אינדוקציה ניקוד קליני כרוני, relapsing Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

וידאו זה מדגים את הניקוד אינדוקציה קליני במודל חיה של טרשת נפוצה: כרוני, relapsing Encephalomyelitis אוטואימונית ניסיונית התובע חולדות. המחלה, הנגרמת על ידי חולדות מחסנת עם תחליב המכיל חוט השדרה שלם חולדה adjuvant פרוינד של שלמה, מציג סימנים קליניים דומים מחלות אנושיות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה דלקתית כרונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כי בדרך כלל משפיע על אנשים צעירים. הוא מאופיין על ידי demyelination ו מפחיד גלייה באזורי המופץ במוח ובחוט השדרה. נגעים אלה לשנות הולכה עצבית ו להשרות את הגירעונות נוירולוגיות השבתת המשתנות בהתאם למיקום של הפלאק demyelinated את מערכת העצבים המרכזית (למשל, paraparesis שיתוק, עיוורון, אי שליטה).

Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE) הוא המודל של טרשת נפוצה. EAE הושרה first בטעות במהלך חיסון נגד מחלת הכלבת בבני אדם, באמצעות וירוסים גדל על מיתרי השדרה ארנב. שאריות של השדרה מוזרק עם נגיף מומת המושרה המחלה במערכת העצבים המרכזית. בעקבות תצפיות אלה, המודל הראשון של EAE תוארה פרימטים שאינם בני אדם שחוסנו עם CNS homogenate על ידי נהרות Schwenther בשנת 1935. EAE מאז שנוצר במגוון המינים יכולים לעקוב אחר קורסים שונים בהתאם המין / זן ו מחסנת אנטיגן בשימוש. לדוגמה, מחסנת חולדות לואיס עם חלבון המיאלין הבסיסי תחליב עם גורם משלים מודל חריפה של EAE, בעוד אנטיגן אותו גורם מחלה כרונית שרקנים.

המודל EAE המתואר כאן הוא המושרה על ידי מחסנת חולדות התובע כנגד חוט השדרה עכברוש התובע אמולסיה ב adjuvant פרוינד של שלמה. החולדות לפתח שיתוק רפה עולה תוך 7-14 ימים לאחר החיסון. סימנים קליניים בעקבות קורס בשלב ההתקפי במשך מספר שבועות. פתולוגיה מראה מחלחל החיסונית גדולים CNS ושלטים demyelination. שיקולים מיוחדים בטיפול בבעלי חיים עם EAE מתוארים בסוף הוידאו.

Protocol

אינדוקציה וניטור של EAE-כרונית ההתקפי

התחליב הוא תערובת 01:01 של אנטיגן בתמיסה מימית להוסיף בתוספת adjuvant המלא של פרוינד. חשוב מאוד להוסיף את אנטיגן כדי adjuvant ולא להיפך!

יש הרבה פסולת בעת ביצוע והזרקת אמולסיה. תמיד להכין 1.5 או פי 2 יותר ממה שאתה צריך.

השתמש מרגמה העלי autoclaved, מזרקים זכוכית, גשרים. פלסטיק כל צריך להיות סטרילי. ההכנה ניתן לעשות זאת על ספסל מעבדה רגילים.

1. הכנת adjuvant שיושלם

לשקול 30 מ"ג של Mycobacterium tuberculosis (קטלוג Difco # 231141) ומקום לתוך מרגמה. הפוך את לאבקה דקה מבלי ללחוץ חזק מדי כדי למנוע שבירת חיידקים. הוסף 10 מ"ל של שלמה adjuvant פרוינד של H37Ra (Difco קטלוג # 231131) ומערבבים. זה משלים בתוספת כעת מכיל 4 מ"ג / מ"ל שחפת Mycobacterium. מעבירים צינור.

2. הכנת homogenate חוט השדרה

איסוף מיתרי השדרה של חולדות התובע (גיל / מין אדישים) ולאחסן קפוא ב -80 ° C. לשקול את מיתרי השדרה קפוא יש מספיק לערבב 01:01 (משקל: נפח) עם adjuvant להשלימו. לקצץ את מיתרי השדרה כמו קנס ככל האפשר בסכין גילוח, להעביר מרגמה השתמשו בסעיף 1, ולעשות הדבק עם העלי.

3. הכנת התחליב

  1. המקום מלא בתוספת adjuvant של פרוינד בצינור. וורטקס במהירות גבוהה. הוסף את טיפת חוט השדרה homogenate על ידי ירידה בעוד vortexing. כאשר כל homogenate חוט השדרה הוא הוסיף, מערבולת במשך 5 דקות נוספות. התערובת צריכה להפוך ורוד בהיר.

  2. שים את התחליב של מזרק 5 מ"ל זכוכית ולקשר אותו מזרק עוד כוס 5 מ"ל באמצעות גשר 18G (קטלוג פישר # 14-825-17L). שלח את התחליב של מזרק לצד השני עד שהוא הופך קשה (50-10 דקות). אם יותר מ -5 מ"ל תחליב מוכן, השתמש מספר 5 מזרקים מ"ל אין להשתמש מזרקים גדולים יותר.

  3. התחליב ניתן לאחסן מזרקים ב 4 ° C למשך 3 שבועות. אני ממליץ להכין את זה לפחות 12 שעות מראש כדי לבדוק שזה לא להישבר. זה צריך להישאר עבה ולא נפרדת 2 שלבים. הצבע ישתנה לילה באור צהוב או בז'.

4. חיסון של החולדות

  1. מערבבים את התחליב של מזרקים במשך כמה דקות ומעבירים מזרק המשמש הזריקה. 200 μl להזריק מתחת לעור בבסיס הזנב מאוד של שימוש במחטים 23G ו - 3 מ"ל Luer-Lock מזרקים תחת הרדמה לטווח קצר.

  2. הנמענים הם 7-9 שבועות חולדות הישן נקבה התובע. אנחנו מקבלים חולדות שלנו הרלן-ספראג Dawley.

  3. חולדות יש לשים לב פעמיים ביום ומשקלו יומי. סימנים קליניים צפויים 7-15 ימים לאחר הזרקה של התחליב.

קלינית ניקוד:

0: לא מחלה

0.5: זנב רפוי דיסטלי

1: זנב רפוי

2: paraparesis קל, אטקסיה

3: paraparesis מתונה, החולדות טיולים מעת לעת

3.5: אחת הגפיים האחוריות משותקת, המהלכים אחרים

4: איבר שלם שיתוק האחוריות

5: איבר שלם שיתוק האחוריות בריחת שתן

6: נשימה הגוססת, קושי, אין לאכול או לשתות. להרדים מיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם כמה שיקולים חשובים עבור פרוטוקול זה.

גנטיקה של חולדות התובע יהיה שונה מעט בהתאם מגדל הם קנו. הבדלים אלה עשויים להגדיל או להקטין את הרגישות של חולדות EAE אינדוקציה. אם חולדות שלך רגישים יותר EAE אתה רוצה לצמצם את כוחו של חיסון באמצעות אי - בתוספת adjuvant המלא של פרוינד או משלים שלם אפילו של פרוינד. אתה יכול גם לשקול הפחתת כמות אמולסיה מוזרק או דילול homogenate חוט השדרה עם מלוחים לפני הכנת תחליב. אם חולדות שלך אינם מפתחים סימנים קליניים של EAE באמצעות כוח מלא מחסנת אמולסיה לבדוק את ניקיון במתקן הדיור שלך. עכברושים נגועים טפילים (כגון מרצעית) לא יפתחו EAE. אתה יכול לשקול דיור חיות בתנאים שלך מנקה בכלובים autoclaved עם מסנן ראשי, ולתת להם מים acidified כרצונך (פרוטוקול להכנת מים acidified מצורפת).

התחליב יש מים בתוך שמן, כך שמן משלים לחלוטין את המעיל אנטיגן תוסיף טיפה אחר טיפה. אמולסיה מוכן להפך (נפט ב-מים) יהפוך בעובי אך לא יהיה encephalitogenic.

חולדות הם בעלי חיים ידידותיים אם הם רגילים המטפל שלהם, ולכן כדאי לטפל בהם בעדינות על בסיס יומי לפני הזריקה של התחליב encephalitogenic. זה יהיה להפחית את הלחץ ואת הסיכון של נשיכה.

בעלי חיים עם EAE חמור (ציון של 3 או יותר) צריך טיפול מיוחד. חולדות לא צריך להיות נטל על הזנב, אלא על ידי הגוף. זה אפילו יותר חשוב להפחתת הלחץ בבעלי חיים חולה. חשוב מאוד כדי להבטיח כי כל בעלי החיים יש גישה למזון ולמים על ידי הצבת חבילות מזון ג'ל תשתית ומתן ארוך קשית צינורות על בקבוקי מים. חולדות עם EAE ימשיכו לאכול ולשתות, אם להפסיק חיים או אכילה או שתייה להתייעץ עם וטרינר המכון שלך או להרדימו. חולדות חולים צריכים להיות מופרדים מן החי בריא כדי להבטיח שהם לא נרמס ללא הרף, אך להימנע חולדות לעזוב לבד מאז הם חיות חברתיות צריך חברה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB ו KGC הם מייסדי ויועצים עבור Airmid בע"מ

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s Adjuvant Reagent Fisher Scientific DF 311-360-5 Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Reagent Fisher Scientific DF3114-33-8 Manufactured by Difco
DA rat Animal Harlan Laboratories Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml Tool Fisher Scientific 14-823-10 B
Metal bridge - 18G Tool Fisher Scientific 14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml Tool BD Biosciences 309585
Needles - 20G 1 1/2 Tool Fisher Scientific 14-826-5C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

21 Comments

  1. Dear Dr. Beeton,
    I watched your video with great interest.
    I am a researcher at the CEA, Orsay, France, and we are interested in inducing EAE in DA rats. I would kindly like to ask you a few questions in this regard:
    1. Should the meninges be removed prior to the freezing of the spinal cord, to avoid aggregates/ clumps in the emulsion?
    ². Is it possible to reduce the spinal cord into fine powder by using a mortar and pestle in liquid nitrogen rather than using a razor and cutting it over dry ice?
    3. Can the emulsion be prepared by using a polytron or some other homogenisation system rather than the glass syringes and the connecting bridges (we seem to have a problem to obtain some of these tools).
    4. Is it possible to use rats older than 7-9 weeks or dŒs susceptibility decrease with increasing age?
    Thank you in advance.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 5, 2008 - 11:20 AM
  2. We use whole spinal cords, without removing any parts.
    Since we published this video and following advice from Dr. Holmdahl (Lund, Sweden), we have started using fresh spinal cords from ~1² weeks old DA rats. The emulsions give more homogeneous diseases when working with a large group of animals (> 40 recipients). We have not tried using a mortar and pestle. I don't think it would work for fresh cords but might on frozen cords.
    I haven't tried any other methods for preparing the emulsion. As a graduate student in France I was able to buy glass syringes but we had to ask facilities to make metal bridges to connect the syringes by using two metal needles.
    Recipients should be young adults for best susceptibility to EAE. We have never tried using older DA rats but in other rat models of EAE (using Lewis rats) we have found that the older the recipients, the less susceptible to EAE they were. Note that not all DA rats are identical, there are small variations from vendor to vendor so you may want to try rats from several vendors in your area to find which are more susceptible to EAE.
    If you have any more questions you are welcome to contact me by email at beeton@bcm.edu.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    February 5, 2008 - 4:02 PM
  3. Dear Dr. Beeton, thank you for very interesting video. I would like to ask you , if you have any experience with the EAE induction in mice using this protocol. Thank You for the answer. Sincerely Jan Pazour

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 30, 2008 - 9:31 AM
  4. I have never used this protocol in mice. For mice I have only used the MOG 35-55 peptide to induce EAE [in C57BL/6 mice]. Using whole spinal cord should work in mice but the protocol would have to be adjusted. You would first have to ensure you are working with the right strain and then you would have to work out the doses and type of adjuvant. Most protocols in mice also call for an additional injection of pertussis toxin and very often mice need a booster injection to develop EAE. This can be a rather tricky protocol to adapt to mice. Sorry that I could not give you a more helpful answer.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    June 30, 2008 - 10:38 AM
  5. Dear all, could there be any difference in using M.butyricum instead of M. tuberculosis H37RA containing adjuvant in inducing EAE in wistar rats (mylein basic protein- MP bio-vendor). I plan to use the former.Please suggest.

    raghul
    toxicologist
    SGS -LSS india

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 25, 2008 - 1:24 PM
  6. Dear Raghul, I have no experience inducing EAE in Wistar rats so am unsure of the results. When inducing acute EAE in Lewis rats with MBP we used CFA made with M. butyricum and supplemented it with 3 mg/ml M. tuberculosis and this worked well with 100% EAE incidence and a homogeneous disease. Best wishes, Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    August 25, 2008 - 5:46 PM
  7. what is the concentration of the HCl for drink wather?

    Reply
    Posted by: Andres Q.
    September 15, 2009 - 2:40 PM
  8. To prepare acidified drinking water, fill a clean carboy with 10 liters of water. Add 5 ml of 1²N (concentrated) hydrochloric acid (HCl) to the water and stir. The pH of the solution should be in the range of ².4-3.0.
    For more safety, ensure that your stock of concentrated acid is not used for anything else but preparing acidified drinking water. This will reduce the risk of accidental contamination with toxic chemicals.
    Do not check the pH directly in your carboy but rather in a sample taken into a beaker.
    This acidified drinking water is not quite as acidic as common sodas many people drink every day. It will not damage the lining of the Œsophagus of the rats.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2009 - 3:03 PM
  9. Dear Dr Beeton,
    I found and watched with great interest you movie about induction and clinical
    scoring of chronic-relapsing EAE in rats and i would like to ask you if
    you have some hystological or/and MRI findings to prove that the major
    pathophisiologycal changes, induced by the immunization, occur in the brain
    and not in the spinal cord? How much this animal model mimics what is
    happening in human brain in MS? I am interested more by demyelination
    which i can observe using DT-MRI.

    Thank you in advance

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 8:32 AM
  10. We have not done any histology the brain of these animals as our focus was on the spinal cord.
    We used the brains to isolate mononuclear cells and found more with a CCR7- differentiated phenotype in EAE rats than controls. This suggest brain-infiltration and therefore a potential for demyelinating lesions, but I can't guaranty it.
    This model is definitely demyelinating in the spinal cord (see figure S6 in the online supplement of the paper Matheu, Beeton et al. Immunity ²008, ²9:60²).
    Christine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 1:54 PM
  11. Dear Dr. Beeton, thank you for very interesting video. Do you have the protocol to induce EAE in mice? Can you please provide injecting protocol for mice. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 12, 2010 - 1:24 PM
  12. The protocol will depend on the mouse strain you are interested in. Some strains are more susceptible to EAE than others. A good place to start is the following protocol: http://www.penningerlab.com/uploads/media/EAE_induction_01.pdf

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 30, 2011 - 11:34 PM
  13. Dear Dr Beeton
    Thanks for the vieo, it is very helpful. I have just one question regarding the part you use as "SPINAL CORD". Is it seperated from spinal column or you just use spinal colum containing spinal cord?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 12, 2011 - 5:01 AM
  14. You want to use the spinal cord itself, removed from the bone. It is pretty easy to collect since you don't need to keep it in a single piece (as you would for histology for example). You can simply scrape it out.
    Hope this helps!
    Christine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2011 - 4:36 PM
  15. Dear Dr Beeton
    Thanks for the video. Please let me know how to make acidified water and HOW LONG THE ANIMAL SHOUL DRINK SUCH A WATER BEFORE INDUCTION OF EAE?
    Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2011 - 3:58 AM
  16. For preparation of the acidified water, please refer to my answer to a similar question from Andres Quintanar, posted 09/15/²009.
    We put our rats on acidified water as soon as we receive them, which is 4-7 days before we induce EAE.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2011 - 4:40 PM
  17. Dear Dr Beeton
    Thanks for the video. It is really helpful. Can we use Sprague-Dawley and Wistar Rats. Do we need in your model to use pertussis toxin.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2011 - 6:32 AM
  18. Hello Dear Christine Beeton
    Thanks for your useful video. I would be grateful if you response my question: In this video when you work with Mycobacterium tuberculosis H37RA for making it thin powder, you didn't wear mask, is it safe for you?

    Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2012 - 5:34 AM
  19. Hello Dear Professor Beeton
    I have another question dear Dr Beeton: Should we perfuse the rat before spinal cord isolation (for EAE induction) or no the perfusion is just necessary when we want to isolate the cells from spinal cord or brain? I want to isolate the guina pig spinal cord for EAE induction and I don't know the perfusion is necessary or no.
    Best Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 10, 2012 - 7:46 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics