सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़े में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और स्टेफिलोकोकस ऑरियस बायोफिल्म्स के एक पूर्व वीवो मॉडल में एंटीबायोटिक प्रभावकारिता परीक्षण

यह विधि आपको एक ऐसे वातावरण में बैक्टीरिया विकसित करने की अनुमति देती है जो समान सेल फिजियोलॉजी और बायोफिल्म आकृति विज्ञान को ट्रिगर करता है जिसे आप सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़ों के संक्रमण में देखते हैं। फेफड़े मांस उद्योग में एक अपशिष्ट उत्पाद हैं, इसलिए कोई नैतिक चिंताएं नहीं हैं । मॉडल एक जीवित पशु मॉडल की आवश्यकता के बिना मानव संक्रमण की नकल करने के लिए एक मंच प्रदान करता है।

यह तकनीक शोधकर्ताओं को सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़ों में बनने वाली बायोफिल्म्स में प्रवेश करने और नष्ट करने की क्षमता के लिए उम्मीदवार दवाओं को स्क्रीन करने का एक नया तरीका देती है। आगे के विकास और सत्यापन के साथ, हम मानते हैं कि ईवीपीआर मॉडल में विशेष और व्यक्तिगत एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के लिए संभावित उपयोग हो सकता है। वध के तुरंत बाद फेफड़ों को प्राप्त करें और उन्हें घरेलू शांत बॉक्स में प्रयोगशाला में ले जाएं।

एक निष्फल सतह पर और एक लौ के नीचे काम करें। फेफड़ों को ऑटोक्लेव एल्यूमीनियम फॉयल से ढके एक साफ प्लास्टिक चॉपिंग बोर्ड पर रखें, और जांच करें कि ब्रोंकिओल्स बरकरार रहें। यदि बूचड़खाने में या परिवहन के दौरान कोई नुकसान हुआ है तो फेफड़े उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हैं।

एक लौ के नीचे एक फूस चाकू गर्म करें और ऊतक की सतह को निष्फल करने के लिए ब्रोंकियोल के आसपास के फेफड़ों के क्षेत्र में चाकू को बहुत संक्षेप में स्पर्श करें। एक बाँझ घुड़सवार रेजर ब्लेड का उपयोग कर ब्रोंकियोल के आसपास की सतह के ऊतकों को काट लें, जिससे किसी भी क्षति को रोकने के लिए ब्रोंकियोल के समानांतर चीरे बन जाएं। एक बार ब्रोंकिओल उजागर हो जाने के बाद, उच्चतम बिंदु पर ब्रोंकिओल के माध्यम से क्रॉस-सेक्शनल चीरा बनाएं।

बाँझ संदंश का उपयोग करना, हल्के से ब्रोंकिओल के मुक्त अंत पकड़ और दूर एक बाँझ घुड़सवार रेजर ब्लेड का उपयोग कर किसी भी शेष अवांछित ऊतक काट । फेफड़ों से ब्रोंकियोल को हटाने के लिए किसी भी ब्रांचिंग दिखाई देने से पहले ब्रोंकिओल में अंतिम क्रॉस-सेक्शनल चीरा बनाएं। पहले डीएमईएम आरपीएमआई 1640 वॉश में ब्रोंकिओल रखें।

योजनाबद्ध प्रयोग के लिए पर्याप्त ऊतक वर्गों को उपज देने के लिए इसे एक ही फेफड़े से ब्रोंकियोल के अतिरिक्त वर्गों को धोने और फसल में छोड़ दें। एक ही फेफड़े से किसी भी अतिरिक्त ब्रोंकिओलर वर्गों को धोने में रखें और उन्हें कम से कम दो मिनट के लिए धोने में छोड़ दें। पहले धोने से ब्रोंकिओल्स निकालें, और नमूनों को बाँझ पेट्री डिश में रखें।

प्रत्येक ब्रोंकियोल को बाँझ संदंश के साथ हल्के से पकड़ें, ऊतक को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखें। जितना संभव हो उतना शेष नरम ऊतक निकालें, और बाँझ विच्छेदन कैंची का उपयोग करके ऊतक को पांच मिलीमीटर-चौड़ी स्ट्रिप्स में काट लें। दूसरे DMEM RPMI 1640 धोने में bronchiolar ऊतक स्ट्रिप्स के सभी प्लेस।

उन्हें कम से कम दो मिनट के लिए धोने में छोड़ दें, फिर बाँझ संदंश का उपयोग करके दूसरे धोने से ऊतक स्ट्रिप्स को हटा दें और उन्हें एक साफ, बाँझ पेट्री डिश में रखें। ब्रोंकिओल से जुड़े किसी भी शेष नरम ऊतक को हटा दें, और बाँझ विच्छेदन कैंची का उपयोग करके स्ट्रिप्स को वर्गों में काट लें। तीसरा डीएमईएम आरपीएमआई 1640 पेट्री डिश में धोएं और डिश को घूमता हुआ धोने में टिश्यू पीस को हल्के से मिलाएं।

टिश्यू के टुकड़ों को हटाए बिना पेट्री डिश से तीसरा वॉश बाहर डालें। फिर अंतिम एससीएफएम वॉश जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी ऊतक टुकड़े कवर किए गए हैं। यूवी लाइट के तहत एससीएफएम में टिश्यू को पांच मिनट के लिए स्टरलाइज करें।

एससीएफएम एगरैंजर पैड युक्त 24-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में प्रत्येक निष्फल ब्रोंकिओलर ऊतक टुकड़े को स्थानांतरित करने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें। वांछित जीवाणु तनाव के साथ प्रत्येक ऊतक टुकड़े को संक्रमित करने के लिए, एक बाँझ 0.5 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज से जुड़ी 29 गेज सुई की नोक के साथ एक आगर प्लेट पर उगाई गई कॉलोनी को स्पर्श करें, फिर कॉलोनी को ऊतक टुकड़े पर स्पर्श करें, धीरे-धीरे सतह को चुभते रहें। असंक्रमित नियंत्रण के लिए, धीरे-धीरे सुई की नोक के साथ ऊतक टुकड़े की सतह को चुभते हैं, फिर प्रत्येक अच्छी तरह से एससीएफएम के 500 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।

10 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश के तहत प्रत्येक 24-अच्छी प्लेट के लिए एक सांस सीलिंग झिल्ली को स्टरलाइज करें। 24-अच्छी प्लेट से ढक्कन निकालें और इसे सांस की झिल्ली से बदलें, फिर प्लेटों को बिना हिलाए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कम से कम दो स्वतंत्र फेफड़ों से फेफड़ों के टुकड़ों के दोहराने सेट की स्थापना, एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक सेट का उपयोग कर, और एंटीबायोटिक के प्रत्येक एकाग्रता के प्रति एक सेट का परीक्षण किया जाएगा।

इनक्यूबेशन के 48 घंटे के बाद, नेत्रहीन अंतर्जात बैक्टीरिया के विकास के लिए असंक्रमित ऊतक टुकड़ों का निरीक्षण करते हैं, जिससे इन वर्गों के आसपास के माध्यम को टर्बिड हो जाएगा। यदि चयनित अध्ययन प्रजातियों की विशिष्ट वृद्धि देखी जाती है, तो ताजा फेफड़ों के साथ प्रयोग को पुनः आरंभ करें। यदि असंक्रमित ऊतक अनुभाग कोई भी या न्यूनतम बैक्टीरियल विकास नहीं दिखाते हैं, तो १ २४-अच्छी तरह से वॉश प्लेट और एक 24-अच्छी तरह से उपचार प्लेट तैयार करें।

उपचार प्लेट के प्रत्येक कुएं में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना, या ब्याज की एंटीबायोटिक के साथ ताजा एससीएफएम के 500 माइक्रोलीटर शामिल होने चाहिए। लौ-निष्फल संदंश के साथ इनक्यूबेशन प्लेट से प्रत्येक संक्रमित ऊतक टुकड़ा निकालें। किसी भी गैर-बायोफिल्म से जुड़े बैक्टीरियल कोशिकाओं को हटाने और उपचार प्लेट के उचित कुएं में स्थानांतरित करने के लिए वॉश प्लेट के एक ताजा कुएं में इसे संक्षेप में भंवर करें।

एक ताजा सांस झिल्ली के साथ उपचार की थाली सील, तो 18 से 24 घंटे के लिए मिलाते हुए बिना ३७ डिग्री सेल्सियस पर यह इनक्यूबेट । 24-अच्छी प्लेट से प्रत्येक फेफड़ों के टुकड़े को हटाने के लिए लौ-निष्फल संदंश का उपयोग करें, और इसे एक बाँझ दो मिलीलीटर समरूपता ट्यूब में डालें जिसमें पीबीएस का एक मिलीलीटर और धातु के एक ग्राम मोती होते हैं। मनका प्रति सेकंड चार मीटर पर ४० सेकंड के लिए हराया ।

पीबीएस का उपयोग करके फेफड़ों के समरूप को क्रमिक रूप से पतला करें, और व्यक्तिगत, अनुपचारित और एंटीबायोटिक-इलाज ऊतक टुकड़ों में कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों को निर्धारित करने के लिए इसे एलबी एगर पर प्लेट करें। जब पूर्व वीवो सुअर फेफड़े या EVPL में उगाया जाता है, तो पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस की बायोफिल्म्स मानक, उद्योग-अनुमोदित शोरबा MIC और डिस्क में मानक मीडिया का उपयोग करके संवेदनशीलता की तुलना में एंटीबायोटिक दवाओं के लिए सहिष्णुता में वृद्धि का प्रदर्शन करती है। ईवीपीएल द्वारा स्थापित बायोफिल्म पर विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं के विभिन्न प्रभाव अलग-अलग हैं।

उदाहरण के लिए, पी एरुगिनोसा हत्या ईवीपीएल में 4 से 16X MIC सिप्रोफ्लोक्सेसिन के साथ हासिल की जाती है, लेकिन 4 से 8X माइक क्लोरम्फेनिकोल के साथ नहीं। डिस्क परख में लाइनजोलिड के लिए अतिसंवेदनशील होने वाली एस ऑरियस आबादी लक्ष्य-सीरम सांद्रता और EVPL में उच्च जीवित रहने में सक्षम हैं। यहां तक कि एक अनुकूलित इन-विट्रो परख ईवीपीएल में कोलिस्टिन के लिए P.aeruginosa संवेदनशीलता की सटीक भविष्यवाणी नहीं कर सकती है।

ईवीपीएल-ग्रोन बैक्टीरिया की तीन लॉग 10 हत्या को प्राप्त करने के लिए आवश्यक एंटीबायोटिक की मात्रा अक्सर मानक इन-विट्रो परख से गणना की गई एमआईसी या एमबीईसी की तुलना में काफी अधिक होती है। एंटी-माइक्रोबियल एजेंटों के बीच मतभेदों को अलग करने के अलावा, यह मॉडल विभिन्न बैक्टीरियल विकास चरणों में संवेदनशीलता में परिवर्तन और विभिन्न एंटीबायोटिक डोजिंग अंतराल के लिए उजागर कर सकता है। P.aeruginosa बायोफिल्म्स की बढ़ती सहिष्णुता meropenem के रूप में वे परिपक्व यहां दिखाया गया है ।

एस ऑरियस सर्वाइवल को 4 और 24 घंटे बाद फ्ल्लोऑक्सीलिन के संपर्क में मापा गया, जिससे बैक्टीरियल सेल की कमी में अंतर का पालन करना संभव हो गया, जिससे समय भर और आइसोले के बीच बैक्टीरियल सेल की गिनती में अंतर का पालन करना संभव हो गया । बैक्टीरियल लोड में भिन्नता अक्सर विस्तारित संस्कृति समय के साथ बढ़ती है। यह ४८ घंटे बायोफिल्म विकास और एंटीबायोटिक डोजिंग अंतराल के लिए खाते के लिए एक और 24 घंटे के जोखिम के बाद अनुपचारित नियंत्रण में देखा जा सकता है ।

विच्छेदन के दौरान उत्कृष्ट बाँझ तकनीक को बनाए रखना महत्वपूर्ण है, इसलिए हम प्रयोगशाला में या आपकी प्रयोगशाला के एक क्षेत्र में विच्छेदन करने की सलाह देते हैं जिसे आप कभी भी माइक्रोबायोलॉजी कार्य के लिए उपयोग नहीं करते हैं। हमने हाल ही में बायोफिल्म में कोलिस्टिन के प्रवेश का पता लगाने के लिए मॉडल का उपयोग किया, और मॉडल में बायोफिल्म में दवा वितरण में सुधार करने के लिए अनुसंधान में उपयोग की अच्छी क्षमता है।