכונן. החלף את השסתום למצב עומס. ידנית לשטוף את המזרקים עם חיץ התגובה ולהשאיר ריק. המכשיר עכשיו הוא מוכן לשימוש.

3. Msh2-DNA MSH6 הניסוי מחייב ניתוח נתונים

  1. העברת כל מדגם מהצינור אל מזרק 1 מ"ל טרי. צרף כל מזרק מדגם ליציאת העמסה לדחוף את הפתרון לתוך מזרק את הכונן. תשמרי על עצמך כדי להסיר את כל בועות האוויר באופן ידני על ידי דוחפים את הפתרון בין שני מזרקים כמה פעמים לסירוגין עם הפסקות. מנמיכים את הצלחת לנהוג עד הקשר העליון של מזרקים הכונן. בואו המגיבים לאזן את טמפרטורת הסביבה במשך כמה דקות.
  2. עבור איסוף נתונים, פתח את הזמן הגדר / חלון ערוצים, בחר ערוץ איסוף נתונים (PMT), מצב של ניתוח נתונים (פלואורסצנטי), ומספר עקבות (Shots) להיות שנאספו. הזן את השעה איסוף מידע שבמהלכו 1000 נקודות הנתונים ייאספו. התגובה לא ידוע צריך להיות במעקב במשך מספר שניות על מנת לזהות כל שלבי איטי. אמפירית להעריך את הזמן הנדרש כדי להגיע לשיווי משקל או מצב יציב ונתונים להגדיר אוסף הזמן ≥ 6 מחצית חיים. במקרה של Msh2-MSH6 את מסגרת הזמן האופטימלי הוא 2 שניות G: קינטיקה T התאמה מחייב 60 שניות G: T דיסוציאציה קינטיקה. עכשיו להגדיר את שסתום לתפקיד אש ולחץ על כפתור לאסוף נתונים. פעולה זו יוזמת ערבוב של כניסה Msh2-MSH6 ו-DNA, התגובה לתוך התא תצפית, עירור של fluorophore 2-Aminopurine ואת אוסף של האות הקרינה לאורך זמן. אסוף לפחות 5 עקבות הקינטית כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה לשמור את הקובץ.
  3. כאשר הניסוי הושלם, תורו של המנורה. שטפו את מזרקים תא תצפית עם מים כפי שתואר לעיל. לאחר מכן, כבה את שאר הציוד, למעט באמבט מים במחזור. המים שהופץ במשך 15 דקות נוספות כדי לקרר את המנורה.
  4. פעולות מתמטיות והתאמת הנתונים ניתן לבצע עם התוכנה KinTek עצמו, כדי לקבל תחושה של קינטיקה התגובה במהלך הניסוי. ניתוח נוסף יכול גם להתבצע על ידי חישוב ממוצע עקבות הקינטית מרובות ושמירה ויצוא את הקובץ ממוצע תוכנת ניתוח / גרפים ונתונים אחרים.

4. תוצאות עבור נציג קינטיקה מחייב Msh2-DNA MSH6

נתונים קינטי עבור Msh2-MSH6 אינטראקציות עם G: T-DNA mismatch, ניתן להתאים לפונקציה מעריכית יחיד תשואה k מהיר קצב מחייב קבוע על קרוב ל 3 x 10 7 M-1second-1 (איור 4 א) ו איטי דיסוציאציה k קבוע OFF של 0.012 -1 השני (איור 4 ב), אשר מגלה כי Msh2-MSH6 נקשר G: התאמה T במהירות ויוצר קומפלקס יציב מאוד עם החיים וחצי קרוב ל 60 שניות 13.

ב מדידה של Msh2-MSH6 ATPase קינטיקס

1. לדוגמה לקראת הניסוי Msh2-MSH6 קינטיקה ATPase

  1. הכן Msh2-MSH6 ו ריאגנטים DNA כמתואר לעיל, באמצעות ה-DNA ללא תווית. בנוסף, לטהר חלבון פוספט הכבילה (PBP) מ - א ' coli ו תווית עם fluorophore MDCC (איור 5) 14,15. MDCC-PBP נקשר פוספט חופשי במהירות (k ON שווה 1 x 10 8 מ -1 -1 second), עם זיקה גבוהה (K D = 100 ננומטר), וכתוצאה מכך עלייה דרמטית MDCC פלואורסצנטי (איור 6). MDCC-PBP ולכן כתב החזקה של הידרוליזה טרום מדינה יציבה ATP ושחרור פוספט קינטיקה 14,15. שים לב כי זה הכרחי כדי למזער פוספט רקע רמות assay זה, ולכן, השימוש בזכוכית יש להימנע לחלוטין בכל שלבי הכנת מגיב.
  2. הכן מדגם עם 4 מיקרומטר Msh2-MSH6 חלבון עם או בלי 6 מיקרומטר G: T-DNA, אשר מניב 2 מיקרומטר ו 3 מיקרומטר ריכוזי הסופי בניסוי ערבוב אחד עם יחס 1:01 ערבוב. שים לב מראש יציב ניסויים המדינה דורשת ריכוז האנזים גבוה מאז את האות של עניין היא מן מחזור אחד או כמה איבודים first קטליטי. הכן אחר מדגם המכיל 1 mM מומס טרי ATP ו - 20 לכתב מיקרומטר MDCC-PBP. הוסף 0.10 יחידות / מ"ל ​​של purine nucleoside phosphorylase ו 200 מיקרומטר 7-methylguanosine על דגימות, המשמש לנגב כל פוספט מזהם. דגירה על דגימות קרח למשך 20 דקות לפחות (טבלה 2).

2. כלי כהכנה Msh2-MSH6 ATPase קינטיקה

  1. הכן את מכשיר עצר זרימה לניסויים כמתואר לעיל. בנוסף, לנגב זיהום פוספט מן מזרקים עם כונן 0.5 יחידות / מ"ל ​​purine נוcleoside phosphorylase ו 200 מיקרומטר 7-methylguanosine במשך 20 דקות. קבע את אורך הגל עירור על 425 ננומטר ושימוש ננומטר 450 חתוכים מסנן עם PMT לגילוי הקרינה MDCC-PBP.

3. הניסוי Msh2-MSH6 ATPase ונתונים ניתוח

  1. טען את מזרקים כונן עם דגימות כפי שתואר קודם לכן. לחץ על איסוף נתונים לערבב Msh2-MSH6 עם ה-ATP ו-PBP MDCC ולשחרר לפקח פוספט על ידי Msh2-MSH6 והגידול מצמידים MDCC ב-PBP הקרינה לאורך זמן. אסוף לפחות 5 עקבות הקינטית כדי לקבל ערכת נתונים באיכות גבוהה לשמור את הקובץ. ממוצע עקבות הקינטית מרובים לייצא את הקובץ נתונים לצורך ניתוח.
  2. הכן עקומת הכיול כדי לקבוע את הקשר הליניארי בין ריכוז פוספט MDCC-PBP פלואורסצנטי. כדי לעשות זאת, לערבב MDCC-PBP עם ריכוזי פוספט שונים תחת תנאי הניסוי אותו עצר את זרימת, ומקסימום למדוד MDCC-PBP הקרינה בריכוז כל פוספט.
  3. מגרש את הקרינה המרבית MDCC-PBP לעומת ריכוז פוספט עבור כל עקומת הכיול (איור 7) ולהשתמש מדרון לקבל ריכוז פוספט ב-Msh2 MSH6 תגובות. פוספט מגרש ריכוז לעומת הזמן להתאים את הנתונים לתפקד מעריכי וליניארי. פונקציה זו מתארת ​​פרץ של הידרוליזה טרום מדינה יציבה ATP ושחרור פוספט ואחריו שלב המדינה ליניארי הקבוע של התגובה.

4. תוצאות עבור נציג Msh2-MSH6 ATPase קינטיקה

הנתונים מראים כי הקינטית Msh2-MSH6 hydrolyzes ATP ו - פוספט משחרר במהירות 1.4 ב -1 השני מחזור קטליטי הראשון. שלב זה מלווה בצעד איטי בתגובה כי גבולות איבודים לאחר 7 פי איטי חתול k יציב מצב 0.2 -1 השני (איור 8 א). עם זאת, כאשר Msh2-MSH6 קשור ל-DNA תואמים, פרץ הידרוליזה של ATP ושחרור פוספט מדוכאת, ואת Msh2-MSH6 נשאר במצב ATP-כבול למשך זמן ארוך יותר.

איור 1
באיור 1. טיהור ס cerevisiae Msh2-MSH6 מ E. coli. Msh2 ו MSH6 הגנים היו משובטים לתוך pET11a וקטור ביטוי יתר של E. coli BL21 (DE3) תאים. הקומפלקס חלבון היה מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה על עמודה SP-sepharose, הפרין, ו-Q-sepharose שרפים. SDS-PAGE ניתוח שמוצג כאן כולל שברים חלבון מעמודת Q-sepharose.

איור 2
. משלימה איור 2 יחיד תקועים DNAs הם annealed להקים דופלקס המכיל G: התאמה T עם אדנוזין סמוכים (ניסויים ATPase) או 2-Aminopurine אנלוגי בסיס הניאון של אדנוזין (ניסויים הדנ"א מחייב).

איור 3
איור 3. זרימה של המגיבים ב-KinTek הפסיק לזרום במהלך הניסוי ערבוב אחד.

איור 4 א
איור 4 א קינטיקה של אינטראקציה Msh2-MSH6 עם G:. התאמה טי. ערבוב של ה-DNA דופלקס (0.12 מיקרומטר) המכיל G: T הסמוך Aminopurine-2 עם Msh2-MSH6 (0.8 מיקרומטר) מוביל עלייה הקרינה לאורך זמן, מניב k שיעור bimolecular קבוע על 2.4 10 = 7 M -1 s -1 עבור האינטראקציה.

תרשים 4 ב
איור 4 ב קינטיקה של אינטראקציה Msh2-MSH6 עם G:. התאמה טי. ערבוב מראש יצרו Msh2 MSH6-G: T (2-AP) מורכב עם G ללא תווית עודף: T-DNA (8 מיקרומטר) כי כל מלכודות חינם Msh2-MSH6 מוביל לירידה הקרינה לאורך זמן, מניב קצב איטי ניתוק תמידי, k OFF = 0.012 s -1, מה שמצביע על מורכבות יציבה עם החיים וחצי ארוכות של ~ 60 שניות. ריכוזים סופי: 0.4 מיקרומטר Msh2-MSH6, 0.06 מיקרומטר DNA שכותרתו, 4 מיקרומטר ללא תווית G: מלכודת T-DNA.

איור 5
איור 5. MDCC-PBP הכנה. SDS-PAGE ניתוח של E. פוספט coli חלבון מחייב (PBP), מטוהרים שכותרתו עם fluorophore MDCC.

איור 6
איור 6. MDCC-PBP בתגובה פוספט. טיטרציה של MDCC-PBP עם פוספט (Pi) תוצאות הקרינה MDCC גוברת.

איור 7 א
איור 7 א. הכנת פוספט (Pi) עקומת סטנדרטי. MDCC-PBP (20 מיקרומטר) מעורבב עם כמויות משתנות של Pi (0-8 מיקרומטר)ד הקרינה נמדדת לאורך זמן עד שיווי משקל הוא הגיע. ריכוזים סופי: 10 מיקרומטר MDCC-PBP, 0-4 פיי מיקרומטר.

איור 7 ב
7b איור. הכנת פוספט (Pi) עקומת סטנדרטי. מקסימום MDCC-PBP הקרינה היא להתוות לעומת [Pi] להניב עקומה סטנדרטית. השיפוע של הקו (0.383 מיקרומטר -1 במקרה זה) משמש כדי להמיר MDCC-PBP הקרינה לתוך ריכוז Pi.

איור 8 א
איור 8 א. Msh2-MSH6 ATPase קינטיקה. Msh2-MSH6 (4 מיקרומטר), על היעדר G: T-DNA, מעורב במהירות עם ה-ATP (1 מ"מ) MDCC-PBP (20 מיקרומטר) מפגין פרץ של הידרוליזה ATP ושחרור Pi. ניתוח נתוני התשואות קצב (הידרוליזה k = 1.4 s -1) לבין המשרעת (2 מיקרומטר; 1 אתר לכל Msh2-MSH6) של השלב פרץ, אשר מלווה שלב, ליניארי מצב יציב בשיעור של של 0.4 מיקרומטר - 1 (k cat = 0.2 s -1).

איור 8b
איור 8b. Msh2-MSH6 ATPase קינטיקה. תוספת של G: T-DNA לתגובה (6 מיקרומטר) מדכא את פרץ הידרוליזה של ATP, ייצוב מורכב במצב ATP הנכנס. ריכוזים סופי: 2 מיקרומטר Msh2-MSH6, 500 מיקרומטר ATP, ה-DNA 3 מיקרומטר, 10 מיקרומטר MDCC-PBP. קינטיקה פרץ מתאימים על ידי המשוואה הבאה: [Pi] = 0 k e-t + VT, שם [Pi] הוא ריכוז פוספט, 0 היא משרעת פרץ, k הוא שיעור פרץ ציין קבוע ו-V היא מהירות שלב ליניארי (k cat = V / [Msh2-MSH6]).

מדגם חלבון ה-DNA
מגיב מניות עבודה כרך, μL מניות עבודה כרך, μL
Msh2-MSH6 5 מיקרומטר 0.8 מיקרומטר 64 - - -
2ApG: T - - - 10 מיקרומטר 0.12 מיקרומטר 4.8
חוצץ 10x 1x 40 10x 1x 40
DDH 2 O - - 296 - - 355
סך הכל 400 400

1 לוח DNA מחייבת תגובה

מדגם חלבון חלבון-DNA ה-ATP
מגיב מניות עבודה כרך, μL מניות עבודה כרך, μL מניות עבודה כרך, μL
Msh2-MSH6 20 מיקרומטר 4 מיקרומטר 80 20 מיקרומטר 4 מיקרומטר 80 - - -
G: T - - - 100 6 24 - - -
ה-ATP - - - - - - 50 מ"מ 1 mM 8
7-MEG 250x 1x 1.6 250x 1x 1.6 250x 1x 1.6
PNPase 100x 1x 4 100x 1x 4 100x 1x 4
PBP-MDCC 150 מיקרומטר 20 מיקרומטר 53.3 150 מיקרומטר 20 מיקרומטר 53.3 - - -
חוצץ 10x 1x 40 10x 1x 40 10x 1x 40
DDH 2 O - - 221 - - 197 - - 346
סך הכל 400 400 400

טבלה 2 ATPase תגובה

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדוגמה של חלבון ה-DNA מחייבת התאמה המתואר כאן מדגים את הכוח ואת השירות של שיטות הקינטית חולף לחקר המנגנונים של מולקולות ביולוגיות. הפסיקה זרימת מדידות על היקף מחזור אחד זמן סיפקו ראיות חד משמעיות עבור מחייב מהירה מסוים של חלבון Msh2-MSH6 לזוג בסיס תואמים היווצרות קומפלקס חיים ארוכים X-DNA חלבון בתגובה 9. יתר על כן, הפסיקה זרימת (ו להרוות זרימה) ניתוח פעילות ATPase סיפק עדות ישירה למעבר Msh2-MSH6 כדי קונפורמציה ATP הנכנס לאחר דנ"א תואמים מחייב 11,16. מתג זה שיערו לאותת תיקון דנ"א 17,18. אלה נתונים ברזולוציה גבוהה קינטי, יחד עם רזולוציה גבוהה נתונים משלימים מבניים הכרחיים לקידום ההבנה של תפקוד macromolecular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרס קריירה NSF (מממ), מ 'בארי גולדווטר מלגה (FNB) וכן בפרס ASBMB מחקר לתואר ראשון (CWD). שיבוט ביטוי יתר של PBP סופק באדיבות על ידי ד"ר מרטין ווב (MRC, בריטניה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 G DNA Sequence: 5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’
37 T (2-Ap) DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’
37 T DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3’

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9, (1), 87-89 (1998).
  2. Johnson, K. A. E. Kinetic analysis of macromolecules. Oxford University Press. (2003).
  3. Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407, (6805), 703-710 (2000).
  4. Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407, (6805), 711-717 (2000).
  5. Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26, (4), 579-592 (2007).
  6. Kunkel, T. A. &, Erie, D. A. DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
  7. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (5), 335-346 (2006).
  8. Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129, (7-8), 391-407 (2008).
  9. Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366, (4), 1087-1098 (2007).
  10. Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5, (2), 153-162 (2006).
  11. Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochemistry. 42, (25), 7682-7693 (2003).
  12. Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319, (1), 78-87 (2003).
  13. Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2), 680-685 (2010).
  14. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, (27), 8262-8271 (1994).
  15. Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochemistry. 37, (29), 10370-10380 (1998).
  16. Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochemistry. 43, (41), 13115-13128 (2004).
  17. Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91, (7), 995-1005 (1997).
  18. Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22, (1), 39-49 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats