Protokoll für die rekombinante RBD-basierte Impfstoffe SARS: Protein Preparation, Animal Impfung und Neutralisation Erkennung

Immunology and Infection
 

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein allgemeines Verfahren für die Untersuchung rekombinanten Rezeptor-bindende Domäne (RBD)-basierte Subunit-Impfstoffe gegen SARS. Es umfasst Methoden für die Transfektion und Expression von RBD-Protein in 293T-Zellen, Immunisierung von Mäusen mit RBD und den Nachweis von Neutralisation Aktivität Mausseren anhand eines etablierten SARS pseudovirus Neutralisationstest.

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Du, L., Zhang, X., Liu, J., Jiang, S. Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection. J. Vis. Exp. (51), e2444, doi:10.3791/2444 (2011).

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Abstract

Basierend auf ihr Sicherheitsprofil und die Fähigkeit, wirksame Immunantwort gegen Infektionen auslösen, haben Subunit-Impfstoffe als Kandidaten für eine Vielzahl von Krankheitserregern 1-3 verwendet worden. Da die Säugetierzellen ist in der Lage post-translationale Modifikation, wodurch richtig gefaltet und glykosylierte Proteine ​​sind rekombinante Proteine ​​in Säugetierzellen exprimiert das größte Potenzial, um hohe Antigenität und Immunogenität 4-6 pflegen gezeigt.

Obwohl keine neuen Fälle von SARS seit 2004 berichtet wurden, sind zukünftige Ausbrüche eine ständige Bedrohung, daher ist die Entwicklung von Impfstoffen gegen die SARS-CoV einer vorsichtigen vorbeugenden Schritt und sollte durchgeführt werden. Die RBD des SARS-CoV S-Protein spielt eine wichtige Rolle in Rezeptor-Bindung und die Induktion von spezifischen neutralisierenden Antikörper gegen Virus-Infektion 7-9. Daher wird in diesem Protokoll, beschreiben wir neuartige Methoden für die Entwicklung eines RBD-basierte Subunit-Impfstoff gegen SARS. Kurz gesagt, wurde das rekombinante RBD-Protein (rRBD) im Kulturüberstand von Säugetier-293T-Zellen exprimiert, um ein korrekt gefaltetes Protein mit der richtigen Konformation und eine hohe Immunogenität 6 zu erhalten. Die Transfektion der rekombinanten Plasmid kodiert RBD zu den Zellen wurde dann mit Hilfe einer Calciumphosphat-Transfektion Methode 6,10 mit einigen Änderungen. Verglichen mit dem Lipid Transfektionsmethode 11,12, ist dieser modifizierten Calciumphosphat-Transfektion Methode billiger, einfacher zu handhaben und hat das Potenzial, eine hohe Wirksamkeit einmal Transfektion Komplex mit geeigneter Größe und Form ist 13,14 gebildet erreichen. Schließlich wurde eine SARS pseudovirus Neutralisationstest in das Protokoll eingeführt und verwendet werden, um die neutralisierende Aktivität der Seren von Mäusen mit rRBD Protein geimpft zu erkennen. Dieser Test ist relativ sicher, nicht um eine ansteckende SARS-CoV, und kann ohne das Erfordernis eines Biosafety-3-Labor 15 durchgeführt werden.

Die hier beschriebene Protokoll kann auch zur Gestaltung und das Studium rekombinanter Subunit-Impfstoffe gegen andere Viren, die mit Klasse-I-Fusionsproteine, z. B. HIV, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Ebola-Virus, Influenza-Virus, sowie Nipah und Handra Viren sein. Darüber hinaus können die Methoden zur Erzeugung eines pseudovirus und anschließend über eine pseudovirus Neutralisationstest auf alle diese Viren angewendet werden.

Protocol

1. Rekombinante SARS-CoV RBD Protein Preparation

  1. Bereiten Calciumphosphat Transfektionsreagenz
    1. 2X HBS-Puffer Zubereitung: Mischen Sie 16 g NaCl, 0,4 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O und 13,0 g HEPES. Der pH-Wert auf 7,00 und bringen Gesamtvolumen von 1000 ml in destilliertem Wasser. Nach Filtrieren der Lösung für die Sterilisation, Aliquot und speichern Sie es bei -20 ° C.
      Hinweis: Jede Veränderung des pH-Wertes würde die Transfektion Ergebnisse beeinflussen. So ist es ratsam, mehrere pH-Werten um 7,00 (z. B. 6.99, 7.00, bzw. 7,01) Test und finden Sie das beste für die Transfektion mit der Methode eingeführt unten.
    2. 2,5 M CaCl 2 Vorbereitung: In 73,5 g CaCl 2 · 2H 2 O in destilliertem Wasser in einem Endvolumen von 200 mL. Filtern Sie die Lösung und bei -20 ° C.
  2. Das rekombinante Plasmid-Transfektion und Proteinreinigung
    1. Split 293T-Zellen bei 50-70% Konfluenz 24 h vor der Transfektion. Wachsen Zellen in T-175 cm 2 Zellkulturflaschen in 40 ml DMEM mit 10% Hitze-inaktiviertes (HALLO) FBS und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) bei 37 ° C in 5% CO 2.
    2. Alle Transfektionsreagenzien sollten auf Raumtemperatur gebracht werden, bevor der Transfektion. Diese Reagenzien sind 2X HBS, 2,5 M CaCl 2, DIH 2 O, und rRBD Plasmid 6.
      Hinweis: Die endgültige rekombinante Plasmid verwendet für die Proteinexpression ein Signalpeptid enthalten sollte, um die Sekretion des exprimierten rekombinanten Proteine ​​im Kulturüberstand gewährleisten zu konstruieren. A 6x His-Tag kann der C-Terminus des exprimierten Proteins für eine einfache Reinigung hinzugefügt werden.
    3. Bereiten Sie eine 50 ml (A) und 15 ml (B) BD Falcon-Röhrchen, und fügen Sie Reagenzien, die Rohre, wie in Tabelle 1 angegeben. Hinzufügen weiterer 2X HBS Puffer Rohr A. In Rohr B, fügen 2.5M CaCl 2 und rRBD Plasmid, und bringen Sie die Lautstärke auf den Bedarf in DIH 2 O.
      A. Ein T-175 cm 2 Zellkulturflasche (4000 ul / Kolben): Vorbereitung auf rRBD Ausdruck
      Rohr A Rohr B
      2X HBS 2000 ul 2.5M CaCl 2 200 ul
      rRBD Plasmid-DNA 40 ug
      DIH 2 O zu 2000 ul
      B. Ein 100-mm-Petrischale (1000 ul / Schale): Vorbereitung auf SARS pseudovirus Produktion
      Rohr A Rohr B
      2X HBS 500 ul 2.5M CaCl 2 50 ul
      SARS-CoV S Plasmid-DNA 5 ug
      HIV-1-Plasmid (pNL4-3.luc.RE) 5 ug
      DIH 2 O zu 500 ul
      Tabelle 1. Transfektion Gemischaufbereitung und Volumina
      Die Volumina in Tabelle 1 aufgelistet sind für eine Transfektion Einheit. Wenn mehr Flaschen oder Geschirr für die Transfektion eingesetzt werden, stellen Sie Volumen entsprechend.
    4. Fügen Sie die DNA-Calcium-Lösung in Rohr B in das Rohr A in einem tropfenweise Weise, während eine konstante und schonende Durchmischung in einen Strudel. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur stehen lassen für 20-30 min. Der Schlüssel für eine erfolgreiche Calciumphosphat-Transfektion hängt von der Größe und Form der Niederschlag gebildet. So sollte die Mischung kontinuierlich und langsam verwirbelt werden, um diese Anforderung zu erfüllen und, als Folge, zu verbessern Transfektion Wirksamkeit.
    5. Add-Gemisch in einer tropfenweise und sogar Weise in 293T-Zellen (4000 ul / Kolben). Kultur-Zellen im Brutschrank bei 37 ° C in 5% CO 2.
    6. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischem serumfreien OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium (50 ml / Flasche) 8-10 h nach der Transfektion. Weiter zur Kultivierung von Zellen für zwei Tage in dem gleichen Zustand.
    7. Sammeln enthaltende Überstand ausgedrückt rRBD Protein 72 h nach der Transfektion. Zentrifugation bei 6000 rpm für 15 min, um Zelltrümmer zu entfernen. Add-Protease-Inhibitor-Cocktail, um die gesammelten Überstand und lagern bei 4 ° C über Nacht.
    8. Am nächsten Tag, zu reinigen rRBD rekombinanten Proteins aus dem Kulturüberstand mittels Ni-NTA Superflow folgenden Anweisungen des Herstellers.
    9. Konzentrieren Sie sich gereinigtes Protein mit Amicon Ultra -15 Konzentration Röhren. Nach Proteinkonzentration,add PBS, um die Konzentration-und Zentrifugenröhrchen wieder Imidazol in Elutionspuffer zu entfernen. Berechnen Proteinkonzentration und speichern gereinigtes Protein bei -80 ° C bis zur Verwendung.

2. Maus Immunisierung und Probennahme

  1. Pre-warm Sigma Adjuvans-System (SAS) auf 40-45 ° C nach den Anweisungen des Herstellers. 1 ml PBS pro Fläschchen geben und gut mischen.
  2. Bereiten Protein-Adjuvans-Emulsion nach dem Protokoll in Tabelle 2. Pipette berechnet rRBD Protein in ein 1,5 ml-Röhrchen. Add gleichen Volumen SAS adjuvant mit dem Rohr und kräftig vortexen für 2-3 min, um Emulsion zu bilden.
    Hinweis: Die Volumina in Tabelle 2 aufgelistet sind für eine Maus. Lautstärkeanpassung entsprechend der tatsächlichen Maus Zahlen verwendet. Für jede Gruppe, mischen die Proteine ​​und Adjuvans für jeden Impfstoff erforderlich. Immer bereiten eine zusätzliche Probe für die Impfung, um die Genauigkeit zu gewährleisten.
    Gruppe 1 M. Impfstoff
    (200 ul / Maus)
    2. Impfung
    (200 ul / Maus)
    3 rd-Impfstoff
    (200 ul / Maus)
    rRBD Protein 20 ug Protein in PBS
    (100 ul) + 100 ul SAS
    10 ug Protein in PBS (100 ul) + 100 ul SAS 10 ug Protein in PBS (100 ul) + 100 ul SAS
    PBS-Kontrolle 100 ul PBS +
    100 ul SAS
    100 ul PBS +
    100 ul SAS
    100 ul PBS +
    100 ul SAS
    Tabelle 2. Maus Immunisierungsprotokoll
  3. Subkutan prime-Immunisierung weibliche BALB / c-Mäuse (4-6 Wochen alt, 5 Mäuse / Gruppe), und steigern Sie zweimal mit rRBD und SAS als in Tabelle 2 angegebenen. Verwenden Sie PBS-Gruppe als Kontrolle. Der Standort für die subkutane Injektionen in der Regel gewählt wird, die lose Haut zwischen den Schulterblättern. Alternativ ist der ventralen Bauch häufig verwendet, weil es einfacher ist zu injizieren, und kann jede Leckage aus der Injektionsstelle zu beobachten. Bei der wiederholten Dosen von Impfstoffen verwendet werden, ist es einfach, verschiedene Injektionsstellen wählen, verhindern, dass potenzielle lokale Hautreaktionen.
  4. Bleed Mäusen über retroorbitalen mit Betäubung vor der Immunisierung und 10 Tagen nach jeder Impfung und Wärme Seren bei 56 ° C für 30 min auf Komplement zu inaktivieren. Shop Mausseren bei -20 ° C bis zur Verwendung.

3. Neutralisation Erkennung anhand Pseudovirus Neutralisationstest

  1. Bereiten SARS pseudovirus
    1. Split 293T-Zellen in 100 mm Gewebekultur-Petrischalen (2x10 6 Zellen / Schale) 16 h vor der Transfektion und wachsen Zellen wie oben beschrieben.
    2. Bereiten Transfektionsreagenzien wie in Tabelle 1 angegeben. Co-Transfektion ein Plasmid kodiert SARS-CoV S-Protein und ein Plasmid kodiert Env-defekt, Luciferase-exprimierende HIV-1-Genoms (pNL4-3.luc.RE) mit Calciumphosphat Transfektionsreagenz.
    3. Ersetzen-Medium mit 10 ml frischem DMEM mit 10% FBS und 1% P / S 8-10 h nach der Transfektion. Sammeln enthaltende Überstand SARS pseudovirus 72 h nach der Transfektion.
    4. Filter pseudovirus durch ein 0,45 um-Filter. Aliquotieren und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  2. SARS pseudovirus Neutralisationstest
    1. Split 293T-Zellen, die SARS-CoV-Rezeptor ACE2 (ACE2/293T) bei 10 4 Zellen/100 ul / well in 96-well-Zellkulturplatten 16 h vor der Infektion.
    2. Verdünnen SARS pseudovirus durch 2-fach auf die Virustiter in ACE2/293T Zellen zu erkennen.
    3. Serienmäßig verdünnen Mausseren in 96-well-Zellkulturplatten, und fügen Sie gleichen Volumen titriert SARS pseudovirus. Vorinkubieren die Platten bei 37 ° C für 1 h.
    4. Nach der Inkubation mit 100 ul der sera-pseudovirus Mischung ACE2/293T Zellen und weiterhin Zellen bei 37 ° C wachsen in 5% CO 2. Fügen Sie frisches DMEM 24 h später.
    5. Vollständig zu entfernen Kulturüberständen von den Platten 72 h nach der Infektion. Add 1X Luciferase Zellkultur Lysereagens (60 ul / well) und die Förderung der Zelllyse unter ständigem Schütteln der Platten für 1-2 h bei Raumtemperatur.
    6. Transfer-Zelllysaten (50 ul / well) in Luminometer Platten (Microfluor 96-Well-Platten). Add Luciferase Substrat (50 ul / well) in Luciferase-Assay-Systems, sowie erkennen relativen Luciferaseaktivität in Ultra 384 Luminometer.
    7. Berechnen SARS pseudovirus Neutralisation Titer und Gegenwart als 50% der Patienten neutralisierende Antikörper-Titer (NT 50) 6.

Discussion

Die Zelldichte ist ein wichtiger Faktor für die Wirksamkeit von Calciumphosphat-basierte Transfektion. Nach unserer Erfahrung bringt weniger als 70% Konfluenz der Zellen die besten Ergebnisse. So, um die Transfektionseffizienz zu verbessern, wird empfohlen, dass die Zelldichte bei ca. 50-70% der Konfluenz gehalten werden. Die Calciumphosphat-Transfektion Methode wird allgemein angenommen, weniger effizient zu sein im Vergleich zu anderen Transfektion Methoden, wie Lipid-Transfektion 16. Allerdings ist in diesem Protokoll verwendeten wir eine modifizierte Calciumphosphat-Transfektion Methode, bei der konstanten und langsamen Vermischung der Transfektion Lösung in einen Wirbel sorgt die Bildung eines Niederschlags mit der entsprechenden Größe und Form und verbessert so die Transfektionseffizienz.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (NIH) der Vereinigten Staaten (RO1 AI68002) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Na2HPO4*7H2O Sigma-Aldrich S2429
HEPES Sigma-Aldrich H3375
CaCl2*2H2O Sigma-Aldrich C5080
DMEM Invitrogen 12430
HI FBS Invitrogen 10438
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140
OPTI-MEM I Medium Invitrogen 31985
Protease inhibitor cocktail Roche Group 11836170001
Ni-NTA Superflow Qiagen 30450
Sigma adjuvant system Sigma-Aldrich S6322
Luciferase assay system Promega Corp. E1501
Luciferase cell culture lysis reagent (5X) Promega Corp. E1531
Amicon Ultra - 15 EMD Millipore UFC901024
Microfluor 96-well plates Thermo Fisher Scientific, Inc. 7905
Ultra 384 luminometer Tecan Group Ltd.

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References

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