चूहे और ट्रांसजेनिक चूहों से एजिंग और Amyloid पैथोलॉजी के दौरान Synaptic बदलाव के अध्ययन के लिए तीव्र hippocampal स्लाइस की तैयारी

Published 3/23/2011
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Neuroscience
 

Summary

इस लेख synaptic मस्तिष्क उम्र बढ़ने और अल्जाइमर रोग जैसे उम्र से संबंधित neurodegenerative रोगों, के साथ जुड़े परिवर्तन के अध्ययन के लिए चूहों और ट्रांसजेनिक चूहों से hippocampal स्लाइस की तैयारी के लिए प्रक्रियाओं रूपरेखा.

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Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330, doi:10.3791/2330 (2011).

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Abstract

Protocol

1. तैयारी बर्फ ठंड oxygenated कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF)

  1. ACSF "2 + मुक्त Ca" के 2 एल तैयार. एक 2L Erlenmeyer फ्लास्क में बाँझ या डबल आसुत एच 2 हे के लगभग 1.5 एल जोड़ने, और हलचल की थाली पर सख्ती सरगर्मी शुरू करते हैं. 124 NaCl, 2 KCl, 1.25 2 के.एच. पीओ 4, 2 MgSO 4, 26 NaHCO 3, और 10 dextrose (देखें तालिका 1): निम्नलिखित ACSF घटकों (मिमी में) जोड़ें. आसुत एच 2 ओ के साथ एल 2 की मात्रा को लाओ
  2. एक मछलीघर bubbler और टयूबिंग एक 95% 2 हे / 5% सीओ 2 हवा की टंकी, लगभग 20-30 मिनट के लिए आक्सीजन के साथ मिलना ACSF सख्ती से जुड़ी का उपयोग करना. पीएच की जाँच करें, और यदि आवश्यक हो, 7.4 को समायोजित NaOH या एचसीएल का उपयोग.
  3. एक अलग Erlenmeyer फ्लास्क में oxygenated 2 ACSF + मुक्त CA के 750 एमएल डालो, parafilm साथ खोलने कवर, और 20-30 मिनट के लिए एक ultrafreezer (-80 डिग्री सेल्सियस) के लिए स्थानांतरण. यह मीडिया मस्तिष्क और तीव्र hippocampal स्लाइस के विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा *. 2 मिमी 2 CaCl शेष 1.25 ACSF के एल की मात्रा करने के लिए #, अच्छी तरह से हलचल है, और 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ oxygenation फिर से शुरू जोड़ें. यह मीडिया dissections के बाद, और electrophysiologic रिकॉर्डिंग के दौरान स्लाइस perfusing के लिए मस्तिष्क स्लाइसें के भंडारण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    * बर्फ ठंड 2 Ca + मुक्त मीडिया चयापचय धीमी और विच्छेदन के दौरान कम से कम 2 excitotoxicity + निर्भर Ca के लिए प्रयोग किया जाता है.
    # 2 CA में परिवर्तन + उम्र बढ़ने के दौरान dysregulation और ई. + निर्भर synaptic plasticity 4-9 2 Ca की प्रेरण पर एक प्रमुख प्रभाव हो सकता है. Mg2 अनुपात + टुकड़ा रिकॉर्डिंग के दौरान (2,4,10 देख) लिमिटेड में मतभेद उम्र पर परस्पर विरोधी रिपोर्टों आंशिक रूप से + अलग ACSF Ca 2 का उपयोग करने के लिए attributable हो सकता है. 2 Ca के महत्व + विनियमन और ACSF Ca 2 + उम्र बढ़ने अध्ययन में स्तर चर्चा अनुभाग में अधिक से अधिक विस्तार में संबोधित किया है.
  4. जबकि सीए 2 + मुक्त ACSF ठंड है, मस्तिष्क स्लाइसें के रखरखाव के लिए पहले और दौरान electrophysiologic रिकॉर्डिंग एक होल्डिंग कक्ष तैयार *. हम एक कस्टम कक्ष मैक्रो पकड़ है कि चार व्यक्ति microchambers (देखें चित्र 2) शामिल हैं का उपयोग करें. macrochamber बाँझ के साथ भरा है, एच 2 हे oxygenated और microchambers अनिवार्य रूप से कर रहे हैं द्वीपों है कि पानी की सतह से ऊपर बहर. प्रत्येक microchamber भीतर, स्लाइस oxygenated ACSF की एक उथले पूल में netted डालने पर आराम करो. स्लाइसें पूरी तरह से नहीं जलमग्न कर रहे हैं, लेकिन humidified हवा के साथ एक अंतरफलक पर बैठते हैं. एक अछूता macrochamber हीटिंग तत्व के भीतर तापमान समायोजन के लिए अनुमति देता है.
    * कई किस्मों पकड़े कक्षों की भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (जैसे वार्नर उपकरण एक डुबकी शैली "पूर्व चैंबर # BSC - पीसी बनाता है) और उम्र बढ़ने और ट्रांसजेनिक माउस टुकड़ा अध्ययन में इस्तेमाल के लिए उपयुक्त होना चाहिए. एक चुटकी में, स्लाइस के लिए बनाए रखा जा सकता एक छोटे पेट्री ACSF के साथ भरा पकवान में कई घंटे. पेट्री ढक्कन में एक छोटा सा छेद बनाओ एक ऑक्सीजन प्रसव ट्यूब के लिए सावधान रहना है कि ऑक्सीजन के बुलबुले शारीरिक स्लाइस आंदोलन नहीं करते. स्लाइसें पर्याप्त ऑक्सीजन मिल अगर डिलीवरी ट्यूब सिर्फ उठाया है ACSF सतह से ऊपर (गैस फैलाव द्रव की सतह में एक खरोज कारण होना चाहिए).

2. ब्रेन हटाना और आयु में hippocampal विच्छेदन (> चूहों के 20 महीने पुराने)

  1. विच्छेदन क्षेत्र एक बड़ी सिंक (चित्रा 1 और 2 टेबल देखें) अगले * तैयार. सिंक में एक छोटे जानवर गिलोटिन प्लेस और मस्तिष्क को हटाने और hippocampal विच्छेदन एक जोड़ कागज तौलिया सहित, # 11 स्केलपेल ब्लेड, beebee कैंची, अस्थि rongeurs, "हिप्पोकैंपस उपकरण" (एक विशेष से दोहरी रंग के लिए शल्य चिकित्सा उपकरणों और सामग्री देना ठीक शल्य चिकित्सा) उपकरण, छोटे शल्य कैंची, एक पतली डबल समाप्त रंग, प्लास्टिक पाश्चर पिपेट, 110 मिमी व्यास वाटमान फ़िल्टर कागज, एक lidded 100 मिमी कांच पेट्री बर्फ से भरा पकवान, और एक प्लास्टिक के चम्मच. इसके अलावा एक प्लास्टिक की थैली लोथ के निपटान के लिए पास रखना.
    * ब्रेन निष्कर्षण जल्दी के रूप में संभव के रूप में पूरा किया जाना चाहिए है, तो यह एक अच्छा विचार के लिए मानसिक रूप से प्रक्रिया "के माध्यम से चलना" और अपने उपकरणों के उपयोग के आदेश में बाहर करना है.
  2. फ्रीजर से 2 ACSF + मुक्त Ca निकालें. मीडिया आंशिक रूप से जमे हुए, नहीं पूरी तरह से करना चाहिए. एक गिलास बीकर में ACSF के बारे में 50 एमएल डालो, Parafilm के साथ कवर, और विच्छेदन क्षेत्र के लिए अगले जगह. यह मीडिया के लिए संक्षेप में मस्तिष्क की दुकान एक बार इसे हटा दिया है करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. शेष 2 Ca + स्वतंत्र मीडिया टुकड़ा तैयार करने के लिए Vibratome में जलाशय को भरने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. यह मीडिया, reoxygenated जा सकता है या बस parafilm के साथ कवर और 4 में फ्रिज में रखा डिग्री सेल्सियस
  3. संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित विधियों का उपयोग चूहा euthanize. हमारे पशुओं के एक छोटे Plexiglas कक्ष है कि धीरे - धीरे 100% सीओ 2 के साथ भरा है में रखा जाता है. चेतना की हानि आम तौर पर पांच मिनट के भीतर होता है और पलटा गतिविधि के अभाव के द्वारा की पुष्टि कीएक पैर के अंगूठे चुटकी के बाद.
  4. चूहे तुरंत पहले ग्रीवा कशेरुका व्याख्यान चबूतरे वाला सिर काटना और मुड़ा हुआ कागज तौलिया पर सिर जगह. # 11 स्केलपेल का उपयोग करना है, जल्दी से नाक की हड्डी के पास शुरू करने और पश्चकपाल हड्डी करने के लिए caudally चल खोपड़ी के बीच में एक चीरा बनाते हैं. त्वचीय मांसपेशियों के माध्यम से पूरी तरह कट, पूरी तरह से खोपड़ी के पृष्ठीय सतह पर sutures उजागर करने के लिए सुनिश्चित करें.
  5. Beebee कैंची के साथ खेना प्लेट के माध्यम से काटें. युवा चूहों और चूहों में, खोपड़ी जल्दी अस्थि rongeurs के उपयोग के साथ अकेले हटाया जा सकता है. हालांकि, वृद्ध चूहों युवा वयस्क चूहों और चूहों है कि इस प्रक्रिया मुश्किल कर सकते हैं की तुलना में मोटा खोपड़ी है. हमने पाया है कि खोपड़ी के माध्यम से काटने बहुत rongeurs के साथ हड्डी हटाने की सुविधा, मस्तिष्क को चोट कम है, और कीमती सेकंड बचाता है. काउंटर शीर्ष पर मजबूती से चूहे के सिर के साथ, beebee कैंची की खोपड़ी के पीछे भाग पर रंध्र मैग्नम के बेहतर क्षेत्र में कम सरासर अत्याधुनिक जगह है. कम सरासर खोपड़ी के भीतर (और दिमाग से दूर) * सतह, पश्चकपाल थाली के माध्यम से कटौती के खिलाफ मजबूती से रखते हुए, और तब पार्श्विका प्लेटों के midline सीवन के साथ. Rostrally आगे बढ़ें जब तक आप ललाट खोपड़ी प्लेटों के माध्यम से कटौती.
    * यह महत्वपूर्ण है कि दबाव मस्तिष्क से दूर निर्देशित है अनजाने gauging को रोकने.
  6. पश्चकपाल, पार्श्विका, और मस्तिष्क से अस्थायी खोपड़ी प्लेटें अलग. स्थिरता और का लाभ उठाने के लिए countertop के लिए दृढ़ता से सिर पकड़ जारी रखें और rongeurs के नीचे जबड़े छोड़ दिया पार्श्विका थाली खोपड़ी के अंदर सतह के खिलाफ बनाए रखने के दबाव के तहत स्लाइड. अगला, rongeurs के जबड़े साथ निचोड़ और अपनी कलाई के ऊपर और आप की ओर रोल पार्श्विका और पश्चकपाल प्लेटें मस्तिष्क से दूर खींच. यह बाएँ गोलार्द्ध की पृष्ठीय सतह की सबसे बेनकाब करना चाहिए. यदि आवश्यक हो, rongeurs का उपयोग करने के लिए छोड़ दिया ललाट थाली के रूप में अच्छी तरह से हटायें. अन्य गोलार्द्ध के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. एक बार प्लेटें विस्थापित कर रहे हैं, जल्दी से किसी भी dura बात है कि अस्थायी प्लेटों को संलग्न किया जा सकता है और मस्तिष्क की सतह भर में फैला के लिए निरीक्षण किया. धीरे इन rongeurs के साथ दूर खींच या कैंची से दूर कटौती *. अब, मस्तिष्क और सही लौकिक थाली के बीच rongeurs के ऊपरी जबड़े स्लाइड, फिर खोपड़ी की ओर है और मस्तिष्क से दूर रखने के दबाव. निचोड़ और लौकिक थाली मस्तिष्क से दूर मोड़. आप सुन / एक "कमी" महसूस करना चाहिए के रूप में आप इस करते हैं. बाईं ओर के लिए दोहराएँ.
    * Dura हाजिर करने के लिए कठिन हो सकता है, खासकर अगर पशु transcardially किया गया है ACSF साथ perfused कर सकते हैं. हालांकि, अगर dura नहीं हटा रहे हैं, वे जब अस्थायी प्लेटों को हटा रहे हैं एक उस्तरा की तरह मस्तिष्क के माध्यम से (और सबसे अधिक संभावना हिप्पोकैम्पस) टुकड़ा होगा. Dura अस्थायी प्लेटों के पास दूर snipping मस्तिष्क छुरा की संभावना को कम कर देंगे.
  7. मस्तिष्क निकालें *. जल्दी Ca 2 + मुक्त ACSF "कीचड़दार" से parafilm हटाने. अब मस्तिष्क और नीचे खोपड़ी प्लेटें के उदर की सतह के बीच hippocampal उपकरण के व्यापक रंग सिर स्लाइड जब तक यह पूरी तरह से मस्तिष्क के तहत है. रंग पक्ष की ओर से laterally और फिर आगे और पीछे की ओर एक बार कुछ स्थानांतरित करने के लिए बरकरार कपाल नसों तोड़. अब hippocampal उपकरण और सीए 2 + मुक्त ACSF और parafilm के साथ कवर में डूब के साथ मस्तिष्क बाहर निकालना . के बारे में एक मिनट के लिए मस्तिष्क चिल चलो. इस गिलोटिन स्वच्छ, लोथ के निपटान, और विच्छेदन क्षेत्र के पुनर्निर्माण के लिए एक उपयुक्त समय है.
    2.3-2.7 कदम के लिए *, गति का सार है. हम 30-35 सेकंड में इस प्रक्रिया (कत्ल से ACSF में डुबकी मस्तिष्क) को पूरा करने की कोशिश. हमारे अनुभव में, extractions अब एक मिनट से लेने के प्रतिकूल hippocampal टुकड़ा स्वास्थ्य को प्रभावित दिखाई देते आयु वर्ग के चूहों के लिए विशेष रूप से,. इन प्रक्रियाओं का उपयोग करना, हम हमारे अध्ययन के लिए वृद्ध और युवा चूहों के बीच निकासी समय में कोई मतभेद नहीं मनाया है.
  8. Hippocampi निकालें. ठंडा पेट्री डिश के ढक्कन पर वाटमान फिल्टर पेपर प्लेस और ACSF कागज के साथ प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर गीला हो जाना. ACSF से मस्तिष्क और घटा वाटमान कागज पर एक चम्मच और जगह का उपयोग कर पुनर्प्राप्त करें. स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, और व्याख्यान चबूतरे वाला ललाट lobes के लगभग एक चौथाई सेरिबैलम हटा दें. Intrahemispheric विदर के माध्यम से स्केलपेल ब्लेड चलाने के लिए पूरी तरह से दो गोलार्द्धों अलग. प्लेस में वापस ACSF कीचड़दार और एक गोलार्द्ध विदारक है कि इस तरह के ललाट पालि के राज्याभिषेक विमान नीचे का सामना करना पड़ रहा है मंच पर अन्य अप "खड़े". आप स्पष्ट रूप से मस्तिष्क स्टेम और overlying प्रांतस्था (जो / गुलाबी भूरा है) (जो सफेद होते हैं) से मध्य मस्तिष्क भेद करने में सक्षम होना चाहिए. Midbrain पर बेहतर और अवर colliculi का पता लगाएँ, इन दो सफेद "knobs" की तरह लग रही है और इस उन्मुखीकरण में मस्तिष्क के "शीर्ष" पर हो जाएगा. शल्य कैंची का प्रयोग, धीरे जगह में midbrain पकड़ और अंतराल में वजन रंग स्लाइड होके बीच colliculi और neocortex. बहुत धीरे से, रंग स्लाइड नीचे जारी रखने और brainstem / midbrain / thalamus दूर पार्श्व वेंट्रिकल और हिप्पोकैम्पस के औसत दर्जे का सतह के अंदर खुलासा खींच. रंग की तेज धार का प्रयोग करें सुचारू तोरणिका तोड़, एक सफेद फाइबर बंडल हिप्पोकैम्पस के पूर्वकाल / पृष्ठीय भाग में स्थित है. कैंची के साथ, धीरे यह पूरी तरह से मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से विच्छेद बिना brainstem / thalamus / midbrain दूर खींच जारी है. हिप्पोकैम्पस के साथ प्रांतस्था अब brainstem से स्वतंत्र रूप से वापस करना चाहिए *. अगले, विदारक चरण बारी इतना है कि तुम औसत दर्जे का हिप्पोकैम्पस और overlying प्रांतस्था में देख रहे हैं के रूप में अगर यह एक बाण के समान अनुभाग (शून्य thalamus) थे. अब आप सफेद fimbria फाइबर है कि इस विमान में हिप्पोकैम्पस के नीचे उथले अतिशयोक्ति के रूप में देखना चाहिए. Fimbria नीचे खाई में प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट, धीरे कुछ धार ACSF का उपयोग करने के लिए प्रांतस्था से अलग हिप्पोकैम्पस में मदद. धीरे इस अंतराल में रंग स्लाइड, जैसे कि रंग की लंबी ओर हिप्पोकैम्पस की लंबी अक्ष के साथ समानांतर चलाता है. एक बार रंग हिप्पोकैम्पस के तहत पूरी तरह से है, नीचे brainstem / / midbrain thalamus मजबूती और कैंची के साथ पकड़ रंग आपके शरीर से दूर करने के लिए शारीरिक रूप से मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से हिप्पोकैम्पस अलग रोल. एक बार हिप्पोकैम्पस मुक्त है, धीरे से दूर किसी भी शेष प्रांतस्था, रक्त वाहिकाओं, और सफेद बात ट्रिम. स्कूप विदारक चरण के दूर पक्ष पर ACSF कीचड़दार की एक छोटी राशि. धीरे कीचड़ और ACSF के कुछ मिलीलीटर प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग के साथ पानी में गोता लगाना करने के लिए अगले हिप्पोकैम्पस स्थिति. अगला, अन्य गोलार्द्ध हटाने और विच्छेदन दोहराने.
    * आप कैंची की जरूरत को दूर अतिरिक्त संयोजी ऊतक, सफेद बात है, या vasculature कि brainstem से प्रांतस्था की जुदाई रोकता कटाव सकता है. अपनी कैंची की अंक बहुत हिप्पोकैम्पस के करीब हो जाएगा, तो बहुत सटीक snips (तेज कैंची चाहिए) देने के लिए सुनिश्चित हो.

3. मस्तिष्क और वृद्ध ट्रांसजेनिक चूहों में hippocampal विच्छेदन हटाना

  1. Euthanize और माउस के सिर काटना और खोपड़ी पर midline चीरा बनाने के लिए खंड 2.3 में वर्णित के रूप में. चूहे चूहों जो बहुत मस्तिष्क निकासी सरल से बहुत पतली खोपड़ी है. कैंची के साथ खोपड़ी के माध्यम से काटना इसलिए अनावश्यक है. छोटे जबड़े (तालिका 2) के साथ अस्थि rongeurs प्रयोग को दूर खींच पश्चकपाल, पार्श्विका, और अस्थायी खोपड़ी प्लेटें. चूहे के साथ के रूप में नियंत्रित आंदोलनों का उपयोग करने के लिए और दृढ़ता खोपड़ी की आंतरिक सतह में rongeurs के निचले जबड़े खींचने के लिए और मस्तिष्क से दूर के रूप में आप प्लेटें हटायें याद है. एक बार प्लेटों को हटा रहे हैं, hippocampal उपकरण के शेष कपाल नसों तोड़ और ठंडा 2 Ca ACSF + मुक्त में मस्तिष्क स्कूप संकीर्ण अंत का उपयोग करें.
  2. मस्तिष्क स्लाइसें तैयार करें. माउस मस्तिष्क के छोटे आकार, hippocampi विदारक के कारण थोड़ा अधिक चुनौतीपूर्ण जब चूहों का प्रयोग से किया जा सकता है (हालांकि निश्चित रूप से साध्य). तो, चीजों को आसान बनाने के लिए, हम सेरिबैलम और ललाट lobes के व्याख्यान चबूतरे वाला सुझावों निकालने के लिए, लेकिन hippocampi काटना नहीं. इसके बजाय, मस्तिष्क गोलार्द्धों के शारीरिक रूप से एक स्केलपेल ब्लेड के साथ अलग कर रहे हैं और Vibratome सेक्शनिंग के लिए बरकरार रह गया (नीचे अनुभाग 4 देखें).

4. धारा हिल सूक्ष्म तक्षणी (Vibratome) का उपयोग स्लाइस में मस्तिष्क के ऊतकों और होल्डिंग * चैंबर के लिए स्थानांतरण

  1. ठंडा 2 Ca ACSF + मुक्त, जैसे कि काटने मंच और ब्लेड पूरी तरह से जलमग्न हैं के साथ Vibratome के जलाशय भरें . चूहे स्लाइसें बनाने के लिए, एक स्केलपेल ब्लेड के साथ प्रत्येक हिप्पोकैम्पस के व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम सुझावों में कटौती. इन में कटौती आप खड़ी hippocampi स्थिति के लिए दो स्तंभों की तरह एक साथ मिलकर की अनुमति देगा. यह सबसे अच्छा काम करता है अगर प्रत्येक हिप्पोकैम्पस की दांतेदार गाइरस एक दूसरे का सामना करना पड़ रहा है और CA3 क्षेत्रों में एक ही दिशा में उन्मुख होते हैं. माउस स्लाइसें बनाने के लिए, खड़ी ललाट lobes नीचे का सामना करना पड़ के साथ मिलकर प्रत्येक गोलार्द्ध स्थिति. गोंद एक बढ़ते ब्लॉक और Vibratome के सेक्शनिंग चरण के लिए स्थानांतरण करने पर मस्तिष्क के ऊतकों. आम तौर पर हम ~~ synaptic शरीर क्रिया विज्ञान के प्रयोगों के लिए 400 उम वर्गों तैयार करते हैं. पतली वर्गों अगर फ्लोरोसेंट इमेजिंग (2 सीए के जैसे जांच + स्तर और यात्रियों) आयोजित किया जाएगा तैयार रहना चाहिए. एक चौड़े मुँह विंदुक या एक पेंट ब्रश # के साथ स्लाइसें लीजिए और एक छोटा सा ठंडा 2 Ca ACSF + मुक्त युक्त पेट्री डिश को हस्तांतरण .
    * Vibratome टुकड़ा के ऊपरी और निचले सतहों के लिए कम से कम नुकसान के प्रयोग और टुकड़ा सतह (जैसे वोल्टेज दबाना और सीए 2 + इमेजिंग अध्ययन) के पास कोशिकाओं का विश्लेषण की आवश्यकता के अध्ययन के लिए निश्चित रूप से सिफारिश की है. हालांकि, सस्ता विकल्प उपलब्ध है और कोशिकी शरीर क्रिया विज्ञान के प्रयोगों के लिए स्लाइस पैदा करने के लिए उपयुक्त हैं. हम एक छोटा सा गुरुत्व नियंत्रित 2,11 हेलिकॉप्टर और अच्छी सफलता के साथ एक McIlwain ऊतक 12 चोपर का इस्तेमाल किया है. थी के लिएएस प्रक्रिया hippocampi एक मंचन और एक ऊर्ध्वाधर हेलिकॉप्टर के साथ sectioned पर रखा जाता है. एक ब्रश करने के लिए एक छोटा सा ठंडा 2 Ca ACSF + मुक्त से भरा पकवान पकड़ स्लाइस (एक बार में एक) को हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस दृष्टिकोण के साथ एक समस्या यह है कि hippocampi असमान वर्गों में जिसके परिणामस्वरूप चोप्स के बीच ले जा सकते हैं. इसके अलावा, ज्यादा सफेद पदार्थ के रूप में, और विशेष रूप से बहुत vasculature, के रूप में काट से पहले संभव के रूप में निकालना सावधान रहना. इस सामग्री ब्रश, रेजर ब्लेड, या दोनों टुकड़ा हस्तांतरण बहुत मुश्किल बनाने और खींच या हानिकारक ऊतक की संभावना में वृद्धि करने के लिए छड़ी जाएगा.
    # जब एक ब्रश का उपयोग कर, bristles भर लंबाई वार टुकड़ा आराम की कोशिश करो. ब्रश टिप आसपास टुकड़ा रैपिंग अनावश्यक ऊतक खींच कारण हो सकता है.
  2. पकड़े कक्ष, जहां वे oxygenated 2 Ca ACSF + युक्त में नहाया कर रहे हैं मस्तिष्क स्लाइसें स्थानांतरण. धीरे - धीरे 27 ° से 32 डिग्री सेल्सियस (1 ° हर पांच मिनट) चैम्बर तापमान लाने. स्लाइसें electrophysiologic प्रयोगों से पहले 1-1.5 घंटे के लिए सेते करने की अनुमति दें.

5. प्रकाश में लाना और CA3 - CA1 Synaptic प्रतिक्रियाएँ कीर्तिमान

  1. तीव्र स्लाइस में बुनियादी कोशिकी रिकॉर्डिंग के लिए, अपने इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी स्टेशन * शामिल की आवश्यकता होगी: एक छिड़काव प्रणाली;> 4X बढ़ाई क्षमता के साथ एक खुर्दबीन, एक रिकॉर्डिंग कक्ष रिकॉर्डिंग, उत्तेजक, और जमीन इलेक्ट्रोड, स्थूल और micromanipulators, एक कठोर कंपन प्रतिरोधी टेबल टॉप और फैराडे पिंजरे, एक उत्तेजक औधधि, एम्पलीफायर और एनालॉग डिजिटल कनवर्टर (ए / डी); आस्टसीलस्कप (अधिमानतः), उचित अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ और व्यक्तिगत पीसी.
    * केर वैज्ञानिक उपकरण बुनियादी टुकड़ा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों की एक किस्म का आयोजन करने के लिए एक शानदार और सस्ती इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रणाली (यानी केर ऊतक रिकॉर्डिंग सिस्टम) प्रदान करता है. इस प्रणाली के एक छोटे पदचिह्न, पोर्टेबल stimulators और एम्पलीफायरों है, और एक मानक प्रयोगशाला बेंच पर एक भारी फैराडे पिंजरे की जरूरत के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है.
    बेशक, मस्तिष्क स्लाइसें भी कई विस्तृत electrophysiologic और इमेजिंग तकनीक है, जो अतिरिक्त उपकरणों और सामग्री की आवश्यकता होगी प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सकता है. उदाहरण के लिए, हमारे मुख्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी स्टेशन तेजी से वोल्टेज और वर्तमान दबाना क्षमताओं, एक फ्लोरोसेंट रोशनी प्रणाली, और एक डिजिटल कैमरा के साथ एक एम्पलीफायर शामिल हैं. इस स्टेशन मस्तिष्क स्लाइसें, के रूप में के रूप में अच्छी तरह पैच दबाना रिकॉर्डिंग और स्लाइसें और सेल संस्कृतियों 3,12,13 में फ्लोरोसेंट इमेजिंग में कोशिकी क्षेत्र रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है . उपकरण और घटकों की एक पूरी सूची के लिए तालिका 3 देखें.
  2. एक चौड़े मुँह विंदुक या छोटे पेंट ब्रश का प्रयोग, रिकॉर्डिंग * उत्तेजना / रिकॉर्डिंग से पहले 10-15 मिनट के लिए acclimate करने के लिए अनुमति कक्ष के लिए एक या एक से अधिक स्लाइस हस्तांतरण. हमारे अध्ययन के लिए, स्लाइस ACSF और बाकी में जाल वार्नर उपकरण द्वारा एक आर सी 22-चैम्बर में डाला (चित्र 3 देखें) पर जलमग्न कर रहे हैं. ACSF प्रवाह दर को समायोजित करने के लिए एक नियामक के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण खिलाया है, और 32 के लिए prewarmed डिग्री सेल्सियस रिकॉर्डिंग कक्ष तक पहुँचने से पहले एक इनलाइन सूक्ष्म हीटर द्वारा. एक केंद्रीय निर्वात लाइन ASCF निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    * पनडुब्बी और अंतरफलक शैली रिकॉर्डिंग कक्षों के कई विभिन्न किस्मों में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. हमने देखा है कि स्लाइस एक अंतरफलक कक्ष में प्रदर्शन और अधिक मजबूत synaptic प्रतिक्रिया (यानी टुकड़ा humidified हवा और ACSF के साथ एक अंतरफलक पर बैठता है ) 2,11. हालांकि, responsivity आम तौर पर और अधिक स्थिर है जब स्लाइस ACSF में डूबे हुए हैं. नशीली दवाओं के छिड़काव भी डुबकी कक्षों में अधिक कुशल है.
  3. स्थिति को उत्तेजक और इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग. साथ उत्तेजक या उत्तेजना अलगाने पर दिया, लेकिन उत्पादन 0 से नीचे मिलाया, सीए 2 CA3 सीमा के निकट के सतह radiatum क्षेत्र (चित्रा 4 देखें) में टुकड़ा पर एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड की स्थिति. हम एक मुड़ प्लैटिनम iridium CA3 Schaffer संपार्श्विक फाइबर (एससी) के लिए 50-100 हमें दो अवस्था का दालों उद्धार तार का उपयोग करें. प्लैटिनम iridium तार और दो अवस्था का दालों का उपयोग कम से कम इलेक्ट्रोड ध्रुवीकरण में मदद कर सकते हैं. CA1 परत radiatum में एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड लोअर, सिर्फ टुकड़ा की सतह को तोड़ने. हमारे रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक ACSF भरा गिलास micropipette (~ MΩ 7 की नोक प्रतिरोध) में एक तार / एजी AgCl है. उत्तेजक औधधि पर उत्पादन बंद एक मध्यम स्तर (हम ~~ 150 μA हमारे उत्तेजना अलगाने सेट) और उत्तेजना दालों प्रशासन और Axon इंस्ट्रूमेंट्स, इंक से Clampex जैसे अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, का उपयोग धीरे धीरे छोटे में उत्तेजक इलेक्ट्रोड कम गतिविधि प्राप्त शुरू एक उत्तेजना artificact जब तक अंतराल CA1 में दर्ज की गई है. अगला, धीरे धीरे कम अंतराल में दोनों उत्तेजक और इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग, जबकि फाइबर (FV) वॉली और उत्तेजक postsynaptic (EPSP) संभावित आयाम अधिकतम स्तर तक पहुँच है (देखें चित्र 4B) तक CA1 प्रतिक्रियाएं प्राप्त जारी है.
  4. एक synaptic शक्ति वक्र की स्थापना और synaptic plasticity की जांच. एक synaptic शक्ति वक्र उत्पन्न करने के लिए, तेजी से उच्च तीव्रता और रिकॉर्ड वें पर अनुसूचित जाति के लिए प्रोत्साहन दालों उद्धारई CA1 में इसी गतिविधि. और उत्तेजना तीव्रता के स्तर इस्तेमाल किया की सीमा संख्या अलग अलग है लेकिन के लिए एक sigmoidal वक्र उत्पन्न जब या तो FV या EPSP (चित्रा 5) मूल्यों के खिलाफ योजना बनाई पर्याप्त होना चाहिए हो सकता है. FV आयाम presynaptic सक्रिय फाइबर के अनुपात का एक विश्वसनीय अनुमान प्रदान करता है, जबकि EPSP ढलान monosynaptic CA3 CA1 धाराओं के एक पवित्र उपाय प्रदान करता है. उत्तेजना तीव्रता के स्तर के पार FV के खिलाफ EPSP ढलान की साजिश रचने इसलिए सक्रिय afferents की संख्या प्रति EPSP के आकार को दर्शाता है और CA3 - CA1 synaptic ताकत का एक उत्कृष्ट अनुमान प्रदान करती है. आमतौर पर, आयु वर्ग के चूहों और APP/PS1 चूहों, युवा चूहों और उम्र से मिलान जंगली प्रकार चूहों के सापेक्ष जैसे 4,14 देख के क्षेत्र CA1 में synaptic शक्ति स्तर में काफी कम कर रहे हैं.
  5. स्लाइसें कि synaptic शक्ति वक्र के दौरान गरीबों के स्वास्थ्य के लक्षण (अधिक से अधिक EPSP आयाम अर्थात <1 mV) या hyperexcitability (यानी 2 या अधिक जनसंख्या spikes के रूप) दिखाने के सांख्यिकीय विश्लेषण (चित्रा 4C देखें) से बाहर रखा गया है. हमने पाया है कि इन स्लाइस को शायद ही कभी एक 60 मिनट की अवधि और / या synaptic plasticity के अधिष्ठापन के बाद उच्च चर प्रतिक्रियाओं दिखाने भर स्थिर प्रतिक्रियाओं एक्ज़िबिट. यह देखते हुए कि "अस्वस्थ स्लाइस" रिकॉर्डिंग कक्ष में हस्तांतरित सभी स्लाइस के बारे में केवल 10-20% के लायक है. इसके अलावा, हमारे अनुभव में, एक अस्वास्थ्यकर टुकड़ा की पहचान की आवृत्ति बहुत आयु, प्रजातियों, और जीनोटाइप भर में समान है.
  6. लंबी अवधि (LTP) स्लाइस में या लंबे समय तक अवसाद (लिमिटेड) potentiation प्रेरित. लिमिटेड LTP और स्थायी (LTP) और बढ़ जाती है synaptic सक्रियण के विभिन्न पैटर्न के जवाब में synaptic समारोह में घट जाती है (लिमिटेड) कर रहे हैं. दोनों प्रक्रियाओं को व्यापक रूप से सीखने और memory15 के लिए महत्वपूर्ण तंत्र को प्रतिबिंबित करने के लिए और तंत्रिका रोग और / सेलुलर तंत्र की जांच के लिए या स्मृति घाटे और 16 neurodegeneration ameliorating लिए pharmacologic रणनीति का आकलन करने के लिए उपयोगी परिणाम उपाय प्रदान करने के लिए माना जाता है.
    Synaptic plasticity प्रयोगों के लिए, 1 एम वी * सभी स्लाइस के लिए उत्तेजना तीव्रता रीसेट और आधारभूत उत्तेजना .033 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर शुरू. EPSP ढलान मान कम से कम 20 LTP या लिमिटेड के प्रेरण से पहले मिनट के लिए स्थिर होना चाहिए. बारीकी से इस समय के दौरान EPSPs निगरानी और उत्तेजना तीव्रता रीसेट अगर ढलान से अधिक 10% fluctuates और एक नया आधारभूत शुरू. LTP प्रेरित एक 100 हर्ट्ज या 100 हर्ट्ज हर 200 एमएस दिया उत्तेजना की उत्तेजना एकाधिक कम bursts (~ 10 दालों) की दूसरी गाड़ी का उपयोग. लिमिटेड प्रेरण के लिए, 1 हर्ट्ज की दर पर 900 उत्तेजना दालों उद्धार. LTP या लिमिटेड के अधिष्ठापन के बाद, एक अतिरिक्त 60 मिनट या उससे अधिक के लिए synaptic प्रतिक्रिया एकत्र. EPSP ढलान से पहले और उच्च / कम आवृत्ति उत्तेजना के बाद 60 मिनट प्राप्त मूल्यों LTP या लिमिटेड की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए तुलना कर रहे हैं.
    वृद्ध चूहों और APP/PS1 चूहों की कमी LTP और बढ़ाया लिमिटेड (देखें चित्र 5) शो करते हैं, और इन परिवर्तनों के लिए इन पशुओं 6,16 मॉडल में बिगड़ा अनुभूति के लिए योगदान के लिए सुझाव दिया गया है. हालांकि, APP/PS1 चूहों के विपरीत, LTP / लिमिटेड में आयु वर्ग के चूहों में परिवर्तन प्रयोगशालाओं भर में चर रहे हैं. वृद्ध चूहों आम तौर पर इसी तरह LTP "तीव्र" (यानी 100 हर्ट्ज) उत्तेजना के जवाब में वयस्कों की तुलना में स्तर एक्ज़िबिट, लेकिन देखने के शो घाटे जब मामूली उत्तेजना मापदंडों का इस्तेमाल कर रहे हैं (यानी कम प्रोत्साहन आवृत्तियों या कम प्रोत्साहन दालों) ( समीक्षा के लिए 4,6, 16). इसके अलावा, हमारा सहित कुछ प्रयोगशालाओं, लिमिटेड प्रेरण वृद्धि की संवेदनशीलता मनाया आयु वर्ग 2,17-19 चूहों में है, जबकि अन्य समूहों नहीं है या उनके आयु वर्ग के पशुओं में कम संवेदनशीलता अंतर पाया है. जैसा कि नीचे संक्षेप में चर्चा (चर्चा देखें), प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में सूक्ष्म लेकिन महत्वपूर्ण मतभेद इन विसंगतियों के लिए खाते सकता है.
    * उत्तेजना तीव्रता और EPSP आयाम LTP प्रेरण को प्रभावित कर सकते हैं और साहित्य में प्रतिकूल परिणाम का एक महत्वपूर्ण कारण हो सकता है. इस खंड में चर्चा आगे विचार किया जाएगा.

6. प्रतिनिधि परिणाम

हमारा काम है, और अन्य समूहों से काम करते हैं, यह पता चलता है कि ट्रिगर astrocyte आधारित भड़काऊ संकेतन में परिवर्तन और / या उम्र बढ़ने और ई. 13,20,21 दौरान neurologic रोग की रफ्तार बढ़. हाल ही में, हम endpoint के उपाय के रूप में synaptic शक्ति, LTP, लिमिटेड और इस्तेमाल किया है करने के लिए प्रभावकारिता और मध्य आयु वर्ग के APP/PS1 चूहों में कई उपन्यास विरोधी भड़काऊ अभिकर्मकों की कार्रवाई के तंत्र (इस मॉडल का वर्णन के लिए 22 देख) की जांच और आयु वर्ग फिशर 344 चूहों. नीचे दिए गए परिणामों को इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया गया.

एक उपन्यास विरोधी भड़काऊ एडिनो - जुड़े रहे हैं वायरल (AAV) हमारी प्रयोगशाला द्वारा विकसित अभिकर्मकों किया गया पायलट अध्ययन में दिखाया के लिए काफी synaptic शक्ति में वृद्धि (पी <0.05) और मध्य आयु वर्ग के में LTP (पी <0.05) घाटे को रोकने के (16 के महीने पुराने) APP/PS1 चूहों (n = उपचार हालत प्रति 4-6 स्लाइस). प्रतिनिधि synaptic शक्ति दो अलग स्लाइस, coll से घटता है और LTP प्रयोगोंएक ही 16 महीने की उम्र में APP/PS1 माउस से ected, 5A - सी चित्रा में दिखाए जाते हैं. एक टुकड़ा हमारे उपन्यास AAV के साथ इलाज गोलार्द्ध से निकाला गया था (अभिकर्मक एक), जबकि अन्य टुकड़ा नियंत्रण AAV अभिकर्मक (नियंत्रण) के साथ इलाज किया गया था. LTP दोनों दो 1 100 हर्ट्ज उत्तेजना (10 सेकंड intertrain अंतराल) के सेकंड गाड़ियों का उपयोग स्लाइस में प्रेरित किया गया था. ध्यान दें कि एक इलाज टुकड़ा अभिकर्मक के लिए synaptic शक्ति वक्र नियंत्रण टुकड़ा, अधिक से अधिक synaptic ताकत का संकेत के बाईं के लिए स्थानांतरित कर दिया है. यह भी ध्यान रखें कि, मध्य आयु वर्ग के चूहों APP/PS1 के लिए विशिष्ट, LTP आधारभूत तेजी से नियंत्रण टुकड़ा (23 उदाहरण के लिए) में सड़ा हुआ. इसके विपरीत, LTP हमारे उपन्यास अभिकर्मक के साथ इलाज टुकड़ा में थोड़ा सड़ा हुआ.

एक दूसरा हाल ही के अध्ययन में, हम वाहन इलाज आयु वर्ग के चूहों (पूर्व लिमिटेड आधारभूत <0.05 पी के 85%) में महत्वपूर्ण लिमिटेड मनाया. इसके विपरीत, कोई लिमिटेड उपन्यास "औषधि एक" विरोधी भड़काऊ (पूर्व लिमिटेड आधारभूत के 97%, महत्वपूर्ण नहीं) के साथ इलाज के आयु वर्ग के चूहों में मनाया गया. Synaptic ताकत पर कोई दवा प्रभाव मनाया गया. इस डेटा सेट (n = समूह प्रति 8-10 चूहों) से प्रतिनिधि लिमिटेड प्रयोगों 5D एफ चित्रा में सचित्र हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. उपकरण और सामग्री मस्तिष्क विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया, कागज तौलिया. बी, स्केलपेल ब्लेड. सी, Beebee कैंची. विकास, अस्थि rongeurs (चूहों के लिए). ई, अस्थि rongeurs (/ चूहों और चूहों के लिए). एफ, प्लास्टिक के चम्मच. जी, प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक. एच, hippocampal उपकरण. मैं, रंग. जम्मू, शल्य कैंची. कश्मीर, कांच पेट्री डिश.

चित्रा 2
चित्रा 2. कस्टम मस्तिष्क टुकड़ा चैम्बर जोत एक macrochamber.. बी, ढक्कन. सी, छिद्रित सिलिकॉन टयूबिंग के साथ एच 2 हे जलाशय. विकास, microchamber. ई, ACSF डिलीवरी ट्यूब (polyethylene). एफ, हे 2 प्रसव ट्यूब. जी, तापमान नियंत्रण के लिए बंदरगाह. एच, netted microchamber डालने.

चित्रा 3
चित्रा 3. RC22 डुबकी कक्ष एक, रिकॉर्डिंग कक्ष. बी, ग्राउंड इलेक्ट्रोड. सी, सुई आकांक्षा.

चित्रा 4
चित्रा 4. Hippocampal टुकड़ा चित्रण और कोशिकी waveforms एक अनुप्रस्थ hippocampal इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों में इस्तेमाल किया खंड के एक कार्टून. सीए = cornu Ammonis. महानिदेशक = दांतेदार गाइरस. अनुसूचित जाति = Schaffer collaterals. एस radiatum = परत radiatum. बी, अनुसूचित जाति (एक CA3 अक्षतंतु पथ) की बिजली उत्तेजना उत्तेजना artifact के elicits एक presynaptic जनसंख्या कील, या फाइबर वॉली (FV) द्वारा लगभग तुरंत बाद. FV के आयाम सीधे अनुसूचित जाति सक्रिय फाइबर की संख्या के लिए आनुपातिक है. नकारात्मक जा रहा है क्षेत्र उत्तेजक postsynaptic संभावित (EPSP) के चरण की ढलान प्रतिक्रिया में CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स में synaptic धाराओं depolarizing रिलीज के लिए अनुसूचित जाति टर्मिनलों से ग्लूटामेट के सक्रियण के लिए सीधे मेल खाती है. सी, अतिव्यापी प्रतिनिधि कोशिकी नौ एक "स्वस्थ" (बाएं पैनल) में विभिन्न उत्तेजना तीव्रता (3-50 μA) के स्तर के जवाब में CA1 परत radiatum में दर्ज waveforms, "अस्वास्थ्यकर", और "hyperexcitable" टुकड़ा. पांच waveforms स्तर प्रति औसत थे. स्वस्थ स्लाइस इस उत्तेजना की सीमा के पार गतिशील जवाब और एक सकारात्मक जा रहा जनसंख्या (CA1 neuronal निर्वहन दर्शाती है) उच्च स्तर पर प्रोत्साहन एक्ज़िबिट स्पाइक. RC22 डुबकी कक्ष में, अधिक से अधिक EPSPs आम तौर पर आयाम में 1.5 से 3 एम वी के लिए सीमा. अस्वस्थ स्लाइसें (मध्यम पैनल) अक्सर एक बड़े FV, लेकिन एक छोटे से अधिक से अधिक EPSP (<1 mV) प्रदर्शन और आम तौर पर गरीब plasticity दिखा. Hyperexcitable स्लाइसें (सही पैनल) दो या दो से अधिक EPSP के आरोही अंग में पुनर्योजी जनसंख्या spikes दिखा. Hyperexcitable स्लाइस में प्रतिक्रियाएँ अक्सर अस्थिर कर रहे हैं और variably लिमिटेड / LTP उत्तेजना से प्रभावित है.

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों मध्य आयु वर्ग के (16 राज्यमंत्री) APP/PS1 चूहों और आयु वर्ग के (22 राज्यमंत्री) फिशर 344 चूहों से तीव्र स्लाइस पर प्रदर्शन पैनलों अटल बिहारी शो डेटा APP/PS1 (AAV) एडिनो - जुड़े वायरल नियंत्रण के साथ इलाज चूहों से एकत्र. निर्माण (नियंत्रण) या एक उपन्यास AAV अभिकर्मक है कि हमारी प्रयोगशाला समूह द्वारा विकसित किया गया है (एक अभिकर्मक). नियंत्रण टुकड़ा करने के लिए सापेक्ष, टुकड़ा अभिकर्मक के साथ इलाज एक प्रदर्शन EPSP में एक चिह्नित बाई ओर शिफ्ट FV (ए): वक्र अधिक से अधिक synaptic ताकत का संकेत है. अभिकर्मक एक इलाज टुकड़ा भी मजबूत और स्थिर LTP (बी) दो 1 सेकंड, 100 हर्ट्ज उत्तेजना गाड़ियों की प्रसव के बाद पता चलता है, जबकि नियंत्रण टुकड़ा कमी LTP दर्शाती है, इस पशु मॉडल का विशिष्ट. पैनलों शो दो अलग - अलग आयु वर्ग के चूहों कि वाहन या एक उपन्यास विरोधी भड़काऊ दवा (औषध ए) के जीर्ण (4 सप्ताह) intrahippocampal perfusions प्राप्त से एकत्र आंकड़ों लोमो. बेसल synaptic शक्ति अपेक्षाकृत दवा इलाज से अप्रभावित(डी). हालांकि, नशीली दवाओं के एक बहुत लिमिटेड (ई) के शामिल होने को रोकने में प्रभावी था. सी और एफ शो प्रतिनिधि EPSP व्यक्तिगत स्लाइस पहले से दर्ज waveforms (पूर्व) और 60 मिनट के बाद (पोस्ट) LTP / लिमिटेड उत्तेजना की डिलीवरी. पैनलों ध्यान दें कि प्रोत्साहन कलाकृतियों नहीं दिखाए जाते हैं.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित चरणों का बीमा कि मस्तिष्क dissections के बाहर ले कम से कम के रूप में तेजी से और कुशलता से आयु वर्ग में युवा वयस्क चूहों में, करने में मदद करेगा. हम भी LTP और लिमिटेड पर अपने स्वयं के टुकड़ा अध्ययन सेट की शुरुआत के लिए पर्याप्त विवरण प्रदान करते हैं. यदि उम्र बढ़ने और synaptic समारोह और plasticity में ई. में परिवर्तन के आगे के अन्वेषण के अपने लक्ष्यों में से एक है, वहाँ कम से कम दो अन्य methodological मुद्दों, ऊपर के लिए alluded, कि आगे विचार के लायक हैं. सबसे पहले, कई प्रयोगशालाओं से पता चला है कि सीए 2 +: Mg2 + रिकॉर्डिंग में अनुपात ACSF hippocampal 2,10,24,25 स्लाइस में प्रेरण synaptic plasticity पर एक चिह्नित प्रभाव हो सकता है. स्तनधारी सी.एस.एफ. में, Ca 2 +: Mg2 + अनुपात लगभग एक (जैसे 26 देख). हालांकि, ACSF Ca 2 + Mg2 + 2 करने के लिए करीब अनुपात आमतौर पर synaptic समारोह और plasticity के टुकड़ा के अध्ययन में उपयोग किया जाता है. प्रारंभिक अध्ययन में, इस अभ्यास शायद LTP की प्रेरण का अनुकूलन करने के लिए अनुकूलित किया गया है, तो बाद में सभी plasticity के अध्ययन के लिए दिनचर्या बन गया है. हालांकि, उम्र बढ़ने और विज्ञापन के अध्ययन में इस अभ्यास समस्याग्रस्त neuronal 2 + विनियमन CA में अच्छी तरह से विशेषता मतभेद की वजह से किया जा सकता है . विशेष रूप से, 2 + बाढ़ और / या सीए 2 + प्रेरित Ca 2 Ca + रिलीज आयु वर्ग के चूहों और / या neuronal 3,27-31 सक्रियण के दौरान ई. मॉडल चूहों में ऊंचा है. लिमिटेड के प्रेरण विशेष रूप से ACSF Ca 2 + स्तर में सूक्ष्म परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है. हमारे प्रोटोकॉल, जो 2mm 2 Ca + और ​​2 Mg2 मिमी +, आयु वर्ग, लेकिन युवा दो नहीं वयस्क पशुओं, सामान्यतः लिमिटेड में परिणाम जबकि एक 2 Ca का उपयोग पढ़ाई + का उपयोग करता है: Mg2 + दो से करीब अनुपात, वयस्कों में मजबूत लिमिटेड मनाया है में एक उम्र 2,10 या आयु वर्ग के 32 चूहों में अंतर कम लिमिटेड के साथ संयोजन के रूप में की अनुपस्थिति. इन टिप्पणियों को ध्यान से ACSF Ca 2 + और ​​Mg2 + स्तर पर विचार जब Ca 2 + निर्भर वृद्ध और युवा वयस्क पशुओं में plasticity की तुलना की जरूरत पर प्रकाश डाला.

दूसरी methodological मुद्दे LTP के postsynaptic 33 विध्रुवण और synaptic शक्ति में संभव है / उम्र बढ़ने के जीनोटाइप मतभेद पर मजबूत निर्भरता का सवाल है. में एक ठेठ LTP प्रयोग, आधारभूत और LTP उत्तेजना तीव्रता आम तौर पर एक आधा अधिक से अधिक (या तीन चौथाई अधिकतम) आयाम EPSP का उत्पादन करने के लिए निकाला जाता है. संभावित समस्या यह है कि आयु वर्ग के चूहों और APP/PS1 चूहों आमतौर पर synaptic अपने युवा और / या जंगली प्रकार समकक्षों सापेक्ष शक्ति कम दिखाने के लिए, जिसका अर्थ है कि आधारभूत EPSP मान भी आयु वर्ग के चूहों और APP/PS1 चूहों में छोटा हो जाएगा. छोटे EPSPs LTP उत्तेजना के दौरान कम विध्रुवण अनुवाद, 33 LTP उत्प्रेरण के लिए एक कम संभावना में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है . इस संभावित उलझाना की वजह से, यह निर्धारित करने के लिए मुश्किल है कि क्या इन जानवरों के एक throughput घाटा, एक plasticity के घाटे या दोनों एक्ज़िबिट. यही है, वृद्ध और / या APP/PS1 चूहों में LTP प्रेरण तंत्र कार्यात्मक बरकरार हो सकता है (कोई plasticity की कमी), हो सकता है लेकिन इन शर्तों के तहत अपर्याप्त उत्तेजित (throughput के घाटे). यह अंतर महत्वपूर्ण है, throughput और plasticity के लिए तंत्र के लिए तंत्र के रूप में बहुत अलग एक विशिष्ट pharmacologic उपचार के लिए जवाब हो सकता है. हम सभी स्लाइस भर में एक ही स्तर (जैसे 1 mV) EPSP आयाम LTP उत्तेजना से पहले सामान्य से LTP प्रेरण पर कम throughput के प्रभाव को कम करने की कोशिश. अन्य रणनीतियों के रूप में अच्छी तरह से प्रभावी हो सकता है (जैसे वोल्टेज या वर्तमान दबाना का उपयोग करने के लिए समूहों में LTP उत्तेजना के दौरान झिल्ली संभावित बराबर) हो सकता है, और जब इन पशु मॉडल में LTP की जांच पर विचार किया जाना चाहिए.

Disclosures

इस वीडियो लेख के उत्पादन Leica माइक्रोसिस्टम्स द्वारा प्रायोजित किया गया था.

Acknowledgements

NIH अनुदान AG027297, केंटकी स्पाइनल कॉर्ड और सिर पर चोट रिसर्च ट्रस्ट से एक पुरस्कार, और Kleberg फाउंडेशन से एक उपहार के द्वारा समर्थित कार्य करें.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific BP358-1
KCl Fisher Scientific BP366-500
KH2PO4 (monobasic) Sigma-Aldrich P5379-100G
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643-500G
CaCl2 (dihydrate) Sigma-Aldrich C3306-250G
NaHCO3 Fisher Scientific S233-500
C6H12O6 (dextrose) Fisher Scientific BP350-1
Table 1. Reagents required
Erlenmeyer Flasks Fisher Scientific FB-500-2000 FB-500-1000
Aquarium Bubbler Used for oxygenating media. Available at most pet stores
50 mL Glass beaker Fisher Scientific 02-540G For brain storarge in ACSF
Parafilm Fisher Scientific 13-374-10
Small Animal Guillotine World Precision Instruments, Inc. DCAP-M
Flat paper towel
#11 Feather surgical blade Fisher Scientific 08-916-5B
Beebee bone scissors Fine Science Tools 16044-10
Lempert Rongeurs Roboz Surgical Instruments Co. RS-8321 Use for rats
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16020-14 Use for mice or rats
Hippocampus tool Fine Science Tools 10099-15
Spoon A plastic teaspoon will do
Spatula Fisher Scientific 21-401-25A Spatula
Surgical iris scissors Fine Science Tools 14058-09
plastic transfer pipets Fisher Scientific 13-711-43
110mm Whatman filter paper Fisher Scientific 09-805E Whatman cat. 1001-110
Glass petri dish Fisher Scientific
Leica VT1000P Manual Vibrating Microtome Vibratome VT1000P
0.1mm FA-10 Feather S blade Ted Pella, Inc. 121-9 0.1mm FA-10 Feather S blade
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (with rubber bulb) Fisher Scientific 13-678-20A For transferring slices: Tip is broken off and heat-polished for larger opening
35 mm Polysterine Culture dish Corning 430588 Used for collecting slices after dissection
Table 2. Tools and materials for dissection
Holding chamber Custom Made
P-97 Horizontal Pipette Puller Sutter Instrument Co.
Vibration isolation table Technical Manufacturing Corp.
Faraday cage Custom Made
Pyrex Aspirator Bottle with Bottom Sidearm Corning 1220-1L
Gravity-contolled IV set with regulator Baxter Internationl Inc. 2C8891
Central Vacuum Line Available in most modern labs
95% O2 / 5% CO2 Gas Mix Scott-Gross Co.
TygonTM Lab tubing For O2/CO2 delivery Fisher Scientific Non-toxic, non-oxidizing, comes in a variety of sizes.
Eclipse E600FN Microscope Nikon Instruments with 10x and 40x objectives, near infared filter, and GFP,DS-Red2 filters
Cool Snap ES Digital Camera Photometrics Cool Snap ES Digital Camera
X-Cite Fluorescent Illuminator EXFO X-Cite Fluorescent Illuminator
Microscope Platform Siskiyou, Inc. Custom assembled
RC-22 Submersible recording chamber Warner Instruments 64-0228 Requires P-1 platform and stage adaptor (Product # 64-0277 From Warner)
TC2BIP 2/3Ch Temperature controller Cell Microcontrols
4 Axis Manual Miniature manipulator Siskiyou, Inc.
Platinum Iridium Wire (0.002 in) World Precision Instruments, Inc. PTT0203
A365 Stimulus Isolator World Precision Instruments, Inc. A365 Stimulus Isolator
Multiclamp 700b Amplifier Axon Instruments
Digidata 1322A A/D converter Axon Instruments
PClamp software Axon Instruments
Personal Computer (Pentium 4) Dell
Table 3. Electrophysiology equipment and materials

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  32. Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats. Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).
  33. McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents. Brain Res. 157, 277-293 (1978).

Comments

30 Comments

  1. A great protocol and discussion. What kind of stimulating electrode do you use?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 3, 2011 - 12:16 PM
  2. Thank you Louise. We use platinum iridium wire to make a bipolar electrode. The last time we purchased this wire we used World Precision Instruments (cat # ptt050²). Let me know if you need any other info

    Reply
    Posted by: chris n.
    May 3, 2011 - 12:54 PM
  3. Great protocol. However, I have got a problem. I can observe huge fiber volleys but with small or no EPSPs. Do you know what could be the problem? Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 11, 2011 - 10:57 AM
  4. Hi Olivier. Thanks for the kind words. In re to huge FVs and small EPSPs...Sometimes the fix can be as simple as tweaking the placement of your stimulating and recording electrodes (e.g. adjusting the depth and distance between trodes). However, if you've tried this and are still having problems there are a few possibilities. It could be that the tissue is being damaged and/or mishandled during the dissection/slicing procedure. As we mentioned in the protocol above, tissue from old animals and amyloidogenic animals tends to be a little more vulnerable to damage caused by the slicing procedure. If you haven't already, you may try dissecting a young adult mouse/rat (31 C). EPSPs are generally smaller at colder temperatures. 3)Make sure the pH of the incubation/recording medium is between 7.35 and 7.45. In the past, I've found that slices tend to exhibit big FVs and small EPSPs when they're sitting in media with a low pH (<7.3). 4) Make sure the slices are getting oxygenated efficiently DURING incubation, else they will die :). Usually, if oxygenation is good during incubation, but poor during the recording, the slices start off looking good but then become hyperexcitable as the experiment progresses. I hope this info helps. If you've tried all these fixes with no luck, feel free to email me.

    Best,

    Chris

    Reply
    Posted by: chris n.
    October 11, 2011 - 12:52 PM
  5. Hi Chris,

    Thank you very much for your response but I think still need to bother you again. Indeed, it dŒs not seem to be related to the age of the animals. I think my slice are ok even if I use a McIlwain slicer. Indded, I had some responses last week (from 0.² to ² mV with immerged slices). Artefacts and fiber volleys were small compared to the responses. Now I can't see anymore proper responses (or very rarely) and as I said before, the amplitude of the fiber volley is huge (0.5-² mV) even for small stimulations. Moreover, it has two components a positive and a negative one. The artefact of stimulation became incredibly huge e.g 35 mV for a 100 us stimulation at 500 uA. Would you have any suggestion? I will test my headstage with the model cell. Thank you very much.

    Best regards,

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2011 - 2:42 PM
  6. Hi Olivier, sorry for the late response. If you wanted to send me a picture of your EPSP waveforms to my email address (should be listed somewhere above or on the .pdf), I'd be happy to take a look at them. If you send this to me, please include information on the type of stimulator unit and electrodes your using as well as your ACSF composition.
    Best,
    Chris

    Reply
    Posted by: chris n.
    October 18, 2011 - 12:12 PM
  7. Dear Chris,

    I have finally found the solution. Everything is working perfectly now. It was an issue with the glue I used for my holding chamber. Thank you again for your precious help.

    Kind regards,

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 19, 2011 - 5:18 AM
  8. Dear Olivier,
    I am having the exact same problem as you. Would you please be more specific about how you were able to correct it? It would be so helpful!
    Best regards,
    Cristiane

    Reply
    Posted by: Cristiane T.
    July 12, 2012 - 11:58 AM
  9. Dear Cristiane,

    As explained in me previous message my problem of poor viability and small responses was related to the holding chamber to keep the slices at 35°C before experimenting. However, low viability can be due to many other reasons. You should work fast, in presence of AMPA and or NMDA blocker (or low sodium solution). You should avoid to fold the hippocampal tissues etc....

    Hope it will help.

    Reply
    Posted by: Olivier P.
    July 16, 2012 - 4:12 AM
  10. Hi every body, i was really so glad when i see your web site, and i want offer my thanks for your great site.
    i am from shefa neuroscience research center in iran where managed by proff. ALI GORJI who one of the first person worked on spreading depression in the world.
    i am working on Spreading Depression too and use LTP technique.
    please contact with me by e-mail for Future cooperation.
    Best Regard
    ahmad ali

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2011 - 10:56 AM
  11. Hi, I got a problem with my hippocampal slice recording. When I just transferred my slices from that incubation beaker into recording chamber, a large fEPSP response can be recorded, but after sitting in that chamber for a while, the response tended to become smaller even disapper compared with that when slices were just put in chamber. I have tried to adjusted the rate of oxygenation and temperature to ensure sufficient oxygen supply and correct temperature. I can garantee that oxygen supply has no problem and temperature is in normal range (²6 -30 C). But the problem is still there. Somebody told me that is cause by a "heat shock" when slices are transferred to a warmer enviornment. Can you help to resolve this problem?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2012 - 7:03 PM
  12. hi, you should put your slice in chamber(²8- 30c) for 1 hour after you get slice. And after that you should transfer your slice to second chamber( LTP chamber) in 3²c.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 3, 2012 - 11:48 AM
  13. Hi,

    I suppose you can't record at 35°C, don't you? May be the problem is that your slice moves slightly during the recording. Did you try to change the position of your recording electrode to see if you can recover a response with the initial amplitude?

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 1:21 PM
  14. Yes, I did. I move the recording electrode to several different positions trying to elicite a good amplitude. But the problem is still there. I have noticed that after sitting in the recording chamber for a while, the slices tended to lost activity. No matter where you put the recording electrode, you cannot recover a good amplitude as the initial one. I suspected that was caused by a slow flow rate, which is 1.5-² ml/min in my chamer. My chamer is different from others, because I currently use a blind method to record fEPSPs and eEPSCs. So my chamber is bigger than others with approximately 1-² ml volume for fluid exchange. I am trying to increase that flow rate to ².5-3 ml/min to see what will happen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 3:26 PM
  15. Hi, sorry to hear about the problems you're having. Are your slices submerged in the recording chamber or at an interface with the air? Is your stimulus artifact changing, or just the synaptic response? What about the fiber volley, dŒs it die too? How do you know that the oxygen levels in your media are adequate? If your recording chamber is wide and your bath shallow, that would provide quite a bit of surface area for the oxygen to escape. Testing the bath pH with a micro pH meter would help determine if O² levels are stable. If you're worried about heat shocking the slice when you transfer it to the recording chamber, you could try slowly bringing the temperature of the media in your holding chamber up to recording temperature during the incubation period (maybe raising it 1 or ² degrees every 10-15 min).

    Reply
    Posted by: chris n.
    January 17, 2012 - 3:56 PM
  16. Hello again, I want to know the distance between stimulating electrode and recording one in your experiments. Some people put them in a very short distance (²00-300 micrometers). In my experiments, I usually put the stimulating electrodes at the initial part of the schaffer collateral fibers in CA1 area, and put that recording ones at a site as far as possible to avoid the large artifacts, but sometimes I was unable to get a stable LTP after HFS. I believe the reasons for that might be that many neural circuits are activated during HFS including inhibitory ones, because more circuits can be activated simultaneously with the increased distance. Is that correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 25, 2012 - 5:03 PM
  17. I need more detail, since I am still facing some problem.

    Reply
    Posted by: Zaman K.
    February 9, 2012 - 2:38 AM
  18. Finally, I found out the problem that leads to loss of viability of the hippocampal neurons in my experiment. It was caused by my chamber, which is so different from others. It has a very large volume, with a large surface. So I was assuming that my problem was caused by the anoxia resulted by rapid diffusion of ACSF into the large shallow surface. I already increase the flow rate to ².5 ml/min in my previous chamber, but still had that problem. So I made a polycarbonate slice chamber according to Warner company's criteria. Now I can get a pretty stable response throughout my experiment.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 2:02 PM
  19. What is the significance of air interface vs. submerged slices, is one better than the other?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 2:38 PM
  20. BTW, the criteria to judge the anoxia is the production of bubble in the chamber. If you see the bubble present in the chamber, that means the ACSF is oxygen-saturated. Heating makes the extra oxygen escape from the solution. If not, the ACSF is not saturated by oxygen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 3:10 PM
  21. Good for morale to read that I'm not the only one having problems with acute slices. Due to the comments above I'm going to try a few new things with my set-up. It MIGHT just be the oxygen-saturation, since I pre-heat the ACSF to 4² Celsius, trying to record at ~34 Celsius AND have a relative large chamber. Temperatures are experimental variables of the design.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 28, 2012 - 11:15 AM
  22. Increasing the perfusion rate to 4 ml/min and changing to a bath that is diamond shaped and has a far lower volume were the solution. Getting a decent signal is still something of a black magic. =/

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 13, 2012 - 7:14 AM
  23. Thank you for sharing your protocol - excellent video.

    Is there an advantage to dissecting out the hippocampus before slicing, as opposed to slicing the whole brain (or one hemisphere of the brain)?

    If I am not mistaken, you cite "netting" in the bottom of the recording chamber. DŒs that mean that the slice is suspended off of the bottom of the chamber?

    Is the resistance of the recording pipette a critical factor?

    Thank you,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 24, 2012 - 5:33 AM
  24. Hi Chris, sorry for the late reply. For rats, whole hemisphere slices are fairly large and can be a bit of a problem if you have small recording and holding chambers. Also, the hippocampus in an adult rat is fairly easy to dissect away. For mice, on the other hand, the hippocampus is very small and a little trickier to dissect out (though it can certainly be done effectively). You can therefore save time by simply slicing the whole mouse hemisphere into sections. And unlike the rat, whole hemisphere mouse slices aren't so big that they are difficult to work with and store. In re to netting: yes we do use netting, which raises the slice off of the bottom of the dish. In re to the recording pipette resistance: we typically use smaller tip diameters to minimize damage to the recording region of the slice.

    Reply
    Posted by: chris n.
    June 19, 2012 - 4:36 PM
  25. Hi, Prof. Norris:
    Great protocol to follow and precious comments to refer to. As a beginner to this tech, I have a few questions in my mind.
    1. Some papers claimed that they used sucrose-ACSF(0 Na 0 Ca) as the dissection medium, some even put AMPAR/NMDAR blocker(i.e. Kynurenic acid) and/or ascorbic acid in. According to your experiences, is there any difference btw sACSF and normal ACSF to the slice health? Is postsynaptic blocker and/or ascorbic acid necessary?
    ². In some literatures, they used different ways of anesthetization, such as barbiturates, TCA, ether, isoflurane, halothane etc. DŒs anesthetizing method affect the slice quality and the electrophysiological results? In this paper, you used CO², were there any possibility that the brain might get some anoxia-like influence or damage?
    3. For holding and recording temperatures, I found variable ways in different papers, is there any general principle of how to set the proper temperatures? In your paper, after slicing all the brain sections(put in ice cold 0Ca ACSF temporally), and tranfering them to ²7degree and gradually elevating temperature, is my understanding correct? Could you please tell me how much time will each step take(i mean, "cutting"->"temporally storage"->"recovery solution")?
    4. What are the proper cutting speed (mm/min) and vibrating frequency for hippocampal slices?
    5. what cutting direction is proper? longitudinally from CA3 corner to DG corner or the opposite, or laterally across hippo? or it dŒsn't matter?
    Thanks so much!
    sincerely,
    Hang

    Reply
    Posted by: Hang Z.
    January 30, 2013 - 8:13 PM
  26. I have another question:
    6. In re to literatures, some used bipolar twisted electrodes and some used concentric electorde, do you have some comments to these two types?

    Reply
    Posted by: Hang Z.
    January 30, 2013 - 8:21 PM
  27. i am very interesting the custom brain slice holdiing chamber, would you mind sharing the supplier?
    Thank you.

    Reply
    Posted by: CHIA S.
    March 26, 2013 - 3:23 AM
  28. Hi,

    I was very excited when I came across this video/article today, since my Masters project is going to be entirely based on recording after LTP induction on adult mouse hippocampi in vitro.

    I have just started trying to obtain decent slices, and have only gotten so far as extracting the brain from the mouse with acceptable quality. All that comes after has been a little bit frustrating so far. So, I have a few questions regarding the slicing step itself (we have the very same vibratome at our lab, which makes things easier, I guess!):

    - Every time I try to slice the brain, the blade actually pushes the brain away instead of cutting through it! This leads to either a completely useless slice or not even that, as the blade will only cut the last few milimiters of the brain and yield something not even worth calling a slice! The blades are brand new, but I bought them at a drugstore and they were intended to be shaving blades. Might that be the issue, a blade not sharp enaugh?

    - I haven't yet tried separating the hemispheres. Maybe I should do that!

    - I see you use this little block onto which you glue the brain (hippocampus, in your case). I've been using a sort of plate attached to the vibratome, which gŒs in the same place as the block. Do you reckon the block is a better call?

    - Do you have a better method for drying the cutting chamber after using it than letting the ice thaw and then sucking it up with vacum?

    If there are any remarks you should think of that haven't been shown in the video regarding the actual slicing step, I'd apreciate if you could share!

    Best regards,

    Thomaz Dias
    UFMG - Brazil

    Reply
    Posted by: Thomaz L.
    March 28, 2013 - 5:16 PM
  29. Great information here. I have a quick question about the aCSF containing bottle; would you keep it at room temperature or in a water bath at 34 degrees C?

    I will be recording at 34 degrees with a recording chamber heater and was wondering what would be the best way to hold the aCSF that is coming into the chamber?.

    I know there is an inverse relationship with dissolved oxygen and temperature in water, but would it be better to have it constant in the bottle and chamber or best to have it room temperature in the bottle and warm upto 24 degrees in the chamber?

    Any advice would be much appreciated.

    Minos

    Reply
    Posted by: Minos K.
    July 12, 2013 - 11:50 AM
  30. Hi
    Your projects are amazing. Oh here I can’t help sharing some experience of fabrication after designs done.
    We are working with a OverMolding vendor in China the name is Zetar Industry (http://www.zetarmold.com), Located in Shanghai China (a very big modern city). They are really good.Moving fast and very professional. They helped me with my new design. I asked them to do the injection mold, then Injection Moldingmass production. I was surprised by their rich experience in Insert Molding
    and punched lead time. Guys in Zetar deserve every good word just as you are.

    Reply
    Posted by: info z.
    September 2, 2013 - 11:16 AM

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