Biology
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蚊やショウジョウバエに対する殺虫剤毒性を定量するための局所適用バイオアッセイ
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我々は、蚊およびショウジョウバエにおける殺虫剤感受性を測定するための局所適用バイオアッセイの方法論および重要性を説明する。提示されたアッセイはハイスループットであり、昆虫の質量を利用し、したがって濃度の代わりに質量相対化された致死量の計算を可能にし、他の同様の方法よりも変動性が低い可能性が高い。
Transcript
表面接触ではなく昆虫に直接殺虫剤を塗布することにより、殺虫剤曝露の変動が最小限に抑えられ、これにより、蚊の個体群の感受性プロファイルをより正確に測定することができます。この技術の主な利点は、致死濃度ではなく殺虫剤の質量相対化致死量を計算できることであり、耐性比の比較が大幅に改善される。殺虫剤を適切に保管し、ツールを汚染しないように注意し、シリンジ部品が良好な状態であることを確認してください。
これは、一貫した結果を得るのに役立ちます。まず、必要な殺虫剤溶液を冷凍庫から取り出します。直ちに溶液を渦巻きまたは5回反転させ、室温の耐光性容器に入れて殺虫剤を室温まで温めてから使用する。
それぞれ0.5ミリリットルのアセトンを含む5本の微量遠心管をセットする。シリンジバレルを第1のチューブからのアセトンで完全に満たします。その後、プランジャーを素早く押し下げてアセトンを廃容器に排出し、さらに4回繰り返して、同じアセトンアリコートから合計5回のアセトン洗浄を完了します。
次に、シリンジバレルを空気で完全に満たし、空気および潜在的なアセトン残党を廃容器に排出する。さらに2回繰り返して、空気で3回洗い流します。シリンジプランジャーと針の上部の間にバレル内にエアポケットを作り、プランジャーをバレル内に約5ミリメートル引き上げます。
プラスチック製の保持カップに、盲目的死亡率評価のためのランダムなIDのラベルを付けます。吸入からの吸引によって駆動される吸引器を使用して、3〜5日齢の成虫の蚊の所望の数を吸引する。アスピレーターの先端をチューブに入れ、先端に綿を巻き付けます。
静かに息を吐き出し、アスピレーターをタップして蚊を円錐形のチューブに移します。アスピレーターの先端を取り外したら、綿を使用してチューブを差し込み、蓋でキャップします。チューブ内の蚊を摂氏4度で最低10分間置くか、氷トレイの氷の下に埋めて、簡単にノックダウンします。
ノックダウンされた蚊を昆虫処理テントに移す。氷の上に置かれたプラスチック製のトレイに蚊を慎重に傾け、一度に約50匹の蚊を注ぎ、それぞれがその下の冷たいトレイに触れ、ノックダウンされたままになるようにします。鉗子で脚や羽で優しく拾い上げて性別で蚊を分類し、その後、各性別を別々の保持カップに入れ、所望の数に達したら停止する。
選別中は、怪我をしたり、特大小の蚊を取り除きます。蚊のカップの重さを記録するには、ペトリ皿を蓋にした空のカップを体重計の上に置き、体重計を風袋に入れます。蚊を容器に注ぎ、蓋を上に置きます。
容器を体重計に置き、最終的な体重を蚊の数とともに記録します。標本のカップを直ちに氷の上に戻し、試料のすべてのカップが計量されるまで固定したままにします。準備した蚊を氷の上に置き、ランダムなIDでラベル付けされた5〜10個の別々のカップに分けます。
ピンセットとハンドヘルドカウンターを使用して、カップあたり20〜25匹の蚊を達成します。フルーツハエを分類するには、二酸化炭素を使用してハエを7秒間麻酔します。ベンチペーパーで包まれたアイスパックにハエを注ぎます。
先端の細かい絵筆を使用して、男性と女性を分離して数えます。ペイントブラシを使用して、選択したハエを優しく拾い上げ、清潔で空のストックボトルに入れます。雄と雌のフルーツハエを同じ数選択した後、ストックボトルに株名とフルーツフライの合計でラベルを付けます。
フルーツハエのボトルを二酸化炭素を使って7秒間麻酔します。フルーツハエを計量紙に注ぎ、紙を漏斗として使用して、ランダムなIDでラベル付けされたタールバイアルにハエを導入します。スコアシートに試料の重量と数の合計を記録します。
すぐにフルーツハエのバイアルを氷のトレイに入れ、蓋を上にしてハエが逃げるのを防ぎます。シリンジに適切な殺虫剤濃度をロードし、最も濃縮度の低い用量から始めて、生物の各グループで最も濃縮された用量に向かって作業する。氷の上のトレイの上に置かれた計量紙の上に標本を傾けます。
清潔な殺虫剤を含まないペイントブラシまたは綿棒を使用して、互いに近接している標本を分離して、投薬のために各標本に簡単にアクセスできるようにします。注射器を使用して、殺虫剤溶液の1滴を蚊の場合は腹側胸部および腹部領域に、ショウジョウバエの場合は背部に塗布する。直ちに試料をラベルの付いたプラスチックカップに戻します。
カップをネットと輪ゴムで覆います。このプロセスで検体が殺されたり、損傷したり、逃げたりした場合は、カップの更新された標本数に注意してください。完成したカップを保持トレイに入れます。
最初のカップについては、投薬が完了した時刻を記録します。すべての検体が適切な殺虫剤濃度で投与されるまで、各カップの投与を繰り返し、すべての検体が投与された終了時間を記録します。濡れた綿球を介して各カップに10%スクロース溶液を提供し、所望の温度および湿度で蚊およびショウジョウバエを貯蔵する。
殺虫剤曝露開始後24時間で検体死亡率を記録する。WHOが説明しているように、蚊が飛んで直立し、直立して保持できる場合は生きていると分類し、動けない、または運動失調であれば死んでいる。ショウジョウバエについても同じ死亡率評価に従ってください。
バイオアッセイを実施した後、オスおよびメスのヒトスジシマカについてロックフェラーおよびIICC遺伝子型である2つの株を特徴とする用量反応データが得られた。ロックフェラーとIICCの質量相対化致死量の中央値は、それぞれ1ミリグラムあたり0.008ナノグラムと0.336ナノグラムであった。結果は、各系統内の雌蚊と雄蚊の用量反応曲線の間に差異を示さなかった。
したがって、両性からのデータを結合して、致死量値の中央値を計算した。これら2つの株の致死量の中央値に対する95%信頼区間は重複していなかったので、これらの値は有意に異なると考えられた。さらに、耐性比を計算すると、IICC株は感受性ロックフェラー株よりも40倍以上耐性であった。
ショウジョウバエ、ショウジョウバエのメラノガスター、Canton-S株の用量反応データも得られ、質量相対化致死量の中央値は1ミリグラムあたり0.213ナノグラムであることが判明した。一貫性は、特に殺虫剤を貯蔵および適用し、死亡率を評価する際に重要である。また、検体の取り扱いには、殺虫剤によって誘発されない危害や死を避けるように注意してください。
この方法により、蚊の集団の技術的抵抗と、環境条件の耐衝撃性、または技術的抵抗が実用的な抵抗をどのように予測するかを正確に判断できるようになりました。
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