T - 파 이온 모빌리티 분석법 - 질량 : 단백질 복잡한 분석을위한 기본 실험 절차

Biology
 

Summary

이온 이동성 - 질량 분광법는 충돌 단면 및 질량에 따라 이온을 분리 신흥 가스 상 기술입니다. 방법은 단백질 단지의 전체 토폴로지와 모양에 대한 입체적인 정보를 제공합니다. 여기, 우리는 악기 설정 및 최적화, 드리프트 시대의 교정 및 데이터 해석을위한 기본 절차를 설명합니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Michaelevski, I., Kirshenbaum, N., Sharon, M. T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis. J. Vis. Exp. (41), e1985, doi:10.3791/1985 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

이온 이동성 (IM)는 약한 전기장의 영향 하에서 압력 셀을 통과하는 이온을 위해 촬영 시간을 측정하는 방법입니다. 이온이 표류 영역을 통과하는 속도는 자신의 크기에 따라 달라집니다 큰 이온은 작은을 구성하는 이들 이온보다 배경 불활성 가스 (일반적으로 N 2)와 충돌이 더 많은 경험을하기 때문에 메신저 장치를 통해 더 천천히 여행을합니다 단면. 일반적으로 시간이 그것은 그들의 충돌 단면 (Ω)에 따르면, 치밀한 가스상 그들을 구분하지만 마이 그 레이션하는 이온에 대한 소요됩니다.

최근 IM 분광법은 질량 분광법과이 여행 - 웨이브 (T - 파) Synapt 이온 이동성 질량 분석계 (IM - MS)가 출시되었습니다와 결합했다. 이온의 이동성과 질량 분광법을 통합하는 것은 3 차원 스펙트럼을 (유료, 강도, 그리고 표류 시간 질량) 항복, 샘플 분리와 정의의 여분 차원을 수 있습니다. 이 분리 기술은 스펙트럼 중복 감소 수 있도록, 매우 유사한 질량, 또는 대량으로 충전 비율지만, 다른 드리프트 시간으로 이기종 단지의 해상도를 수 있습니다. Ω이 이온의 전반적인 모양과 토폴로지에 관련되어 같이 또한, 드리프트 시간 측정, 구조 정보의 중요한 계층을 제공합니다. 측정된 드리프트 시간 가치와 Ω 사이의 상관 관계가 정의 교차 섹션 1 calibrant 단백질에서 생성된 교정 곡선을 사용하여 계산됩니다.

IM - MS 방식의 전원이 subunit의 포장 및 micromolar 농도에서 단백질 어셈블리의 전체 모양을 정의하는 능력에 달려있다, 그리고 거의 생리적 조건 1. 개별 단백질 2,3 및 비 공유 결합 단백질 단지 4-9 모두 몇 가지 최근의 메신저 연구는 성공적으로 단백질 제사기 구조는 가스 단계에서 유지되는 시연, 그리고 알 수없는 형상의 단백질 어셈블리의 연구에서이 방법의 가능성을 강조 . 10, 여기, 우리는 Synapt를 사용하여 단백질 단지의 IMS - MS 분석 (Quadrupole 이온 이동성 - 시간의 기내) HDMS 악기 (유일한 상용 IM - MS 장비 현재 워터스 주)에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리는 기본적인 최적화 단계, 충돌 크로스 섹션의 교정, 데이터 처리 및 해석에 대한 방법을 설명합니다. 프로토콜의 마지막 단계는 이론적 Ω의 값을 계산하는 방법을 설명합니다. 전체 프로토콜 단백질 어셈블리 IM - MS 특성화의 모든 부분을 커버하려고 시도하지 않는다; 오히려, 그 목적은 현장에서 새로운 연구에 대한 방법의 실용적인 측면을 소개하는 것입니다.

Protocol

우리가 설명하는 절차는 전적으로 단백질 단지의 IM - MS 분석에 중점을 둡니다. 따라서, 우리는 구조 MS의 분야와 모르는 연구원은 샘플 준비 단계, 계기 교정과 MS와 Kirshenbaum 외에 설명되어있는 탠덤 MS 최적화 절차를 참조하시기 바랍니다. 2009 http://www.jove.com/index/details가. STP? ID = 1954. 일반적으로,이 프로토콜은 암모늄 아세테이트 (- 1 M, pH를 6-8 0.005)와 같은 휘발성 버퍼에서 복잡한 낮은 micromolar 농도 (1-20 μm의)을 포함합니다. 1-2 μl가 모세관 nanoflow 당 소비되는 감안할 때, 우리는 MS 조건의 최적화를 사용하려면 최소 볼륨으로 10-20 μl을 제안한다.

1 부 : 이온 이동성 - 질량 분석법 스펙트럼을 취득

  1. 모바일 - TOF, 긍정적인 이온 수집하고, V - 모드 다음 작동 모드에 대한 질량 분석계를 설정합니다.
  2. (API, 함정 및 IMS) 모든 가스를 켭니다. 우리는 트랩 / 전송 IM 분리에 대한 N 2, 아르곤을 사용합니다. 추천 초기 값은 1.5 ML / 트랩 지역 분, 24 ML / IMS 장치에 대한 분 가스 흐름입니다.
  3. M / Z 수집 범위를 설정합니다. 알려지지 않은 단백질 복잡한 경우, 우리는 다음 원하는 값으로 줄일 수있는 다양한 질량 범위의 초기 사용하는 것이 좋습니다. 병렬로, 최대 전송 효율에 대한 MS 프로필을 조정할 수 있습니다. 대형 단지의 경우, 인수 질량 범위는 1000에서 설정해야합니다 - 32,000m / Z하고, 자동으로 MS 프로필을. 그렇지 않으면, 프로필은 다음 차트에 따라 설정할 수 있습니다 :
    M / Z 면만 (%) 램프 (%)
    960 10 20
    3200 30 40
    10,667
  4. , 따라서 RF 설정을 확인하고, 필요한 경우, 큰 단백질 단지에 적합한 값으로 조정합니다 :
    출처 트랩 IMS 이전
    RF 오프셋 450 380 380 380
    RF 게인 0 0 0 0
    RF 제한 450 380 380 380
  5. 모세관 전압 (1,050-1,400 V)과 낮은 nanoflow 압력 (0.00-0.03 바)를 적용합니다. 일단 스프레이가 시작됩니다, 최소 값을 nanoflow 압력을 줄이기 위해 시도합니다. 또한, 원추와 관련, 모세관의 위치를​​ 조정합니다.
  6. 잘 해결 MS 스펙트럼 얻으려면 MS 수집 매개 변수를 조정 : 악기를 따라 압력 기울기, 그리고 샘플링 원추뿐만 아니라 추출 원뿔형, 편견, 함정 및 잠재 설정을 전송은 모든 (관련에 대한 자세한 최적화되어야합니다 조브 프로토콜 Kirshenbaum 외. http://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954 2009). 이러한 매개 변수가 샘플에 의존하고 있지만, 우리는 단백질 단지로 펩타이드에서 다양한 이온 질량의 MS 스펙트럼을 습득에 사용되는 조건, 표 1에 요약되어 있습니다 (그림 1.도 참조). 점차적으로 정상의 위치를​​ 변경하지 않고 (~ 10 V의 단계에서) 샘플 원추, 함정과 편견 전압을 줄이기 위해 복잡한 노력의 정품 인증을 최소화하려면 다음과 같이하십시오.
  7. 일단 최적의 질량 스펙트럼은 드리프트 시간 프로필을 조정해야 얻을 수 있습니다. 단백질 어셈블리, 질량 및 이동성 측정 모두에 대해 최적의 조건을 분석을 때 종종 호환되지 않으므로, 그것은 둘 사이의 적절한 균형을 공격하는 것이 중요합니다. 전체 이온 이동성 플롯은 봉​​우리가 전체 드리프트 시간 범위에서 배포하는 등의 최적화하고, 정상 프로필 부드러운이며, 가우스 분포 (그림 2A, 2B)을 접근해야합니다. 중요한 피크는 여러 conformations의 가난한 분리과 관련이있을 수 있습니다 비대칭성.
  8. 일반적으로, 세 개의 매개 변수, T - 파 속도, T - 파도의 높이와 IMS 가스 유량은 이동성 분리를 최적화하기 위해 조정할 수 있습니다. 증가 T - 웨이브 높이 값을가 좁은 반면 T - 파 속도를 높이면, 드리프트 시간 배포 프로필을 넓혀 것입니다. 마찬가지로, IMS 가스 흐름을 증가하면 높은 값 (최소한의 IMS 가스 흐름 10 ML / 분한다)쪽으로 표류 시간 프로필을 변경됩니다. 우리는 고정 세 변수의 두 떠나, 그리고 메신저 스펙트럼은 (그림 2B) 잘 해결될 때까지 세 번째를 최적화하는 것이 좋습니다. 이를 위해, 250 M / S 24 ML / 분, 다시로 T - 파 속도 및 가스 흐름을 설정spectively. 그런 다음, 기점으로 3 V로 T - 파도 높이를 설정하고, stepwise 방식으로, 1 V의 단위를 높일 수 있습니다. 일반적으로, 큰 이온은 높은 파도 높이가 필요합니다. 보통 IMS 압력을 수정할 필요가 없습니다, 그러나, 때 높은 바이어스 전압이 바이어스 전압 값에서 감소하고, 따라서, 단백질 복잡한 활성화의 감소를 활성화됩니다 IMS 가스를 감소 조정이 필요합니다. 전체 10-12톤 / Δt의 최대한의 해상도에 도달하실 수 있습니다.
  9. 조건 (낮은 T - 파도 높이 또는 높은 T - 파 속도 및 / 또는 높은 IM 압력) 최적화되지 않은 경우, 이온 효과적으로 IM 장치를 통해 통과하지 않으며, 그들의 여정은 다음 이온에 필요한 시간보다 더 오래 걸릴 수도 있습니다 패킷은 이동성 세포에 출시합니다. 이전 패킷이 푸셔 지역에 전달되기 전에 그 결과, 새로운 이온 패킷은 트랩 지역에서 발표됩니다. 이것은 드리프트 시간 스펙트럼의 첫 번째 부분에서 관찰 정상가 붙었다 가장자리 (그림 2C)의 이온의 동일있는, '롤 - 오버'효과로 이어질 것입니다. 이 유물은 T - 파도 높이를 증가하고, T - 전파 속도와 IMS의 압력을 줄임으로써 제거될 수 있습니다. 또한, 트랩 릴리스 시간을 조정할 수 있습니다. 또한, 그것은 전송 T - 파도 높이가 IMS 셀 대한 이온의 누출을 방지하기 위해 적어도 5 V.로 설정되어 있는지 확인하는 것이 중요하다, 우리는 이동성 트랩 높이가 최대 레벨 (30 V)에서 보관하는 것이 좋습니다.
  10. 낮은 속도와 전송 T - 파도의 높은 진폭의 드리프트 시간 분포 프로파일 (그림 2D)의 "리플링"가 발생할 수 있습니다. 이온 (이온 도착 / 드리프트 시간)의 이동성 분리가 전송 및 ToF 지역을 통해 유지되지 않을 때이 유물은 푸셔 주파수와 전송 T - 파 속도 사이의 부분 동기화로 인해 발생합니다. 푸셔 시간이나 전송 T - 파 속도가 조정되어야 하나,이 효과를 제거하기 위해서는. 푸셔 주파수는 질량 범위에 관한 것이므로이 매개 변수가 변경되면,이 유물은 다시 나타날 수 있습니다. 의 감소도 파문을 제거하는 데 도움이 될 수 있지만 T - 파도 높이, 사소한 영향을 미치는.
  11. 상기 매개 변수가 최적화되면, IM - MS 데이터 획득하실 수 있습니다.

2 부 : 기본 구조의 이동성 측정을 보장하기 위해 실험 조건을 검사

높은 해결 MS의 봉우리를 달성하기 위해 단백질 단지는 종종 잔류 물과 버퍼 구성 요소 11 스트립을 촉진하기 위해 질량 분석기 내에서 활성화됩니다. 활성화 에너지가 임계값 이상 증가하는 경우에는, 전개 부분은 기본, 솔루션 상태 구조 (그림 3A - C)에 해당하지 않을 여러 중간 상태 12, 형성 유도하실 수 있습니다. 그 결과, 드리프트 시간이 피크가 이동과 확대, 구조를 펼쳐의 이기종 인구를 반영 수 있습니다.
솔루션 위상 구조와 일치 드리프트 시간 데이터를 얻기 위해서는 신중하게 이전 IM 분리에 가속 이온에 사용되는 전압을 제어하는​​ 것이 필수적입니다. 또한, 높은 MS 해상도를 위해 그것은 오히려 트랩 전압보다 전송을 높이는 것이 바람직합니다. IM 장치가 위치이므로, 먼저 전송 지역 및 TOF 분석기 다음, 따라서, 정품 인증 IM 측정을 다음과 MS의 정확도가 증가 수있는 반면 이온은 영향을받지 남아 있습니다.

해당 데이터 수집이 단지의 기본 구조를 유지하는 조건 하에서 수행되는 유효성을 검사하기 위해, 그것은 데이터가 매개 변수의 설정 하나, 최적화에 따라 실험 및 솔루션 조건의 범위가 아닌 이상 기록하는 것이 좋습니다 :

  1. 드리프트 시간 스펙트럼에 미치는 영향을 모니터링하면서, stepwise 방식으로 모세관 및 원뿔형 전압을 향상시킬 수 있습니다.
  2. 1 단계에서와 마찬가지로, stepwise 방식으로 트랩 충돌 전압을 증가하고, 10 V 간격으로 데이터를 취득.
  3. 펼쳐 conformations를 식별하고 얻은 데이터를 평가하기 위해 수동으로 2-7의 산도 범위에서 초산으로 샘플을 titrating하여 단백질 복합의 분리를 유발하고, 데이터 (그림 3B)를 기록합니다.

파트 3 : 드리프트 시간 가치와 교차 단면 영역 사이의 연관

측정된 드리프트 시간 값이 선형 Ω 관련있는 기존의 IM 측정, 달리, T - 파 IMS 시스템, 십자가 단면적은 교정 방법에 의해 정의됩니다. 따라서 오히려 절대적인 측정보다 상대 지수 상관 관계는 측정된 드리프트 시간 및 Ω 1,13 사이에 생성됩니다 : 방정식 1

어디 T D는 측정 드리프트 시간이며, X는 교정 곡선에서 추출 수있는 비례 상수이다. 교정 수행합니다알려진 Ω (기존 IM 실험에서 측정)와 이온의 드리프트 시간을 측정하여 에드.

  1. 드리프트 시간 측정은 알려진 충돌 크로스 섹션과 ubiquitin 단백질 변성 말 시토크롬 C, 말 심장 미오 글 로빈과 보빈을 사용하여 보정하고 있습니다. 이를 위해, 49/49/2 10 μm의 볼륨 비율의 솔루션, 물 / 메탄올 / 초산은 (사용하는 시약은 표 3에 요약되어 있습니다) 준비를해야합니다.
  2. 대상 단백질 또는 단백질 복잡한에 사용되는 똑같은 악기 조건 calibrant 단백질에 대한 IM - MS 데이터 수집 : 방정식 7 (1 부). 모든 전압 및 압력 값은 IM 분리 설정을 유지하기 위해 동일해야합니다.
  3. calibrant 단백질의 각 충전 상태에 대한 실험 드리프트 시간 값 (T D)를 (4 부의 설명에) 압축을 풉니다.
  4. 다음 방정식을 사용하여 calibrant 표류 시간의 각 (T D) (표 2) 정정 : 방정식 2 어디 M / Z는 관찰 이온의 질량 대 전하의 비율이며, C는 향상된 듀티 사이클 (EDC) 지연 계수 1입니다. 일반적으로 1.4과 1.6 사이의 값을, 악기에 의존합니다. 취득 설정 | | 취득 설치 탭을 EDC 값은 시스템 내에 표시됩니다.
  5. 교수 데이비드 클레머의 단면 데이터베이스를 사용 :
    http://www.indiana.edu/ ~ 클레머 / 리서치 / 크로스 % 20section % 20database/Proteins/protein_cs.htm 14 이온 충전 상태와 감소 대량 모두 단면 calibrant 각을 수정하십시오. 방정식 3
    , Ω C는 어디에 단면을 수정, Ω는 단면, Z는 이온 충전 상태입니다 문학이며, m은 calibrant 이온의 분자량이고, M G는 메신저 배경 가스의 분자량 (일반적으로 N 2).
  6. 에 대항에서 플롯 (T D)C) (그림 4A).
  7. 결과 곡선은 다음 등식에 해당 : 방정식 4 매개 변수 X와이 선형 관계를 음모를 조립하여 추출하실 수 있습니다. 슬로프 X는 지수 비율 계수에 해당하고는 맞게 정해진 상수를 나타냅니다.
  8. 피어슨의 방정식을 사용하여 적합한 상관 계수 R 2을 계산 : 방정식 5 . R 2 허용되는 값은 0.95 (그림 4B)보다 큰 수 있습니다. 낮은 상관 계수 값은 때문일 수 있습니다 :
    1. 불완전한 단백질 calibrants의 전개. 이것은 중간 상태의 이기종 조립으로 인해 최대 확대로 이어질 것입니다.
    2. 우리의 경험에서, 세 예제는 메신저 스펙트럼 떨어질 수 있습니다.
    3. 다른 calibrant 단백질에 사용되는 ...와 비슷하지 않은 실험 조건. 이 경우, 각 단백질에 대한 데이터를하려하는 것은 별도로 그들의 각각 0.95 이상되어야하지만, 다양한 상관 계수를 생성합니다.
    4. 노이지 데이터와 잘못된 케어와 드리프트 시간 분포의 중심.
    5. 계산 오류가 발생했습니다.
  9. 7 단계에서 파생된 결정 지수 계수, X를 사용하여 calibrant 표류 시간을 Recorrect : 방정식 8
  10. 유효성 검사 단계로 replot Ω는 C방정식 10 그리고 상관 계수를 정의합니다. 0.95 이상의 값을 예상하는 것입니다.
  11. 4 단계에서 설명한 절차에 따라, 대상 단백질 또는 단백질 복합의 측정 표류 시간을 수정 : 방정식 7
  12. 7 단계에서 정의된 기하 급수 계수, X를 사용하여 대상 단백질 / 단백질 복합의 표류 시간을 보정 : 방정식 8
  13. : 7 단계에서 정의한 맞게 정해진 상수를 사용하여 대상 단백질 / 단백질 복합 Ω, A를 계산 방정식 9 .
  14. 각 실험 조건에 대한, 단계 2-13을 반복해야합니다. 미지의 단백질이나 단백질 복합의 십자가 단면적을 정의할 때, 우리는 각각의 실험이 적어도 세 번 반복하고, 이러한 세중의 측정의 표준 편차가 결정하는 것이 좋습니다.

4 부 : 드리프트 시간 값을 정의

필수 소프트웨어 : MassLynx와 Driftscope (워터스).

  1. Driftscope 소프트웨어를 사용하여 IM - MS 스펙트럼을 엽니다.
  2. 주 메뉴에서, 바이올렛 선택우 및 취소의 크로마토 그램, 드리프트 시간 및 스펙트럼 (옵션), M / Z. 대 드리프트 시간을 표시만을 2D지도를 적극적으로 떠나
  3. 옵션 | | 메뉴 표시줄에서 디스플레이를 선택 디스플레이 편집기 패널과 배경 잡음을 최소화하기 위해 강도 임계값 값을 조정합니다 (대부분의 경우,이 설정은 민 = 30~40% 및 최대 = 100 % 카운트로 정의할 수 있습니다.)
  4. 디스플레이 선택 | 2D지도 강도 규모를, 그리고 세 가지 옵션이 나타납니다 : 리니어 스케일을 규모를 기록하고 제곱근의 규모. 로그 스케일 (로그 데이터 변환)의 선택은 강도 색상 코드를 압축하고, 농도의 광범위한 범위의 동시 모양을 가능하게합니다 (선형 및 제곱근 옵션과는 반대로, 어떤만을 가장 강렬한 봉우리가 표시가됩니다) .
  5. 도구 모음 패널에서 선택 도구] 단추를 사용하십시오. 이 옵션은 다른 선택 옵션을 활성화하고, 스펙트럼 내에서 해당 지역의 선택을 가능하게합니다. 가장 정확한 도구는 국경을함으로써 불필요한 데이터 및 소음 봉우리를 제외, 관심있는 지역의 주위에 그려 수있는 수단으로 관심 선택의 지역을 활성화합니다. 마찬가지로, 오르토고널 및 밴드 선택 옵션은 관심의 영역이 중복 봉우리로 둘러싸여되지 않은 경우, 유용합니다.
  6. 관심의 영역이 선택되면, 불필요한 정보를 제거하려면 현재 선택 명령을 수락을 사용합니다.
  7. 드리프트 시간 정보를 유지하면서, MassLynx 데이터를 내보낼 수 있습니다.
  8. MassLynx 내에 저장된 드리프트 시간 스펙트럼의 크로마토 그램을 열고 시간 용기를 결합. 해당 질량 스펙트럼이 자동으로 열립니다.
  9. 창 크기와 부드러운 매개 변수의 개수가 (최소한의 값을 사용하여 각 스펙트럼에 대해 구체적으로 조정해야합니다) 정의하여 smoothening 기능을 적용합니다.
  10. 필요한 경우 기본 뺄셈을 적용합니다.
  11. 센터는 스펙트럼과 질량을 측정, 단백질 ID와 대량의 정확도를 확인할 수 있습니다.
  12. 각각의 충전 상태의 경우 M / Z 범위를 결합. 해당 드리프트 시간 스펙트럼이 자동으로 나타납니다. 부드럽고 센터 드리프트 시간 프로파일, 각 피크의 중심을 나타내는하여 드리프트 시간 값을 정의합니다.

제 5 부 : 대표 결과

그림 1
그림 1. IMS - MS의 인수의 주요 조정할 수있는 매개 변수를 나타내는 Synapt HDMS 악기의 개략도 표현. IM - MS 측정에 사용되는 실험 매개 변수는 악기 내에서 위치에 따라 분류됩니다. 이온 빔은 붉은 색이며, 각 지역에있는 압력은 색상 코드를 사용하여 지정되어 있습니다. 하단 패널은 악기와 트랩 및 전송 충돌 에너지뿐만 아니라 바이어스 잠재력을 정의하는 잠재적인 차이를 따라 잠재적인 그라데이션을 보여줍니다. 읽기 백업 모든 후보는 일반적으로 120V로 설정되어 있습니다 정적 오프셋 전압 참조됩니다.

그림 2
그림 2. Gβυ 단백질에 대한 이온의 이동성 도착 시간 분배.

A. A는 높은 T - 파 속도는 드리프트 시간 프로필 좁은 분포로 안내합니다. 줄거리의 도착 시간 분포를 보여줍니다 16 + (적색), 15 + (녹색), 14 + (파란색), 13 + (마젠타) 충전 상태뿐만 G의 βυ 단백질의 총 드리프트 시간 프로필 (검정색)로.

부드러운 가우스 피크 모양 B.는 최적화된 드리프트 시간 스펙트럼. 와 같이 비슷한 컬러 라벨.

이동성 세포를 통과하는 이온에 대한 이동 시간이 장치에 새로운 이온 패킷의 주사 사이의 간격보다 느린 경우에 발생합니다 C. A '롤 - 오버'효과. 그 결과, 확장 드리프트 시간이 피크는 스펙트럼의 시작 부분에 나타납니다. 이 효과는 T - 파도 높이를 증가하고, T - 전파 속도와 IMS의 압력을 줄임으로써 제거될 수 있습니다.

전송 T - 파 속도 및 푸셔 주파수가 부분적으로 동기화하는 경우 D. 인공 '파문'가 발생합니다. 이 효과는 푸셔 주파수 또는 전송 T - 파 속도 중 하나를 조정하여 극복할 수 있습니다.

그림 3
그림 3. 이온 활성화 및 헤모글로빈의 IM - MS 스펙트럼에 대한 부분 denaturing 조건의 영향. 10 MM의 암모늄 아세테이트의 수용액을 사용하여 tetrameric 헤모글로빈 복잡한을위한 M / Z 대 드리프트 시간 플롯 (산도를 = 7.6) (A, C) 과 0.1 % 초산 (B)의 추가. 데이터 트랩 충돌 에너지 13 V (A, B)의 전압 35 V (C) 세 패널의 질량 스펙트럼은 (상단에 예상) 4천미터 / Z 중심 tetrameric 요금 시리즈와 유사하지만,를 사용하여 인수 드리프트 시간 프로필 (측면에서 예상) 다른 (총 드리프트 시간 분포는검은, 그리고 16 + 프로파일)은 빨간색입니다. C에서 얻은 B에서 얻어진 부분적으로 변성 샘플 더 이상 표류 시간, 그리고 가스 상 활성 이온은, 전개 어느 정도 나타내는 것입니다. 이 관찰 측정 질량은 그대로 복잡한에 해당하더라도, 그 솔루션 구조가 방해 것을 보여줍니다. 그 결과, 실험 조건의주의 통제가 필요합니다.

그림 4
그림 4. 교정 곡선을 생성하여, 시간 측정 드리프트와 충돌 교차 부분은 상호 수 있습니다.

A.이 이온 충전 상태와 감소 대량 모두 수정 문학 Ω의 값을 역모를 꾸몄다되었습니다 에콰인 시토크롬 C (원), 말 심장 미오 글 로빈 (삼각) 및 (광장) ubiquitin 소의 다양한 충전 상태의 드리프트 시간 값을 측정. 에선 (Ω C) = Xln (T D ') + A. : 적합에 해당하는 선형 함수를 산출 결정 지수 팩터 (X), (A)에 맞게 정해진 일정과 상관 계수는 350m / s의 T - 파 속도, 11 V. B의 정적 파도 높이에서 얻은 데이터에 대한 줄거리에 표시됩니다. 상관 계수 배포판 히스토그램 10 연속 측정 실험에서 얻은.

단백질 샘플 / 기술 매개 변수 GluFibrino -
펩타이드
단위체
1.6 KDA
미오 글 로빈

단위체
17 KDA
혈색소

tetramer
67 KDA
트랜스페린

단위체
80 KDA
GroEL

14 - 메르
801의 KDA
백업 압력, mBar 4.4 5.0 5.1 5.1 6.5
트랩 압력, mBar 1.6x10 -2 2.4x10 -2 2.4x10 -2 2.6x10 -2 2.8x10 -2
IMS 압력, mBar 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.2x10 -1
샘플링 콘 전압, V 46 80 80 80 118
추출 콘 전압, V 1.7 1 1 1 3
바이어스 전압, V 20 20 25 25 50
트랩의 충돌 에너지, V 20 15 15 15 80
전송 충돌 에너지, V 5 12 12 12 15

표 1. macromolecules를 분석에 사용되는 실험 조건.

표준 단백질 분자 질량 (M) 요금 (Z) M / Z 충돌 단면 (2)
시토크롬 C 12,213 10 1222.3 2226
11 1111.3 2303
12 1018.8 2335
13 940.5 2391
14 873.4 2473
15 815.2 2579
16 764.3 2679
17 719.4 2723
18 679.5 2766
미오 글 로빈 16,952 11 1542.1 2942
12 1413.7 3044
13 1305.0 3136
14 1211.9 3143
15 1131.1 3230
16 1060.5 3313
17 998.2 3384
18 942.8 3489
19 893.2 3570
20 848.6 3682
21 808.2 3792
22 771.6 3815
Ubiquitin 8565 8 1071.6 1442
8 1071.6 1622
9 952.7 1649
10 857.5 1732
11 779.6 1802

표 2. Calibrant 단백질과 기존 IMS의 측정 14 결정들이 충돌 크로스 섹션 값.

장치 회사 카탈로그 번호
Synapt HDMS - 32K RF 발생기 워터스 (주)
P - 97 플라밍 - 브라운 micropipette 풀러 서터 인 스트 루먼트 P - 97
coater의 스퍼터 전자 현미경 과학 EMS550
쌍안 현미경 니콘
시약 회사 카탈로그 번호
암모늄 아세테이트 시그마 - 알드리치 시그마, A2706
CSI 99.999 % 시그마 - 알드리치 알드리치, 203,033
메탄올 시그마 - 알드리치 Fluka, 34966
아세트산 피셔 사이 언티픽 AC12404
에콰인 미오 글 로빈 (말 마음에서) 시그마 - 알드리치 M1882
에콰인 시토크롬 C (말 마음에서) 시그마 - 알드리치 C - 2506
(적혈구에서) ubiquitin 보빈 시그마 - 알드리치 U6253
혈색소 시그마 - 알드리치 H2625
가스 댓글
질소, 99.999 % 순도 8m3 실린더
아르곤, 99.999 % 순도 8.8 입방 meterscylinder

표 3. 시약 및 장비.

Discussion

프로토콜 여기서 설명하는 것은 자신의 전반적인 모양, subunit 포장 및 토폴로지에 대한 정보를 제공하는 목적으로, 알 수없는 입체 구조 단백질 또는 단백질 단지의 충돌 크로스 섹션을 정의할 수 있습니다. 이를 위해 충돌 단면적 값이 일단은 구조 세부 사항이 값을 변환하는 데 필요한 그려져 있습니다. 이 과정은 추가적인 실험의 노력뿐만 아니라 간략하게 아래에 설명하는 전산 분석을 필요로합니다.

로 시작하기 위해, 그것은 알려진 구조 단백질 또는 단백질 단지를 분석하는 것이 좋습니다. 이러한 측정 방법의 유용 품질 관리를 제공할 수 있으며, 이론적 측정 Ω 값을 비교하여 인수 매개 변수의 정확성 평가를 활성화합니다. 이론 교차 단면 영역은 결정 구조에서 계산 수있는 연산자는 필요에 따라 코드 수정을 허용 오픈 소스 FORTRAN 기반 소프트웨어입니다 MOBCAL 15,16 소프트웨어를 사용하여 조정합니다. 이러한 계산을 실행하는 그것은 입력 구조마다 반복 수행 계산의 숫자가 증가하고 원자의 다수를 포함하는 조정 파일이 하나를 수락하는 것을 이러한 프로그램을 수정해야합니다.

복수 어셈블리 내에서 subunits의 topological 준비를 정의하는 IM - MS의 전략은 최근 4,6을 제안되었습니다. 방법은 더 작은 구성 요소를 단백질 분리 어셈블리 경로의 모니터링을 포함한다. 이 분리는 어셈블리의 "빌딩 블록"의 반사 subcomplexes의 배포에 상승을 제공 솔루션 위상 조건을 통제 조정을 통해 이루어진다. 손상 복잡하고 분해 제품의 Ω 값의 동시 측정 후 단백질 단지의 topological 모델을 계산에 사용되는 구조적 지지대를 생성합니다. 이 방법론을 기본의 기본 가정은 생성 subcomplexes들이 네이티브와 같은 주문 확인을 유지하고, 실제로 최근 연구 해체 제품의 솔루션 구조가 유지되는 증명하고 어느 솔루션 또는 가스 단계에 주요 다시 정리하기는 4,6 발생하지 않았는 점이다.

가스 상 단백질 복합 이온에 제사기 구조의 과제의 마지막 단계는 컴퓨터 생성 모델에 충돌 단면적 값을 피팅입니다. 모델링 접근 방식은 다른 가능한 topological subunits의 준비 및 silico Ω의 값을 계산하고 실험 것들에 비교를 탐험하기 위해 고용하고 있습니다. 현재 몇 전산 방법은 subunits 1,8의 직경을 대략 spheretype 결이 거친 방법처럼 사용됩니다. 전체에서이 필드는 초기에 아직 추가적인 개발이 접근법은 일반적인, 그리고 단지의 광범위한 적용하기 위해 필요합니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

저자는 자신의 중요한 검토하고, 원고들의 공헌에 대한 샤론 그룹 회원 주셔서 감사합니다. 우리는 Morasha과 Bikura 프로그램, 이스라엘 과학 재단 (부여 Nos. 1823년에서 1807년까지과 378/08), Biomembrane 연구 조셉 콘 미네르바 센터, 뉴 과학자 Chais 가족 펠로 프로그램, 아브라함의 지원 감사 그리고 소니아 Rochlin 재단, 울프슨 가족 자선 신탁, 헬렌과 Biomolecular 구조 및 조립에 밀튼 A. Kimmelman 센터, Shlomo와 사빈 Beirzwinsky의 부동산, Meil​​ 드 Botton 앤슬리, 그리고 카렌 심, 영국.

References

  1. Ruotolo, B. T. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes. Nat Protoc. 3, (7), 1139-1152 (2008).
  2. Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements. Rapid Commun Mass Spectrom. 22, (20), 3297-3304 (2008).
  3. Smith, D. P. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15, (2), 113-130 (2009).
  4. Leary, J. A. Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors. J Am Soc Mass Spectrom. 20, (9), 1699-1706 (2009).
  5. Lorenzen, K. Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly. J Mol Biol. 379, (2), 385-396 (2008).
  6. Pukala, T. L. Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements. Structure. 17, (9), 1235-1243 (2009).
  7. van Duijn, E. Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry. J Am Chem Soc. 131, (4), 1452-1459 (2009).
  8. Ruotolo, B. T. Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water. Science. 310, (5754), 1658-1661 (2005).
  9. Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. Aspects of native proteins are retained in vacuum. Curr Opin Chem Biol. 10, (5), 402-408 (2006).
  10. Giles, K. Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 18, (20), 2401-2414 (2004).
  11. McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes. J Am Chem Soc. 128, (35), 11433-11442 (2006).
  12. Ruotolo, B. T. Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes. Angew Chem Int Ed Engl. 46, (42), 8001-8004 (2007).
  13. Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 27, (6), 575-595 (2008).
  14. Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections. J Am Soc Mass Spectrom. 10, (11), 1188-1211 (1999).
  15. Mesleh, M. F. Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential. J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).
  16. Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics