蚊と感染症の表現型決定における熱帯熱マラリア原虫の感染症のためのプロトコル

Biology
 

Summary

遺伝子がマラリアのための潜在的に耐火として識別されると、それは蚊の中マラリア原虫の感染症の予防にその役割を評価する必要があります。このプロトコルは、蚊のマラリア原虫の感染の程度をアッセイする方法を示します。生殖母体の文化、膜の給餌蚊ヒト血液、及び蚊の中腸におけるウイルス力価を測定することを準備するための技術が実証されています。

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Xi, Z., Das, S., Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination. J. Vis. Exp. (5), e222, doi:10.3791/222 (2007).

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Abstract

遺伝子がマラリアのための潜在的に耐火として識別されると、それは蚊の中マラリア原虫の感染症の予防にその役割を評価する必要があります。このプロトコルは、蚊のマラリア原虫の感染の程度をアッセイする方法を示します。生殖母体の文化、膜の給餌蚊ヒト血液、及び蚊の中腸におけるウイルス力価を測定することを準備するための技術が実証されています。

Protocol

生殖母体の文化のA.の調製

  1. 水浴中で37℃に新鮮なヒト血液および血清をもたらす。
  2. 滅菌条件下、ピペットエッペンドルフチュー​​ブに暖かい血液1mL下換気フード、で。 2200 rpmで5分間、遠心分離で血液を回転させる。赤血球をペレットにする必要があります。明確な血清を除去し捨てる。 gametocytesのための全血を得るために新たな血清3倍等量のerythocytesを洗ってください。
  3. CO 2インキュベーターやキャンドルの瓶から生殖母体文化を取得。この文化は文化の16日目に蚊にRPMI培地と供給に維持されるべきである。 gametocytemiaの%を決定するために(文化の日16)一滴の血でスライドガラス上に薄層塗抹標本を作成し、Geimsa染色行います。寄生虫文化の分野における配偶子の数を決定します。それは2の範囲である - 4%。あなたが希望する最終的な%のgametocytemia(0.3 -1%)を達成するために必要な全血の量を計算する。
  4. (メディアは赤/ピンクの光になる間、寄生虫が黒として表示される)寄生虫を妨害したり吸うように注意しながら、ピペットを使用して、生殖母細胞培養液からのメディアのほとんどを削除します。 15ミリリットルのファルコンチューブにピペットでメディアや寄生虫の残りを。 2200 rpmで5分間、遠心分離でスピン。寄生虫と赤血球はペレット、削除、および妨害の寄生虫のない上清のメディアを破棄します。
  5. あなたの前の計算によれば、所望の最終gametocytemiaを与えるために準備した全血の量(ステップA2から)で寄生虫を組み合わせる。完全に混合するピペット。 (〜1分)

これは、今、あなたの蚊に供給されるサンプルです。水浴で37℃で保管してください。

B.は、蚊を食べさせる

  1. カップに付属のゴムバンドやボール紙のふたによって保護されたネッティングメッシュで覆われているワックスが並ぶ段ボールのコップにあなたのハマダラカ蚊(〜30から50)を置く。我々は、このステップのためにバッテリ駆動アスピレーターを使用してください。
  2. ゴム管にガラスフィーダの両側にノズルを挿入することにより、循環水浴を準備。あなたが直列に必要な数のフィーダとして接続します。一連の一端が水浴(フィーダーを通して水をプッシュする部分)のサーキュレータにチューブで接続する必要が、シリーズのもう一方の端はゴムチューブで構成する必要があります風呂に空の背面に循環水を可能にするために風呂に沈め。水が約37 ° Cの水と餌を循環し、戻ってお風呂にされるようになるまでお風呂に入れます。これは、血液を暖かく保つと寄生虫が生き続けるために不可欠です。
  3. フィーダの開口部にしっかりとシールするために圧力を使用して、ガラス膜のフィーダの周りに延伸して膜を(我々は、ストレッチパラフィルムの小さな四角を使用)準備。この膜は、皮膚を模倣します。
  4. 場所ごとに蚊のカップとクランプまたはテープを使用して、安全なフィーダー上に1フィーダ膜面を下に。蚊は、カップの内側からそれにアクセスできるように膜がネットと同じ高さに座ってください。
  5. 慎重にピペット寄生虫血の食事(ステップA5から)フィーダの首に、蚊が血にアクセスできるように膜を接触させ、血液が貯留中に首を介してすべての道を行くことを確認して。我々は、フィーダあたりの血液の約200μlを使用していますが、これは変わることができる。
  6. 蚊が供給することができます。我々は彼らが≈30分間供給することができます(theexperimentに応じて、変数を、ほとんどの実験のために、時折何がすでに腹部の血液の含有量を調べることで食事を取った監視。)
  7. 授乳後は、蚊カップからフィーダを取り外します。水浴の電源を切り、チューブからフィーダを取り外してください。
  8. メンブレンを外し、除染と水で洗浄して10%の漂白剤でフィーダを浸す。大規模なバイオハザード容器内の小さなバイオハザードバッグや預金に汚染された物質(膜、紙タオル、手袋、等)を配置します。
  9. 冷蔵庫や低温室でカップを置くことによって、蚊を麻酔。一度蚊が完全に麻酔ですが、氷のバケツに埋め込まれたペトリ皿に移す。ソートの蚊は、血液の食事のいずれかの符号のための腹部を注意深く見て、そして食べていないものを捨てる​​。他の人が摂取した血液の狭い帯域を表示しますが、一部の蚊は完全に充血され、すべては"供給"として受け入れられます。段ボールカップに供給蚊を元に戻します。
  10. 蚊に砂糖の食事を(10%ショ糖に浸した綿の部分)を提供し、7日間、通常の昆虫館の条件下でインキュベートする。毎日、蚊は、死亡率を監視する必要があります。また、綿は、それらが食物を奪われないように、ショ糖とウェットなされるべきである。それは、蚊は湿った保つために、蒸留水に浸したペーパータオルを追加するには、まだ、良いです。これらの蚊は、P.ですfalcipraumが感染し、そのすべてのケアはない蚊がESCAPできないように注意する必要がありますカップからE。小さなcagefor二重保護にカップを置くことが最良です。

C.は、蚊midgutsを解剖し、オーシストの負荷を推定する。

  1. バッテリ駆動アスピレーターを使用して段ボールカップから吸引蚊(ステップBから)。寒い部屋に移動したり、少なくとも5分間、氷中に貯水池を埋めてたり、蚊が移動して停止するまで、取り外し可能な吸引器のタンクの内側にある麻酔蚊、。
  2. 貯水池からの氷の中に埋め込まれたガラスのペトリ皿に麻酔蚊を転送する。単層に蚊を広げて、プラスチックシャーレの蓋でカバーしています。皿に対応できない蚊は寒い部屋や氷に戻される、タンク内に残ります。
  3. 先の細いピンセットを使用して、解剖顕微鏡下にマウントスライドガラス上に含まれる100μlのPBSに皿から単一の蚊を転送する。チルドペトリ皿で​​覆われた他人のままにしておきます。
  4. 先の細いピンセットを用いて、胸部と後腹部で蚊を開催。腸が露出するまで離れて身体を引っ張る。 gut.The腸からの過剰な組織を除去するために鉗子を使用すると白、袋状のボディのように見えます。 gut.Mountからマーキュロクロム0.2%の5〜10μlの12ウェルスライドガラスと浸すの1つのウェルで腸の過剰な組織を削除します。スカッシュ他の蚊の湿った紙towel.Continueで死体と破棄を12ウェルスライドが一杯になるまで。ガラスのカバースリップでマウントされている内臓をカバーしています。
  5. かすかな/クリアピンクの腸組織に対する明るいピンクに染色ラウンドオーシストを探して、光学顕微鏡下で内臓を調べる。 、オーシストを数えて記録し、次のサンプルに進んでください。すべての実験的な治療から、蚊のすべてのために継続する。
  6. 終わったら、ペーパータオルできれいにスライドさせ拭いてください。小さなバイオハザードバッグに、ガッツとペーパータオル、と死骸とペーパータオルを置き、ゴミ箱に捨てます。手袋は、作業中は身に着けられている。ケアは、感染蚊のエスケープを聞かせしないように注意しています。

Discussion

さまざまな手法に従うことがマラリアの感染症や感染症表現型の決定と異なるラボでのいくつかのバリエーションがある場合もあります。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Anopheles Animal mosquitos
Plasmodium falciparum Animal Parasite. Gametocytes with known gametocytemia.
15 mL conical tubes plastic
Serum, blood human, O+
0.2% mercurochrome
glass-slide 12 well
light microscope
cell counter
10% bleach
pipette tips for tissue culture
parafilm
mosquito feeder glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders
Petri dishes slass
fine-tip forceps
PBS buffer 1X, sterile
circulating water bath
pipetteman

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References

  1. Avila, S. L., Ferreira, A. W. Malaria diagnosis: a review. Braz J Med Biol Res. 29, (4), 431-443 (1996).
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  8. Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279, (7), 5581-5587 (2004).

Comments

7 Comments

  1. Dear Dr. Dimopoulos, Thank you for the wonderful video. I have been trying to culture Plasmodium falciparum gametocytes for infection of mosquitŒs but with little success.  Can you assist me with the protocol you use?  At which point do you start counting off the 16 days and do you introduce any fresh media during the interlude? with regards, Robert Karanja

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 10, 2009 - 4:54 AM
  2. Hi Robert, I am Yuemei, a postdoc from Dr. Dimopoulos' lab. I am not quite sure what your question is. Do you mean you had good gametocytes culture, but the infectious level (in terms of oocysts) in the mosquitŒs was 7-9 days after infectious blood meal? Or you actually couldn't get good gametocytes culture, we averagely get around ².5% to 4% by day 15. I had the some problem with the infection in the mosquitŒs ² years back, at that time I had very good gametocytes culture, however the mosquitŒs rarely got infected. We constantly had that problem for about 1 year till later we changed the clone of Pf NF54. We got this clone from Synaria, but we had agreement with them, so we can't give out that clone. Even with this clone, the Pf culture can not passage more than 8 times, at this time only few mosquitŒs will get infected.  Please let me know your further questions, I am happy to help out. Regards, Yuemei Dong

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 8:24 PM
  3. Hi Robert, I am Yuemei, a postdoc from Dr. Dimopoulos' lab. I am not quite sure what your question is. Do you mean you had good gametocytes culture, but the infectious level (in terms of oocysts) in the mosquitŒs was 7-9 days after infectious blood meal? Or you actually couldn't get good gametocytes culture, we averagely get around ².5% to 4% by day 15. I had the some problem with the infection in the mosquitŒs ² years back, at that time I had very good gametocytes culture, however the mosquitŒs rarely got infected. We constantly had that problem for about 1 year till later we changed the clone of Pf NF54. We got this clone from Synaria, but we had agreement with them, so we can't give out that clone. Even with this clone, the Pf culture can not passage more than 8 times, at this time only few mosquitŒs will get infected.  Please let me know your further questions, I am happy to help out. Regards, Yuemei Dong

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 8:25 PM
  4. Dear Dr. Dimopoulos

    Thank you for the efforts which you have put to prepare such a useful training source for the scientists who are working with mosquitŒs. I will be obliged if you inform me about the source where we can buy glass feeder which you are using in your laboratory. Best regards. Abbas Ali

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 24, 2009 - 12:31 PM
  5. Dear Dr. Dimopoulos,
    My Name is A.BAGAVAN Ph.D., Research Scholar from india . Thank you for the wonderful video. I have been trying to in vitro culture of Plasmodium falciparum. Start the culture you have change the media daily? Please send me the detail about the RPMI 1640 complete medium preparation method as soon as possible favorable reply. Thank you
    with regards,
    Bagavan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 27, 2010 - 12:03 PM
  6. Hi Dr. Dimopoulos,

    Excellent video, thank you so much for placing this online, gives a great visual. We are planning on infecting mosquitŒs with Dengue virus through artificial feeding. My question involves the glass membrane feeder; where did you purchase this? We've been looking everywhere online and no success in finding it.

    I do appreciate your time and best of luck!

    Jeff Grabowski
    Purdue University

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 17, 2010 - 11:21 AM
  7. Dear Dr.Yuemei
    Thanks a lot for your educational video. I have a problem to produce gametocyte in vitro. I culture K1 and F3² strain,but, I can not produce gametocyte in cuture medium. I culture plasmodium parasite in small flask by 5% parasitemia and change their medium and gas ( N² 91%, CO² 6% & O² 3%) them daily. But, I could not produce gametocyte. Is it possible to describe your protocol for in vitro gametogenesis.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 18, 2010 - 11:20 AM

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