Induktion och övervakningen av en aktiv Fördröjda överkänslighetsreaktioner (DTH) hos råttor

Published 7/19/2007
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Fördröjd överkänslighet (DTH) är en inflammatorisk reaktion medierad av CCR7-effektor lymfocyter minne T. Här visar vi hur du framkalla aktiv DTH i Lewis råttor och övervaka det inflammatoriska svaret.

Cite this Article

Copy Citation

Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats. J. Vis. Exp. (6), e237, doi:10.3791/237 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fördröjd överkänslighet (DTH) är en inflammatorisk reaktion medierad av CCR7-effektor lymfocyter minne T som infiltrerar injektionsstället av ett antigen mot vilket immunförsvaret har primade. Den inflammatoriska reaktionen kännetecknas av rodnad och svullnad på platsen antigena utmaning. Det är en praktisk modell för att bestämma in vivo-effekten av immunosuppressiva medel. Kutan DTH kan induceras antingen genom adoptiv transfer av antigen-specifika T-lymfocyter eller genom aktiv immunisering med ett antigen, och efterföljande intradermalt utmaning med det antigen att framkalla den inflammatoriska reaktionen i ett visst hudområde. DTH svar kan förmås att olika antigener, t.ex. äggalbumin, tuberkulin, stelkramp, eller nyckelhål ostronpest hemocyanin (KLH).

Här kan vi visa hur man framkalla en aktiv DTH reaktion i Lewis råttor. Vi kommer först fram en vatten-i-olja emulsion av KLH, vår antigen av intresse, i fullständig Freunds adjuvans och injicera denna emulsion subkutant till råttor. Detta kommer att prime immunförsvaret att utveckla celler minne T riktad till KLH. Sju dagar senare kommer vi att utmana råttor intradermalt på baksidan med KLH på ena sidan och med äggalbumin, en irrelevant antigen, på andra sidan. Den inflammatoriska reaktionen kommer att vara synlig 16-72 timmar senare och de röda och svullna området kommer att mätas som en indikation på DTH svårighetsgrad.

Protocol

1. Beredning av emulsion

  1. Emulsionen är en 1:1 blandning av antigen (DTH kan förmås att olika antigener: äggalbumin, tillade stelkramp, nyckelhålet ostronpest hemocyanin ....) i vattenlösning för att slutföra Freunds adjuvans. Det är mycket viktigt att lägga antigen i adjuvant och inte tvärtom!

  2. Det finns en hel del avfall när de gör och injicera en emulsion, så alltid förbereda 1,5 eller 2 gånger mer än vad du behöver.

  3. Lös antigen i saltlösning för att förbereda en 2 mg / ml. Inte filtret, eftersom du inte vill förlora aggregaten!

  4. Sätt komplett Freunds adjuvans H37Ra (Difco, katalog # 231.131) i ett rör och vortexa med hög hastighet. Lägg till antigen droppvis medan vortexa. När alla antigenet läggs virvel i 5 minuter. Blandningen ska bli vit.

  5. Sätt emulsionen i ett glas spruta och länka den till en annan glasspruta med en 18G bro (Fisher katalog # 14-825-17L). Skicka emulsionen från spruta till den andra tills det blir svårt (5-10 min). Det är bäst att använda två 5 ml sprutor. Om mer än 5 ml emulsion krävs, använda flera uppsättningar av 5 ml sprutor.

  6. Emulsionen kan förvaras i sprutorna vid 4 ° C i 3 veckor.

2. Immunisering av råttorna

  1. Blanda emulsionen i sprutor under några minuter och transfer till sprutan som används för injektionen. Injicera 200 ml subkutant i 1-2 platser vid basen av svansen med hjälp av 23G nålar och ett Luer-Lok Tips 3 ml spruta.

3. Utmana med antigen i ryggen

  1. Sju dagar efter vaccination, raka 2 fläckar på ryggen på råttor och injicera intradermalt 20 ml av en 1 mg / ml antigen lösning i en plats och koksaltlösning (eller irrelevanta antigen) i den andra platsen. Filtrera inte antigenet lösning, eftersom du kan förlora aggregat som förstärker den inflammatoriska reaktionen.

  2. Råttorna ska anesthesized att undvika rörelser. Injicera lösningen intradermalt med hjälp av 27G ½ nålar och sprutor 1 ml. Byt nålar mellan injektionerna.

    Obs: utmaningen kan göras i ytterörat på öronen istället för tillbaka för mer exakta mätningar. Se video med http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. Mätning av DTH

  1. Injektionsstället börjar bli röda och svullnad som ett tecken på inflammation. Mät diametern på det inflammerade området med hjälp av en linjal eller ännu bättre, en tjocklek. Den maximala svullnaden skulle uppstå mellan 24 och 72 timmar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För en mer exakt mätning av DTH-reaktionen rekommenderar vi utmanar råttorna med antigenet i ytterörat av örat. Reaktionen kan då mätas som en skillnad i örat svullnad mellan de berörda antigen-utmanade örat och örat utmanas med antingen koksaltlösning ensam eller med irrelevanta antigen. En demonstration av utmaningen i örat visas i 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna är grundare och konsulter Airmid Inc.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra Reagent Difco Laboratories 231131 Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin Reagent Sigma-Aldrich H-5654
Ovalbumin Reagent Sigma-Aldrich A-5503
5 ml glass syringes Tool Fisher Scientific 14-823-10 B Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge Tool Fisher Scientific 14-825-17L
Lewis rats Animal Harlan Laboratories Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles Tool Fisher Scientific 14-826 AA It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes Tool Fisher Scientific 05-561-63
DPBS Reagent GIBCO, by Life Technologies 14040-182
1 ml regular tip syringes Tool Fisher Scientific 22-257-154
27G 1/2" needles Tool Fisher Scientific 14-826-48
Electric cordless trimmer Tool Braintree Scientific, Inc. CLP-32130 To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthcoming.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats