Termit Gut Mikroplar (Zootermopsis Angusticollis) DNA ayıklanıyor ve Gut Mikroplar görselleştirme

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu video termit hindgut ikamet mikropların türünün DNA ayıklamak için teknik göstermektedir. Bağırsak mikrobiyal topluluk görüntülenmesi için yararlı bir ıslak montaj kaydırağı, hazırlık da gösterilmiştir ve türler açısından zengin bir bağırsak ortamı üzerinden bir tur verilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matson, E., Ottesen, E., Leadbetter, J. Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes. J. Vis. Exp. (4), e195, doi:10.3791/195 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Termitler sadece alıcı ahşap geçinmeye kapasitesine sahip olduğu bilinen en az sayıda hayvan arasında yer almaktadır. Termit bağırsak yolu, ağırlıklı olarak asetat lignoselüloz bozulması yardımcı, yoğun ve türler zengin bir mikrobiyal nüfusun bulunduğu, termit metabolizma alevlendiren kilit besin (Odelson & Breznak, 1983). ("Düşük") bazı termitler de ökaryotik protozoa, bakteri, metan arkelerin ve bu mikrobik popülasyonları içinde. Böylece, termitler mükemmel araştırma konuları mikrobiyal türler ve ev sahibi yararına yapmak birçok biyokimyasal fonksiyonları arasındaki etkileşimleri çalışmak için. Termit bağırsaklar gibi çeşitli biyokimyasal süreçlerde yer alan anahtar genlerin mikrobiyal popülasyonların tür bileşimi, moleküler teknikler kullanılarak (Schmit-Wagner ve ark, 2003; Salmassi & Leadbetter, 2003 Kudo ve ark, 1998) incelenmiştir. Bu teknikler, termit bağırsak ortamından yüksek kalitede nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırma bağlıdır. Berthelet ve ark, 1996; Purdy ve ark, 1996; Salmassi & Leadbetter Bu video açıklanan çıkarma tekniği çevre örnekleri (Mor ve ark, 1994 nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için geliştirilen protokoller değiştirilmiş bir derleme 2003;. Ottesen ve ark 2006) ve DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için şablon olarak kullanmak için uygun termit hindgut malzeme üretir.

Protocol

Termit tam-bağırsak DNA ekstraksiyonu için Usul özeti:

  1. Chill termitler, buz üzerinde steril cımbız kullanarak gut kaldırmak ve tampon bağırsak örnekleri stabilize.
  2. PVPP / SDS / fenol tampon numune homojenize.
  3. Qiagen DNeasy sütunlarını kullanarak ham lizat DNA Özü ve arındırmak.

Protokol:

  1. Buz, steril forseps kullanarak işçi kast termitler cesareti çıkarın.
  2. 50 mcL buz 1x moleküler biyoloji sınıf TE tampon içeren steril, nükleaz içermeyen tüp hemen cesareti ve içeriğini transfer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0). -20 ° C'de örnekleri Dondurma, ya da doğrudan homojenizasyon ile devam edin.
  3. Transfer bağırsak örnekleri ve tampon steril, nükleaz içermeyen 2 ml vidalı kapaklı tüp, 500 mg ile% 1 w / v polyvinylpolypyrrolidone (PVPP içeren steril zirkon / silis boncuk (0.1 mm) ve 700 ul 1x TE tampon önceden yüklenmiş .)
  4. 50 ul% 20 Sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 500 ul örnekleri fenol ekleyin.
  5. 30 sn homojenizasyon üç kür ve buz üzerinde tüyler ürpertici 30 saniye ile en yüksek ayarı (boncuk yendi) karıştırılır.
  6. 1 dakika için 8.000 x g Tortu çözünmez malzeme.
  7. Ham lizat arıtma için açıklanan yöntemi kullanarak Qiagen DNeasy sütunları ile sulu (üst) tabakasının 300-ul alikotları arındırın.
  8. Daha sonra kullanmak için -20 ° C'de nükleik asit içeriği ve dondurma örnekleri sayısal olarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bizim tecrübelerimize göre, Zootermopis nevadensis gibi ahşap besleme termit türlerinin mikrobiyal topluluklar çıkarılan DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma bir turdan sonra, PCR şablon için yeterince saf. Ancak, çöp besleme ve toprak besleme türleri gibi bazı termitler, bağırsak içeriği hümik asit daha yüksek bir konsantrasyon ve bağırsak mikrobiyal DNA ek arıtma gerekebilir. Toplam 5 Z. nevadensis işçilerin cesareti DNA verimi 10-30 mikrogram aralığında. Önemli ölçüde daha küçük veya daha büyük bu türün termit türleri için, daha fazla veya daha az örneklerinin benzer bir miktarda DNA elde etmek için gerekli olabilir.

Bu yöntem, kolayca RNA ekstraksiyon izin adapte olabilir. RNA ekstraksiyonu için, protokolün 2. adımda açıklanan buz TE tampon Qiagen (catlog. 76.506) 1x RNAprotect Bakteriler reaktif yerine. Qiagen RNeasy reaktifler ve sütunlar (yok. 74.104 catlog), yukarıda açıklanan DNeasy arıtma prosedürü yerine kullanılmalıdır. RNAprotect stabilize örneklerinden DNA arıtılmış ve yaklaşık 300 mcL gibi. 7. adımda alınan 700 mcL sulu tabaka, nükleik asit saflaştırma için, bu yöntem hem DNA ve RNA paralel olarak tek bir örnek almak için kullanılabilir.

Bu teknikler, termit bağırsak ortamından yüksek kalitede nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırma bağlıdır. Berthelet ve ark, 1996; Purdy ve ark, 1996; Salmassi & Leadbetter Bu video açıklanan çıkarma tekniği, çevresel numuneler (Daha fazla ve ark, 1994 nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için geliştirilen protokolleri değiştirilmiş bir derleme. 2003;. Ottesen ve ark 2006) ve DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için şablon olarak kullanmak için uygun termit hindgut malzeme üretir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PVPP/SDS/phenol Buffer homogeneization buffer
DNeasy Tissue Kit Kit Qiagen 77607 Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003)
TE Buffer Sigma-Aldrich T9285 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate
zirconia/silica beads Supplies Biospec Products 11079101z 0.1 mm
PVPP Reagent Sigma-Aldrich P6755 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer
Zootermopsis nevadensis Animal Termites
SDS Reagent Sigma-Aldrich L4390 Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent
Phenol Reagent Sigma-Aldrich 77607 TE-saturated, ~73%
MiniBeadbeater-8 Tool Biospec Products 963
BSS Buffered Salt Solution, pH 7.2 Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3
AxioPlan-2 Microscope Carl Zeiss, Inc. Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
  2. Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
  3. Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
  4. Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
  5. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
  6. Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
  7. Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
  8. Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
  9. Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).

Comments

10 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. I would also like to know the magnification used to view the microbes and if any phase contrast was used with the microscope setup. Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 20, 2007 - 6:24 PM
  3. As indicated in the updated protocol, a Zeiss AxioPlan-² Imaging microscope was used to aquire the images of termite gut microorganisms using Phase contrast illumination. Our particular set up allows magnification of samples up to 1,600X. This is accomplished using a 100X oil immersion objective lens + a 1.6X optivar + a 10X ocular lens. However, the images in the video use a 40X hi-dry phase contrast objective lens + the 1.6X optivar. To make the video, the videographer replaced the eyepiece with an adapter and attached the camera to that. Because we did not use a scale bar in these videos I do not know the magnification at which the camera recorded so the final magnification will depend on that factor + the window size used to view the video. I will say that the resolution is approximately consistent with what I observe at 640X magnification.

    Reply
    Posted by: Eric M.
    January 14, 2008 - 1:37 AM
  4. hello sir sir i am a project fellow in IIIM in india i want to know manual method how to isolate total DNA from termite and beetle gut(wood borer).sir kindly if you can provide me protocol for this i will be very thankful to you as i am in very need of it. thanking you sir and waiting for your reply

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 17, 2008 - 8:18 AM
  5. Hello,sir.I am interest in the manual DNA extraction methods from organic tissue,and acquire the best concentraction of DNA, can you provide me for this protocol, thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2009 - 6:21 AM
  6. The information should appear below the video on the JOVE website, and a PDF of the protocol should be downloadable, however, I notice that the link dŒs not currently work. An alternative path to the document can be found by searching the article on PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) and choosing the full-text article from PubMed central. I've contacted JOVE to restore the file on their website. Several strategies for purifying insect gut-community DNA exist. A crucial step in any extraction procedure is to remove PCR-inhibiting substances if present. We have found that 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone works well on DNA derived from termite gut contents.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 3:14 AM
  7. good job! very cool!

    Reply
    Posted by: jacqui s.
    December 12, 2009 - 7:28 AM
  8. Hi! I'm korean student. I want to see this full video.then what can i do?

    Reply
    Posted by: Hyun Y.
    October 31, 2014 - 9:47 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics