सह - संस्कृति के मॉडल Pseudomonas aeruginosa Biofilms लाइव मानव Airway कक्ष पर बढ़ी

Immunology and Infection

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Summary

इस कागज बढ़ रही है की विभिन्न विधियों का वर्णन

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Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. A., Anderson, G. G. Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells. J. Vis. Exp. (44), e2186, doi:10.3791/2186 (2010).

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Abstract

बैक्टीरियल biofilms विभिन्न मानव रोगों की एक संख्या के साथ संबद्ध किया गया है, लेकिन biofilm विकास आम तौर पर गैर रहने वाले सतहों पर अध्ययन किया गया है है. इस पत्र में, हम मानव airway उपकला कोशिकाओं (CFBE सेल) संस्कृति में विकसित पर बनाने Pseudomonas aeruginosa biofilms के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन . पहली विधि (स्टेटिक Biofilm सह संस्कृति मॉडल करार दिया) पी. aeruginosa CFBE मानक टिशू कल्चर प्लेटों पर मिला हुआ monolayers के रूप में विकसित कोशिकाओं के साथ incubated है. हालांकि जीवाणु काफी उपकला कोशिकाओं को विषाक्त है, arginine देरी monolayer के विनाश के अलावा काफी लंबे समय CFBE कोशिकाओं पर biofilms के लिए फार्म करने के लिए. दूसरा (फ्लो सेल Biofilm सह संस्कृति मॉडल करार दिया) विधि, एक biofilm प्रवाह सेल तंत्र, है जो अक्सर में biofilm, अनुसंधान प्रयोग किया जाता है एक गिलास CFBE कोशिकाओं के एक मिला हुआ monolayer समर्थन coverslip समायोजित के अनुकूलन शामिल है. इस monolayer पी. साथ inoculated है aeruginosa और एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप फिर कोशिकाओं भर में ताजा माध्यम से बहती है . दोनों प्रणालियों में, जीवाणु biofilms टीका के बाद 6-8 घंटे के भीतर के रूप में. Biofilm के विज़ुअलाइज़ेशन पी. के उपयोग के द्वारा बढ़ाया है aeruginosa उपभेदों constitutively हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त. स्टेटिक और फ्लो सेल सह संस्कृति Biofilm assays जल्दी पी. के लिए मॉडल प्रणाली सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF), फेफड़े, और इन तकनीकों का aeruginosa संक्रमण पी. के विभिन्न पहलुओं की अनुमति aeruginosa biofilm गठन और डाह biofilm cytotoxicity, biofilm CFU की माप, और धुंधला हो जाना और visualizing biofilm सहित अध्ययन करने के लिए,.

Protocol

1. स्टेटिक Biofilm सह संस्कृति मॉडल

  1. स्टेटिक Biofilm सह संस्कृति मॉडल 1 CFBE41o (CFBE कोशिकाओं) कोशिकाओं है, जो मूल रूप से ΔF508 CFTR 2,3,4 उत्परिवर्तन के लिए सीएफ़ homozygous के साथ एक व्यक्ति से विकसित कोशिकाओं को अमर कर रहे हैं का उपयोग करता है. CFBE कोशिकाओं / 6 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति की थाली या न्यूनतम आवश्यक माध्यम से 24 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति प्लेट (सदस्य) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक x 10 5 2 में अच्छी तरह से 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता में वरीयता प्राप्त होना चाहिए , एल glutamine 2mm, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 50 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन. हम 6 अच्छी तरह प्लेटें और अच्छी तरह से प्रति 24 अच्छी तरह प्लेटें में 0.5 एमएल मध्यम में अच्छी तरह से प्रति 1.5 एमएल माध्यम का उपयोग करें.
  2. कक्ष 37 में विकसित किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस और 5% 7-10 दिनों के लिए -95% 2 हवा सीओ बैक्टीरिया के साथ टीका पहले मिला हुआ monolayer फार्म . मध्यम हर 2-3 दिन बदल चाहिए. इन स्थितियों के लिए मिला हुआ monolayer और तंग जंक्शनों के गठन के लिए नेतृत्व करने के लिए दिखाया गया है.
  3. 18 घंटे के लिए 5 एमएल लेग में 37 पर आगे बढ़ें पी. aeruginosa ° C 200 rpm पर एक इनक्यूबेटर हिलनेवाला. इन शर्तों के तहत पी. aeruginosa संस्कृतियों आमतौर पर 5x10 9 CFU / एमएल के एक घनत्व तक पहुंच जाएगा.
  4. जीवाणु टीका के लिए, CFBE कोशिकाओं से मध्यम हटाने और phenol के लाल के बिना एक सदस्य के बराबर मात्रा, 2 एल glutamine मिमी (माइक्रोस्कोपी मध्यम) के साथ पूरक जोड़ें. मिला हुआ CFBE monolayers पी. साथ inoculated हैं CFBE मूल वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या में लगभग 30:1 रिश्तेदार के संक्रमण की बहुलता में aeruginosa. यह 10 एक्स 7 CFU / एमएल / 1.5 एमएल सदस्य में अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह प्लेटें और 1.2 एक्स 10 7 CFU / एमएल / 0.5 एमएल सदस्य में के लिए अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह प्लेटें लिए 2 करने के लिए equates.
  5. 1 घंटे के लिए 37 प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस और 5% 2% -95 हवा सीओ.
  6. 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, सतह पर तैरनेवाला और हटाया जाना चाहिए ताजा माइक्रोस्कोपी 0.4% arginine के साथ पूरक मध्यम के साथ प्रतिस्थापित.
  7. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस और 5% विभिन्न समय अंक (अप करने के लिए लगभग 8 घंटे) के लिए -95% 2 हवा सीओ और CFBE चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग monolayer की अखंडता का विश्लेषण. यदि airway कोशिकाओं गैर मिला हुआ है पी. aeruginosa तेजी से (मिनट के भीतर) कोशिकाओं की basolateral सतह के लिए पहुँच प्राप्त होगा और सेलुलर अखंडता को नष्ट . पी. के साथ टीका aeruginosa उपभेदों कि constitutively फ्लोरोसेंट biofilm microcolonies जो epifluorescence या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized किया जा सकता है में GFP परिणाम व्यक्त .
  8. biofilm में जीवाणु CFU सह संस्कृति फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) के साथ 2-3 बार धोने planktonic बैक्टीरिया को खत्म करने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. धोने के बाद 0.1% के साथ इलाज ट्राइटन पीबीएस या सदस्य में 10-15 मिनट के लिए एक्स 100 उपकला कोशिकाओं lyse और biofilm फैलाने.
  9. 3 मिनट के लिए भंवर और lysate के धारावाहिक dilutions तैयार. प्लेट इन dilutions लेग अगर पर और 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस CFU निर्धारित है, कालोनियों अगले दिन की गणना.

2. फ्लो सेल Biofilm सह संस्कृति मॉडल

  1. फ्लो सेल Biofilm सह संस्कृति मॉडल (प्रवाह परख) मानक biofilm प्रवाह सेल तंत्र के संशोधन शामिल है CFBE कोशिकाओं 5 समायोजित .
  2. एक स्वच्छ 100 एमएल बीकर में कई 40 मिमी व्यास कांच coverslips रखें. कवर और 20 मिनट के लिए सूखी चक्र पर एल्यूमीनियम पन्नी आटोक्लेव के 2 परतों के साथ कसकर.
  3. एक सेल संस्कृति हुड में कार्य, एक बाँझ व्यास 60 मिमी प्लास्टिक पकवान में इथेनॉल धोया संदंश और जगह का उपयोग कर बीकर से बाँझ coverslip हड़पने.
  4. पूर्व गर्म सेल के विकास के माध्यम से 3 एमएल जोड़ें, पिपेट की नोक के साथ coverslip पर दबाने के लिए किसी भी नीचे फंस बुलबुला हटाने और प्लास्टिक पकवान के नीचे करने के लिए coverslip बल.
  5. बीज 2x10 पकवान प्रति 6 कोशिकाओं और पकवान धीरे आगे और पीछे हिला. पकवान के पक्ष के खिलाफ कोशिकाओं centrifuging को रोकने घूमता से बचें.
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ -95 2% हवा इनक्यूबेटर में पकवान प्लेस और कोशिकाओं को हर दूसरे दिन 3 एमएल 8 से 10 दिनों के लिए ताजा मध्यम विकास के साथ फ़ीड. कोशिकाओं कांच coverslip पर मिला हुआ monolayer फार्म जाएगा.
  7. पी. आगे बढ़ें 18 घंटे के लिए 5 एमएल लेग में 37 पर aeruginosa ° 200 rpm पर एक मशीन हिलनेवाला पर सी. इन शर्तों के तहत पी. aeruginosa संस्कृतियों आमतौर पर 5x10 9 CFU / एमएल के एक घनत्व तक पहुंच जाएगा. हम पी. उपयोग aeruginosa तनाव PAO1 GFP के 6 विधान अभिव्यक्ति के लिए pSMC21 प्लाज्मिड ले जाने .
  8. एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में जीवाणु संस्कृति के 1 एमएल जोड़ें. 3 मिनट के लिए 6000 rpm पर अपकेंद्रित्र, और बैक्टीरियल गोली माइक्रोस्कोपी माध्यम से 1 एमएल में दो बार धोने.
  9. 4.5 एमएल माइक्रोस्कोपी मध्यम में धोया और resuspended बैक्टीरिया की 0.5 एमएल पतला ~ 5x10 8 CFU / एमएल के एक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए.
  10. जीवित कोशिकाओं का अवलोकनवास्तविक समय में एक इमेजिंग चैम्बर एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (समय की विस्तारित लंबाई के लिए पोषक तत्वों की एक प्रवाह को सुनिश्चित करने) और एक तापमान नियंत्रक करने के लिए युग्मित की आवश्यकता है. हम Bioptechs (Focht लाइव - सेल) 1 / 16 के साथ एक कम प्रवाह माइक्रो छिड़काव पंप वें सी फ्लेक्स टयूबिंग कटौती जुड़ा और बाँझपन के लिए उचित लंबाई करने के लिए autoclaved चैम्बर FCS2, तापमान और FCS2 कक्ष नियंत्रक के माध्यम से विनियमित का उपयोग करें. हम एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी सही खुर्दबीन के लिए अगले स्थित स्नान में इनपुट माध्यम के स्रोत रहते हैं.
  11. प्रवाह चैम्बर इकट्ठा. FCS2 चैम्बर एक आत्म - लॉकिंग (जो इमेजिंग के दौरान मंच एडाप्टर पर बैठता है) आधार है और एक ऊपरी आधा छिड़काव ट्यूब और कक्ष नियंत्रक से जुड़ा शामिल हैं. चैम्बर उल्टा खत्म रूप से फ़्लिप किया जा रहा से पहले इकट्ठा किया है और मंच एडाप्टर पर रखा. कक्ष के ऊपरी आधे उल्टा इसलिए कि छिड़काव ट्यूब दिखाई दे रहे हैं पकड़ो, और छिड़काव ट्यूब पर 0.75 मिमी मोटी रबर गैसकेट की निकासी छेद संरेखित करें. Microaqueduct रबर गैसकेट के शीर्ष पर चैम्बर के साथ प्रदान की है, सुनिश्चित करने के grooved पक्ष स्लाइड ढेर, और स्लाइड के शीर्ष पर एक रबर गैसकेट जगह. मोटाई और इस दूसरी पाल बांधने की रस्सी के आंतरिक ज्यामिति के चैम्बर की मात्रा का निर्धारण करेगा. हम आम तौर पर एक 30 मिमी दौर आंतरिक ज्यामिति के साथ एक 0.75 एमएम मोटी रबर गैसकेट के साथ काम करते हैं.
  12. 1 के एमएल जोड़ें पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पर स्लाइड के केंद्र में माइक्रोस्कोपी मध्यम.
  13. सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर से एक 60 मिमी पकवान पुन: प्राप्त करने के लिए, खर्च मध्यम हटाने और कोशिकाओं पूर्व गर्म माइक्रोस्कोपी के माध्यम से 3 एमएल के साथ एक बार धोने. यह कदम phenol लाल और एंटीबायोटिक दवाओं सेल के विकास के माध्यम में मौजूद के उन्मूलन सुनिश्चित करता है. Phenol लाल हल्का फ्लोरोसेंट है और इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जबकि एंटीबायोटिक दवाओं पी. उन्मूलन कर सकते हैं aeruginosa बैक्टीरिया से पहले वे biofilms स्थापित कर सकते हैं.
  14. इथेनॉल धोया संदंश का प्रयोग, पकवान से coverslip पुनः प्राप्त करने और यह माइक्रोस्कोपी कक्ष पर रखा मध्यम के मनका पर उल्टा कम. coverslip अब दूसरा रबर गैसकेट पर आराम कर रहा है और airway कोशिकाओं के monolayer नीचे का सामना करना पड़ रहा है.
  15. एक हाथ में घटकों को इकट्ठा होल्डिंग, ढेर के शीर्ष पर चैम्बर के आधार जगह है, और तेजी से अधिक कक्ष बारी इतना है कि सब कुछ सही पक्ष है. जगह में अंगूठी बदल कर आधार लॉक.
  16. माइक्रो छिड़काव पंप कम प्रवाह करने के लिए प्रवेश ट्यूब कनेक्ट और 20 एमएल / घंटे की दर में प्रवाह शुरू, इस प्रवाह की दर पी. के स्विमिंग गति की क्षमता के भीतर है aeruginosa. टयूबिंग लिंक का एक दूसरा टुकड़ा माइक्रोस्कोपी 37 में रखा मध्यम के एक फ्लास्क पंप डिग्री सेल्सियस पानी स्नान सही खुर्दबीन के लिए अगले स्थित है.
  17. चैम्बर के इनलेट आउटलेट छिड़काव ट्यूब बाँझ पूर्व में कटौती 1 / 16 वें टयूबिंग संलग्न सी - फ्लेक्स, तापमान नियंत्रक कनेक्ट करने के लिए, तो एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की खुर्दबीन मंच पर इकट्ठे चैम्बर जगह.
  18. एक 1 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज का प्रयोग, कक्ष में पहले से तैयार जीवाणु निलंबन इंजेक्षन, एक दो तरह पंप और कक्ष के बीच लाइन में रखा वाल्व का उपयोग. हमारे विशेष सेटिंग में, यह जीवाणु निलंबन के 0.6 एमएल मात्रा लेता कक्ष तक पहुँचने. अपने विशेष टयूबिंग की लंबाई के अनुसार इस मात्रा को समायोजित करें. हम भी यह करने के लिए एक लाइन डिस्पोजेबल 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर पंप और दो तरह के अपस्ट्रीम में तैराकी और इनपुट फ्लास्क contaminating से बैक्टीरिया को रोकने के वाल्व के बीच जगह करने के लिए उपयोगी पाते हैं.
  19. बैक्टीरिया airway कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं, 2 के लिए पंप बंद करो. प्रवाह तो प्रयोग के आराम के लिए reinitiated और 20 एमएल / ज पर बनाए रखा जा सकता है.
  20. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रयोग भर माइक्रोस्कोपी द्वारा airway कोशिकाओं की अखंडता मॉनिटर monolayer के लिए नुकसान का संकेत के लिए जाँच. इसके साथ ही, GFP लेबल पी. के विकास का पालन करें एक औंधा confocal या व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ छवियों को प्राप्त करके airway कोशिकाओं के शिखर सतह पर aeruginosa biofilms .

3. प्रतिनिधि परिणाम

हम पी. के एक तनाव का उपयोग करें aeruginosa pSMC21 प्लाज्मिड जो GFP के 6 विधान अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता युक्त. इस कारण से, GFP लेबल CFBE monolayer पर बढ़ती biofilms epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, biofilm के दृश्य unlabeled पी. धुंधला हो जाना द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ° 37 सी 1 में 1 घंटे के लिए एक 1% calcofluor सफेद समाधान के साथ aeruginosa .

इमेजिंग CFBE कोशिकाओं पर प्रवाह परख में biofilm गठन के लिए, हम एक मंच कस्टम निर्मित अनुकूलक का उपयोग करते हैं, लेकिन कई कंपनियों को अब विशेष रूप से सज्जित मंच एडेप्टर प्रदान कर सकते हैं. हम एक ओलिंप IX70 उल्टे ORCA-एजी गहरी ठंडा सीसीडी कैमरा और एक X60 उद्देश्य तेल विसर्जन (संख्यात्मक एपर्चर 1.40) के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के साथ काम करते हैं. फिल्टर wएड़ी 480/40 एनएम बैंड पास उत्तेजना फिल्टर और एक 535/30 एनएम बैंड पास उत्सर्जन फिल्टर के साथ सुसज्जित है. डिजिटल छवियों OpenLab 4.0.3 सॉफ्टवेयर पैकेज (कामचलाऊ व्यवस्था) के साथ हासिल किया गया और मात्रा बहाली पुनरावृत्त Volocity 3.5.1 सॉफ्टवेयर कामचलाऊ व्यवस्था () का उपयोग द्वारा deconvolved थे. 3D biofilm संरचनाओं के मात्रात्मक विश्लेषण COMSTAT छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज 7,8 के साथ हासिल की थी .

किसी भी सह संस्कृति माना मॉडल के लिए एक मॉडल के घटकों के बीच विकासशील cytotoxicity के लिए विशेष ध्यान देना चाहिए. दोनों स्थिर और प्रवाह कक्ष assays, हमने पाया कि CFBE monolayer पी. की उपस्थिति का सामना कर सकता टीका के बाद 8 घंटे तक के किसी भी हस्ताक्षर के बिना परिवर्तन के लिए aeruginosa. उपकला monolayer अखंडता चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी एक औंधा 1 खुर्दबीन (चित्रा 1 ए) का उपयोग या अंतर 5 प्रयोग भर में हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (डीआईसी) द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. समय के साथ पी. aeruginosa विषाक्त पदार्थों और डाह कारक हैं जो जमा और उपकला कोशिका monolayer पूरी तरह से या वर्गों में (चित्रा 1B-1C) को नुकसान पहुंचा सकता है उत्पादन होगा . Cytotoxicity मात्रात्मक विभिन्न किट का उपयोग कर उपकला कोशिकाओं से लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) की रिहाई के उपाय करने के लिए मूल्यांकन कर सकते हैं. LDH एक स्थिर साइटोसोलिक एंजाइम सेल lysis या कोशिका मृत्यु पर बाह्य वातावरण में जारी है.

जब airway monolayer की अखंडता समझौता नहीं किया है (आमतौर पर ~ 8 घंटे निम्नलिखित टीका के लिए) पी. aeruginosa biofilms सफलतापूर्वक फार्म और दोनों सह संस्कृति में वर्णित मॉडल (चित्रा 2A-2B) में airway कोशिकाओं के शिखर सतह पर विकसित कर सकते हैं . 3D पुनर्निर्माण (चित्रा -2 सी) और मात्रा का ठहराव के बाद, बायोमास संचय सही निर्धारित किया जा सकता है. हम भी कई प्ररूपी assays में इन सह संस्कृति biofilms इस्तेमाल किया. उदाहरण के लिए, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, biofilm CFU आसानी से उपकला कोशिकाओं lysing द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, अगर प्लेटों पर serially lysate, और चढ़ाना गिराए. हम इस तकनीक एंटीबायोटिक उपचार के लिए अलग अलग उपभेदों के प्रतिरोध का निर्धारण करने में लाभप्रद पाया है. इसके अलावा, उपकला कोशिकाओं की ओर biofilm विषाक्तता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध LDH पता लगाने किट का उपयोग करके मापा जा सकता है. इस तरीके में, biofilms की विषाक्तता में विषैलापन कारकों की भूमिका का मूल्यांकन किया जा सकता है है. ये मॉडल प्रणाली भी प्रमोटर संलयन अध्ययन, RT-पीसीआर, और माइक्रोएरे विश्लेषण 1,5,9 सहित, जीन अभिव्यक्ति अनुप्रयोगों के एक नंबर का समर्थन करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. CFBE कोशिकाओं की और प्रतिनिधि छवियों के monolayer समझौता और क्षतिग्रस्त airway सेल पी. करने के लिए कारण monolayers aeruginosa biofilm विकास (ए) CFBE टिशू कल्चर प्लेटों में विकसित कोशिकाओं का एक मिला हुआ monolayer के प्रतिनिधि छवि चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन. स्केल बार, 120 सुक्ष्ममापी. (बी) एक समझौता CFBE monolayer का उदाहरण है. हालांकि monolayer की क्षति के स्पष्ट लक्षण दिखाई अभी तक प्रदर्शित नहीं करता है पी. aeruginosa बैक्टीरिया उपकला कोशिकाओं और पाने basolateral झिल्ली के लिए उपयोग की तंग जंक्शनों के बीच फैल देखा जाता है . Biofilm गठन आम तौर पर इन बिगड़ती monolayer के कारण शर्तों के तहत हासिल नहीं है. स्केल बार, 20 सुक्ष्ममापी. (सी) एक ऊंचा हो गया पी. के उदाहरण aeruginosa biofilm 24 घंटे बाद टीका मनाया. सफलतापूर्वक biofilm गठन का समर्थन करने के बाद, CFBE monolayer मरम्मत के परे क्षतिग्रस्त हो गया था और अब लगभग अनुपस्थित है. अवशिष्ट biofilm बैक्टीरिया के एक फ्लैट परत के रूप में बढ़ रही है, कांच coverslip करने के लिए संलग्न करने के लिए दिखाया गया है. स्केल बार, 20 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 2
चित्रा 2 पी.. aeruginosa biofilms मिला हुआ CFBE स्टेटिक Biofilm सह संस्कृति मॉडल और फ्लो सेल Biofilm सह संस्कृति मॉडल का उपयोग कोशिकाओं के शिखर सतह से बढ़ी. (ए) एक GFP-व्यक्त पी. के प्रतिनिधि छवि aeruginosa biofilm CFBE स्टेटिक Biofilm सह संस्कृति मॉडल epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन का उपयोग कोशिकाओं का एक मिला हुआ monolayer पर हो . छवि चरण विपरीत चैनल और प्रतिदीप्ति चैनल के एक उपरिशायी है. स्केल बार, 35 सुक्ष्ममापी. (बी) के प्रतिनिधि छवि एक GFP लेबल पी. aeruginosa biofilm CFBE फ्लो सेल Biofilm सह संस्कृति मॉडल का उपयोग कोशिकाओं का एक मिला हुआ monolayer पर 6 घंटे के लिए हो. Airway monolayer के दृश्य की सुविधा के लिए, नाभिक 10 μg / एमएल Hoechst 33342 (आण्विक जांच) के साथ 30 पी. के साथ टीका करने से पहले मिनट के लिए दाग थे aeruginosa. विलय और pseudocolored छवियों अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) द्वारा देखा गया है, और इसी फ्लोरोसेंट चित्र दिखाया जाता है. Biofilms, हरी clumps CFBE कोशिकाओं के शिखर सतह को संलग्न के रूप में पेश, airway कोशिकाओं भर में बिखरे हैं. स्केल बार, 20 सुक्ष्ममापी. (सी) तीन आयामी reconstrucz-श्रृंखला छवि 6 घंटे पुराने पी. के विशिष्ट मशरूम संरचनाओं की तरह दिखा ढेर के tion aeruginosa biofilms एक CFBE सेल monolayer पर गठन. स्केल बार, 10 सुक्ष्ममापी.

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Discussion

Biofilms बैक्टीरिया के समुदायों है कि पर्यावरण stimuli करने के लिए प्रतिक्रिया में फार्म हैं. ये पर्यावरण संकेतों प्रत्येक जीवाणु के भीतर वैश्विक विनियामक परिवर्तन, एक सतह, एकत्रीकरण, exopolysaccharides के उत्पादन, और वृद्धि की एंटीबायोटिक प्रतिरोध 10 के रूप में अन्य phenotypes के लिए बाध्य करने में जिसके परिणामस्वरूप करने के लिए सीसा. दशकों के पिछले कुछ अधिक है, ज्यादा सबूत परिकल्पना है कि biofilms पुराने संक्रमण के रोगजनन में एक बड़ी भूमिका निभा समर्थित है. उदाहरण के लिए, यह अच्छी तरह से स्वीकार किया है कि पी. aeruginosa पुराने संक्रमण के लिए सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों (CF) के फेफड़ों में 11 biofilms बनाने के द्वारा स्थापित करने में सक्षम है. सीएफ़ एक आनुवंशिक विकार है, जहां CFTR जीन में उत्परिवर्तन अनुचित क्लोराइड 12 स्राव के लिए नेतृत्व है . सीएफ़ रोगियों को आम तौर पर airway फिजियोलॉजी वायुमार्ग में मोटी बलगम प्लग करने के लिए अग्रणी और समवर्ती माइक्रोबियल संक्रमण के 13 के लिए बदल अनुभव. देर से किशोरावस्था से, सीएफ़ वायुमार्ग हावी संक्रामक एजेंट पी. aeruginosa, एक पुरानी biofilm संक्रमण है कि 14 एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी है के लिए अग्रणी.

इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल रहने वाले फेफड़ों की कोशिकाओं पर biofilm गठन के अध्ययन के लिए मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करने के लिए विकसित किया गया है. बैक्टीरियल biofilms कई रोग राज्यों में फंसा रहे हैं और अभी तक, ज्यादातर गैर रहने वाले के रूप में ठोस सतहों, कांच और प्लास्टिक 15,16 पर अध्ययन किया गया है. Biofilm गठन और अजैव सतहों पर ही विकास का अध्ययन करके, एक रोगज़नक़ और मेजबान है कि केवल ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक मॉडल प्रणाली के साथ हो सकता है के बीच महत्वपूर्ण बातचीत याद आ रही है. विशेष रूप से, स्टेटिक Biofilm सह संस्कृति मॉडल और फ्लो सेल Biofilm सह संस्कृति मॉडल पी. की क्षमता का लाभ ले लो aeruginosa के साथ बातचीत करने के लिए और फेफड़ों की उपकला सतह करने के लिए बाध्य है. इन मॉडलों का उपयोग करना, हम पता चला है कि सह संस्कृति biofilms के एंटीबायोटिक उपचार के जवाब में अद्वितीय है और है कि इन मॉडलों के लिए सही संक्रामक 1,5 राज्य को प्रतिबिंबित की संभावना है. इस संबंध में, हम रिपोर्ट है कि> द्वारा tobramycin बढ़ जाती है के लिए प्रतिरोध 25 गुना पी. जब aeruginosa biofilms airway 5 कांच जैसे अजैव सतहों पर हो biofilms के लिए तुलना में कोशिकाओं पर बड़े हो रहे हैं . यह संभावना है कि इन तकनीकों की घटनाओं है कि फेफड़ों 17 के प्रारंभिक उपनिवेशण के दौरान होते हैं प्रतिबिंबित. इसलिए, सह संस्कृति मॉडल प्रणाली पी. द्वारा सीएफ़ airway उपकला के जल्दी संक्रमण को समझने के लिए नवीन उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं 1 aeruginosa.

टिशू कल्चर प्रणाली आमतौर पर मेजबान और रोगज़नक़ के बीच बातचीत को समझने के लिए नियोजित किया गया है. हम इन मुलाकातों में ले लिया है एक कदम आगे रहते मानव उपकला कोशिकाओं पर biofilms बनाने के द्वारा. भविष्य में, मॉडल की संशोधित संस्करण यहाँ वर्णित संभावित अन्य संक्रामक राज्यों में विभिन्न जीवाणुओं की biofilm गठन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम मार्गदर्शन और सुझावों के लिए इन मॉडलों को विकसित करने में जी हे Toole धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (ANDERS06F0 GGA STANTO07RO, और बास के लिए STANTO08GA करने के लिए), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (T32A107363 GGA और बास R01-HL074175) के द्वारा समर्थित किया गया था, और अनुसंधान संसाधन केंद्र के लिए जैव चिकित्सा अनुसंधान उत्कृष्टता के लिए राष्ट्रीय केन्द्र (बास P20-RR018787 Cobre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FCS2 (Focht Live-Cell) chamber Bioptechs 060319131616
FCS2 chamber controller Bioptechs 060319-2-0303
40 mm glass coverslips Bioptechs PH 40-1313-0319
MEM Mediatech, Inc. #10-010-CV
MEM without phenol red Mediatech, Inc. Mediatech, Manassass, VA

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References

  1. Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
  2. Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
  3. Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
  4. Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
  5. Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
  6. Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
  7. Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146, (Pt 10), 2409-2415 (2000).
  8. Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  9. Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
  10. Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
  11. Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, Suppl 2. 49-54 (2005).
  12. Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
  13. Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
  14. Furukawa, S., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
  15. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
  16. O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
  17. Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).

Comments

4 Comments

  1. HI thanks for this video it was really great. I was wondering if you have tried using A549 cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 12:28 PM
  2. Not to my knowledge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 5:27 PM
  3. Can this system be used to study effect of various antibiotics on P.
    aeruginosa biofilm formation

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2011 - 11:14 PM
  4. Yes, and we have done so (see references #1 and #5 of the protocol).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 8, 2011 - 1:42 PM

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