रक्त जनित बृहतभक्षककोशिका कैरिज Nanoformulated एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं के लिए तरीके विकास

* These authors contributed equally
Bioengineering
 

Summary

Indinavir, ritonavir, इफावरेन्ज और atazanavir के नैनोकणों गीला मिलिंग, homogenization और ultrasonication का उपयोग कर निर्मित किया गया. इन nanoformulations, सामूहिक करार दिया एंटीरेट्रोवाइरल (nanoART) चिकित्सा, बृहतभक्षककोशिका आधारित दवा वितरण का मूल्यांकन nanoformulated. Monocyte व्युत्पन्न बृहतभक्षककोशिका nanoART तेज प्रतिधारण, और निरंतर जारी निर्धारित किया गया है. इन प्रारंभिक अध्ययन में नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए nanoART की क्षमता का सुझाव देते हैं.

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Balkundi, S., Nowacek, A. S., Roy, U., Martinez-Skinner, A., McMillan, J., Gendelman, H. E. Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs. J. Vis. Exp. (46), e2460, doi:10.3791/2460 (2010).

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Abstract

Nanoformulated दवाओं pharmacodynamics और bioavailability सुधार करते हुए भी सेवा एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं (एआरटी) के लिए दवा toxicities कम कर सकते हैं. यह अंत करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला nanomedicine के सिद्धांतों लागू किया गया है एआरटी regimens सरल और जैसे toxicities कम करते हुए अनुपालन और दवा फार्माकोकाइनेटिक्स में सुधार. विनिर्माण nanoformulated एआरटी (nanoART) के लिए सरल और विश्वसनीय तरीके से पता चला रहे हैं. शुद्ध दवा के कण surfactant लिपिड कोटिंग की एक पतली परत के द्वारा encapsulated रहे हैं और छोटे लोगों में या तो गीला मिलिंग या उच्च दबाव homogenization द्वारा बड़ी दवा क्रिस्टल fractionating द्वारा उत्पादित. एक वैकल्पिक पद्धति में नि: शुल्क दवा एक बहुलक की एक छोटी बूंद में निलंबित कर दिया है. इस के साथ साथ, दवा तो ultrasonication द्वारा उत्तेजित जब तक व्यक्तिगत nanosized बूंदों का गठन कर रहे हैं बहुलक भीतर भंग कर रहा है. गतिशील प्रकाश बिखरने और सूक्ष्म परीक्षा कण (कण आकार, प्रभारी, और आकार) के भौतिक गुणों विशेषताएँ. उनके जीवविज्ञान गुण (सेल तेज और प्रतिधारण cytotoxicity, और एंटीरेट्रोवाइरल प्रभावकारिता) मानव monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एमडीएम) के साथ निर्धारित कर रहे हैं. एमडीएम मानव परिधीय रक्त monocytes शुद्धि के लिए केन्द्रापसारक elutriation का उपयोग करने leukopacks से अलग से प्राप्त कर रहे हैं. इस तरह रक्त जनित मैक्रोफेज nanoART वितरण मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) संक्रमित अंगों के लिए सेलुलर ट्रांसपोर्टरों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम मंज़ूर है कि एचआईवी -1 उपचार के लिए नैनोकणों में चिकित्सकीय उपलब्ध एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं के repackaging के अनुपालन में सुधार है और सकारात्मक रोग परिणामों को प्रभावित कर सकता है.

Protocol

NanoART निर्माण

1. NETZSCH MicroCer तरीके से गीले मिलिंग NanoART

  1. वजन दवा क्रिस्टल और विभिन्न surfactants कि nanoformulations एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर बनाने के लिए और उन्हें 10 मिमी Hepes बफर, 7.8 पीएच एक T-18 Ultraturrax मिश्रक का उपयोग कर जब तक पूरी तरह छितरी के साथ मिश्रण किया जाएगा. 2% - तैयार करने में दवा का प्रतिशत 1 के बीच होना चाहिए.
  2. निरंतर मिलिंग के लिए, सुनिश्चित करें कि chiller और कंप्रेसर पर है. आउटलेट दबाव 100 साई के आसपास अपने नमूना मिल शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए.
  3. नियंत्रण इकाई पर मुड़ें और पीस टैंक को घुमाएगी इतना है कि पीस मीडिया टैंक में लोड किया जा सकता है.
  4. एक चिमनी का उपयोग कर पीस चैम्बर मोतियों की 50 एमएल जोड़ें. यकीन है कि वहाँ या पीस चैम्बर के बाहर कहीं भी धागे में कोई मोती यांत्रिक मुहर में लीक से बचने कर रहे हैं बनाओ.
  5. सुनिश्चित करें कि O-अंगूठी मिलिंग कक्ष पर अपनी जगह में है. एक उपयुक्त स्क्रीन जाल आकार का चयन करें और उचित ढक्कन विधानसभा का उपयोग करें और नट कस द्वारा lids सुरक्षित. स्क्रीन जाल आकार कम से कम आधे मोती के आकार की जानी चाहिए. फिल्टर clogging से निरंतर मिलिंग जबकि उत्पाद से बचने के एक बड़ी स्क्रीन जाल के आकार का उपयोग करें.
  6. कम पीस कक्ष कक्ष के शीर्ष पर प्रदान की घुंडी का उपयोग क्षैतिज बनाने के लिए और सुनिश्चित करें कि उत्पाद एकत्रित पोत में आउटलेट ट्यूब खाली है.
  7. उत्पाद इनलेट के लिए surfactants के विभिन्न मात्रा के साथ दवा निलंबन जोड़ें. निलंबन की न्यूनतम मात्रा 100 एमएल होना चाहिए. यह overheating से मिलिंग चैम्बर रोकने के लिए और भी भागों पर कम पहनने के कारण मनका संक्रमण से बचने
  8. नियंत्रण इकाई का उपयोग कर पंप को प्रारंभ करें. प्रवाह की दर अलग किया जा के रूप में अपने सूत्रीकरण (~ 50 - 150 एमएल / मिनट) के लिए आवश्यक हो सकता है.
  9. पर आंदोलनकारी मुड़ें और नियंत्रण इकाई पर गति को समायोजित. गति 620 rpm से एक MicroCer पर 4320 rpm के लिए बढ़ाया जा सकता है. तापमान तापमान गेज है कि शीर्ष पर पीस कक्ष पर जुड़ा हुआ है और यह सुनिश्चित कर लें कि वहाँ कोई overheating है का उपयोग कर मॉनिटर.
  10. विभिन्न गति और प्रवाह दर पर नमूना मिल और छोटे आकार और आरोप एक विवर्तन लाइट छितराया में Brookhaven Zetasizer (1 टेबल) का उपयोग माप के लिए तैयार करने की aliquots (~ 1 एमएल) ले.
  11. इच्छित आकार प्राप्त करने के बाद, मिलिंग नियंत्रण इकाई का उपयोग कर बंद करो. पर अभी भी पंप के साथ एक कुप्पी में नमूना एकत्र. दवा पूरी तरह से नमूना संग्रह फ्लास्क में पलायन करने की अनुमति दें.
  12. पंप बंद स्विच. मोती हटायें इकाई के तहत एक संग्रह ट्रे जगह है. ढक्कन विधानसभा के सामने थाली पर नट ढीला और ट्रे में मोती को इकट्ठा. सामने थाली ले लो और एक विआयनीकृत पानी की बोतल का उपयोग करने के लिए ट्रे में मोती धोने.
  13. 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में milled निलंबन स्थानांतरण और 30 मिनट के लिए 10,000 rpm (10,174 आरसीएफ) अपकेंद्रित्र सेट. अपकेंद्रित्र चक्र के पूरा होने पर, सतह पर तैरनेवाला की राशि को मापने के लिए और ताजा surfactant समाधान के एक ही राशि के साथ की जगह.
  14. एक बार resuspension पूरा हो गया है, मिलिंग कक्ष और 10 मिनट के लिए मिल के लिए निलंबन हस्तांतरण. एक विभाज्य (1ml ~) ले लो और आकार और नमूने के प्रभारी फिर से मापने के Zetasizer (तालिका 1) का उपयोग कर.
  15. विआयनीकृत जल और 70% इथेनॉल का उपयोग MicroCer के उपयोग के बाद सफाई प्रदर्शन.
  16. NanoART HPLC का उपयोग योगों की एकाग्रता उपाय. हमारे मामले में, हम मूल्यांकन द्वारा नमूने चरण HPLC उलट तीन प्रतियों एक YMC C8 गार्ड कारतूस के साथ Octyl C8 स्तंभ (वाटर्स इंक, Milford, एमए) पर 20 μL इंजेक्शन का उपयोग कर. मोबाइल चरण में 48% acetonitrile / 52% 25mm के.एच. 2 4 पीओ, पीएच 4.15 मिलकर 0.4 एमएल / मिनट पर 272 एनएम यूवी / विज़ पता लगाने के साथ पंप है. माप के लिए सभी दवा quantitation प्रत्येक मुफ्त दवा (.025-100 μg / एमएल) मेथनॉल में तैयार की एक मानक वक्र की तुलना द्वारा निर्धारित किया जाता है.

2. NanoART Homogenization का उपयोग Avestin EmulsiFlex C5

  1. दवा क्रिस्टल और विभिन्न surfactants कि nanoformulations एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर बनाने के लिए और उन्हें 10 मिमी Hepes बफर, 7.8 पीएच एक T-18 Ultraturrax मिश्रक का उपयोग करने के लिए पूरा फैलाव प्राप्त के साथ मिश्रण किया जाएगा उपाय.
  2. Homogenizing पोत निलंबन स्थानांतरण और पुनःपरिसंचरण शुरू. सुनिश्चित करें कि चिलर से पहले नमूना homogenize शुरू करने पर है
  3. मीटर २०,००० ± +२,००० साई धीरे - धीरे जब तक पढ़ता है और homogenize जब तक लक्ष्य कण आकार हासिल की है जारी रखने के दबाव बढ़ाएँ. 60 मिनट - यह आमतौर पर 45 के बीच लेता है. एक विभाज्य (1ml ~) समय - समय ले लो और आकार और एक Zetasizer (1 टेबल) का उपयोग कर नमूने के प्रभारी को मापने.
  4. Homogenizer से 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों homogenized निलंबन और स्थानांतरण और 30 मिनट के लिए 10,000 rpm (10,174 आरसीएफ) अपकेंद्रित्र सेट. के पूरा होने परअपकेंद्रित्र चक्र सतह पर तैरनेवाला की राशि को मापने और ताजा surfactant समाधान के एक बराबर मात्रा के साथ बदलें.
  5. Resuspension के बाद, C5 homogenizer निलंबन हस्तांतरण. परिसंचरण को पुनरारंभ करें और 20,000 ± २,००० साई homogenizing दबाव वापसी और 30 मिनट के लिए homogenize. आकार और Zetasizer (तालिका 1) का उपयोग कर तैयार करने की प्रभारी उपाय.
  6. विआयनीकृत पानी और विलायक के रूप में इथेनॉल के साथ पोस्ट इकाई की सफाई प्रदर्शन.
  7. HPLC का उपयोग नमूनों की एकाग्रता उपाय.

3. कोल Parmer अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर का उपयोग Sonication

  1. एक गिलास बीकर में dichloromethane के 50 एमएल उपाय. उपाय पाली (लैक्टिक - सह glycolic एसिड) के 6 ग्राम (PLGA) विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग, dichloromethane जोड़ने के लिए, और मिश्रण जब तक पूरा विघटन मनाया जाता है.
  2. दवा क्रिस्टल के 1.25 छ उपाय और dichloromethane / PLGA समाधान के लिए जोड़ें. मिश्रण को पूरा विघटन प्राप्त.
  3. 1% polyvinyl शराब (PVA) surfactant समाधान करें और एक बर्फ स्नान का उपयोग कर इसे शांत. सुनिश्चित करें कि surfactant समाधान कार्बनिक समाधान है जिसमें भंग दवा के अलावा से पहले शांत है.
  4. 1% PVA surfactant समाधान में दवा समाधान डालो और 50% आयाम में ultrasonicator शुरू. सुनिश्चित करें कि surfactant समाधान एक बर्फ स्नान में रखा गया है. sonicator के आयाम ~ 30% आयाम नमूने के छोटे बैच के लिए कम किया जा सकता है. 10 मिनट के लिए नमूना Sonicate.
  5. कण आकार विश्लेषण (1 टेबल) के लिए एक छोटे से विभाज्य (~ 1 एमएल) ले लो. यदि कणों का आकार 1.5 सुक्ष्ममापी की तुलना में अधिक है, 2 मिनट के अंतराल पर कुल 16 मिनट की एक अधिकतम करने के लिए नमूना sonicate. 20x और दस्तावेज़ टिप्पणियों (चित्रा 1 ए) में खुर्दबीन के नीचे नमूने देखो.
  6. शेष निलंबन के लिए एक पर्याप्त भंवर बनाने के लिए और कमरे के तापमान पर रातोंरात मिश्रण जारी हलचल प्लेट का उपयोग.
  7. एक कुप्पी में 8 ग्राम mannitol वजन और 80 एमएल आरओ पानी जोड़ें. पूरा विघटन तक मनाया जाता है मिक्स और कमरे के तापमान पर दुकान. इस centrifugation बाद resuspension के लिए इस्तेमाल किया जा जाएगा अगर नमूने के लिए lyophilized करने की आवश्यकता है.
  8. 24 घंटे के बाद निलंबन लीजिए और 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में डाल देना. 20 मिनट के लिए 8000 rpm के एक गति से 5 बजे के नमूने अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला और resuspend एक आधा नमूना निथारना फ़िल्टर (आरओ) रिवर्स असमस पानी और 0.5% cetyl trimethylammonium ब्रोमाइड (CTAB) surfactant के 75 एमएल में दूसरे आधे के 75 एमएल में.
  9. नमूने फिर 20 मिनट के लिए 8000 rpm के एक गति से 5 ° C पर अपकेंद्रित्र और गुटिकाओं के 20 एमएल mannitol समाधान के एक कुल के साथ प्रत्येक resuspend.
  10. दूसरा resuspension के बाद, Zetasizer (तालिका 1) का उपयोग कर कणों के आकार को मापने के.
  11. निलंबन शेष हस्तांतरण और उन्हें lyophilizer में जगह उपयुक्त शीशियों का प्रयोग करें.
  12. HPLC का उपयोग नमूनों की एकाग्रता उपाय.

4. NanoART आकृति विज्ञान

  1. NanoART निलंबन लो और संक्षेप में 5 सेकंड के लिए 20% के आयाम में एक sonication जांच के साथ sonicate. आरओ पानी की 1.5 एमएल में एक 1.7 एमएल microcentrifuge ट्यूब और 10 सेकंड के लिए भंवर के भीतर निलंबन की 10 μL स्थानांतरण.
  2. एक 50 पानी nanoART समाधान और एक निस्पंदन Swinnex 13 polypropylene फ़िल्टर 0.2 सुक्ष्ममापी polycarbonate निस्पंदन झिल्ली (Nuclepore ट्रैक - Etched) के साथ इकट्ठे धारक से मिलकर तंत्र के लिए स्थानांतरण की μL नमूना ले लो. निस्पंदन तंत्र 50 μL पहले पतला दवा निलंबन के अलावा करने के लिए आसुत जल फ़िल्टर 0.2μm साथ primed है. वैक्यूम तो तंत्र के लिए लागू किया जाता है जब तक संपूर्ण समाधान की मात्रा पूरी तरह से किया गया है निस्पंदन झिल्ली पिछले खींच लिया.
  3. एक बार झिल्ली सूखा है, यह एक एल्यूमीनियम पिन डबल छड़ी प्रवाहकीय कार्बन टेप का उपयोग कर ठूंठ चिपका है और पैलेडियम के साथ लेपित धूम. नमूना ठूंठ तो हमारे मामले में, एक JEOL JSM6300F कम वोल्टेज, उत्सर्जन क्षेत्र स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) का उपयोग करते हुए, imaged है.

5. NanoART विज़ुअलाइज़ेशन

  1. तैयार nanoART निलंबन ले लो और 10 सेकंड के लिए उन्हें एक sonication जांच के साथ 20% आयाम पर sonicate.
  2. एक खुर्दबीन स्लाइड कवर पर्ची और यह एक औंधा माइक्रोस्कोप पर जगह ले लो. कवर पर्ची पर फॉस्फेट की 100 μL के साथ nanoART निलंबन की 15 μL मिश्रण खारा buffered (पीबीएस) और ऊपर और नीचे pipetting कई बार मिश्रण. कल्पना एक 20x उद्देश्य (चित्रा 3) का उपयोग नैनोकणों.

NanoART का जीवविज्ञान

6. अलगाव और रक्त जनित monocyte और monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एमडीएम) तैयार

  1. प्राप्त से एचआईवी -1 और हेपेटाइटिस seronegative दाताओं leukapheresis से मानव monocytes और काउंटर वर्तमान केन्द्रापसारक elutriation द्वारा कोशिकाओं को शुद्ध. विरोधी CD68 (क्लोन के.पी. immunolabeling सेल शुद्धता का आकलन) -1 राइट से सना हुआ एक cytospins से.
  2. DMEM संस्कृति शुद्ध monocytes 1x10 के एक एकाग्रता में 10% गर्मी निष्क्रिय जमा मानव सीरम, 1% glutamine, 50 μg / एमएल gentamicin, 10 μg / एमएल ciprofloxacin और 1000 यू / एमएल पुनः संयोजक मानव बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (MCSF) के साथ पूरक 6 कोशिकाओं / 37 एमएल ° 5% सीओ 2 के साथ एक humidified वातावरण में सी . प्लेट 2x10 क्रम में 7 दिनों के लिए 6 अच्छी तरह प्लेटें और संस्कृति कोशिकाओं में 6 अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं monocytes 1 मैक्रोफेज में अंतर करने के लिए अनुमति देने के लिए . (चित्रा 3A)

7. सेल तेज और संग्रह

  1. 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता nanoART (MCSF बिना) के मीडिया संस्कृति के साथ मिश्रण और एक अच्छी तरह से उपचार के माध्यम से 1 एमएल जोड़ने.
  2. कम वांछित समय, बिंदु, या जब कोशिकाओं को पूरी तरह से nanoART (चित्रा 2) के साथ लोड कर रहे हैं, सभी उपचार के माध्यम हटाने और कोशिकाओं 1 एमएल पीबीएस साथ में कोशिकाओं द्वारा नहीं लिया किया गया है किसी भी कणों को हटाने के लिए धोने के लिए 3 बार. पीबीएस के 1 एमएल में, एक सेल चोर का उपयोग करके अच्छी तरह से नीचे से पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने और एक 1.7 एमएल microcentrifuge 2-4 ट्यूब में उन्हें जगह.
  3. 4 में +१००० आरसीएफ में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र ° सी 10 मिनट के लिए. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 100% मेथनॉल के 200 μL जोड़ें. Lyse कोशिकाओं और संक्षिप्त द्वारा nanoART भंग (2-5 सेकंड) एक sonicating जांच के साथ 20% आयाम पर गोली sonicating. -80 में स्टोर के नमूने डिग्री सेल्सियस तक दवा सामग्री का विश्लेषण करने के लिए तैयार है.

8. NanoART के intracellular रिटेंशन

  1. 7.1 में वर्णित एमडीएम समझो.
  2. वांछित समय बिंदु पर, के रूप में 7.2 में वर्णित कोशिकाओं धो, लेकिन तुरंत कोशिकाओं scraping के बजाय 0.1 एम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) में 3% glutaraldehyde की एक समाधान में 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए और आगे उन्हें 10 के लिए ठीक 0.1 एम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) में 1% आज़मियम tetroxide के साथ मिनट.
  3. लगानेवाला और 1 एमएल पीबीएस में परिमार्जन कोशिकाओं के रूप में 7.2 में वर्णित निकालें. यह भी इकट्ठा, और 7.2 में वर्णन के रूप में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, लेकिन गोली के लिए मेथनॉल जोड़ने के बजाय, glutaraldehyde लगानेवाला समाधान के 200 μL जोड़ने.
  4. पतली वर्गों (80 एनएम) में एक सूक्ष्म तक्षणी सेल गोली के साथ कट. Uranyl एसीटेट और नेतृत्व साइट्रेट के साथ वर्गों दाग. निरीक्षण दाग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) का उपयोग कर वर्गों.

9. एआरटी रिलीज

  1. कोशिकाओं का इलाज के रूप में 7.1-7.2 में वर्णित है, तथापि, धोने के बाद कोशिकाओं को इकट्ठा करने के बजाय, 2 MCSF बिना और nanoART बिना एमएल सेल संस्कृति माध्यम के साथ पीबीएस की जगह.
  2. संकेत के दिनों में, या के रूप में सेल संस्कृति माध्यम पीला, मध्यम के विनिमय आधे मोड़ से संकेत दिया.
  3. वांछित दिन, को दोहराने के रूप में 7.2-7.3 में वर्णित कोशिकाओं साथ साथ सेल के माध्यम से 1 एमएल इकट्ठा.
  4. प्रक्रिया कोशिकाओं के रूप में 7.3 में वर्णित है. 100% और 10 सेकंड के लिए पूरी गति से मेथनॉल भंवर के 1 एमएल मध्यम नमूना के 150 μL जोड़कर प्रक्रिया मध्यम. फिर २१,००० आरसीएफ में 10 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और यह एक नया ट्यूब को हस्तांतरण. एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र के साथ मेथनॉल लुप्त हो जाना, यह कहीं भी 1 से 4 घंटे के आधार पर नमूना ले सकते हैं. स्टोर नमूने -80 डिग्री सेल्सियस नशीली दवाओं के विश्लेषण के लिए तैयार है जब तक.

10. Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा NanoART के वास्तविक समय तेज

  1. 6.2 कदम और लेबल से परिपक्व मध्याह्न भोजन ले लो एक सेल Vybrant सेल लेबल निर्माण अनुदेश के बाद समाधान के रूप में लेबलिंग समाधान का उपयोग कोशिकाओं. कोशिकाओं को 3 बार संस्कृति के माध्यम से 1 एमएल का उपयोग करने के लिए किसी भी अतिरिक्त रंग को हटाने कुल्ला.
  2. 7.1 कदम fluorescently लेबल nanoART का उपयोग कर के रूप में मध्यम संस्कृति के साथ मिक्स nanoART.
  3. तुरंत एक confocal खुर्दबीन के साथ इमेजिंग के लिए पहले nanoART लेबल के साथ उपचार के माध्यम से जोड़ें. एक छवि 4 घंटे के लिए हर 30 सेकंड एक 60x उद्देश्य 5 (1 और 2 वीडियो) का उपयोग कैप्चर.

एचआईवी -1 संक्रमण और संक्रामकता Assays

11. एचआईवी -1 एडीए संक्रमण

  1. के रूप में 9.1-9.3 में वर्णित कोशिकाओं समझो.
  2. वांछित दिन पर, सभी मध्यम हटाने और माध्यम के साथ की जगह, MCSF बिना, 0.01 वायरल कणों / सेल और 24 1 घंटे के लिए सेते के संक्रमण की बहुलता पर एडीए एचआईवी -1 से युक्त . वायरल मध्यम निकालें और ताजा, वायरस मुक्त मीडिया के साथ बदलें. 10 दिनों के लिए संस्कृति कोशिकाओं को हर दूसरे दिन आधा मध्यम का आदान प्रदान या के रूप में कोशिकाओं (चित्रा 5) 6 जिंदा रखने के लिए आवश्यक है.
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से, स्थान से एक 96 अच्छी तरह से थाली में दस दिनों के बाद संक्रमण माध्यम के 10 μL, इकट्ठा करने और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस जब तक रेट्रोवायरल (रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस) विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए तैयार है.

12. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस परख (आरटी)

  1. प्रत्येक 10 11.3 कदम से μL नमूना के साथ, एक समाधान है कि Tris - एचसीएल 100 मिमी (7.9 पीएच), 300 मिमी KCl, 10 मिमी डीटीटी, 0.1% phenoxylpolyethoxylethanol-40 nonyl (एनपी 40), और पानी शामिल के 10 μL मिश्रण. 15 मिनट के लिए 37 ° सी 7 में इस मिश्रण को सेते हैं.
  2. मैं> तो फिर एक समाधान है कि Tris - एचसीएल 50 मिमी (7.9 पीएच), 150 मिमी KCl, 5 मिमी डीटीटी, 15 मिमी 2 MgCl, 0.05% एनपी 40, 10 μg / एमएल पाली (ए), 0.250 होता के 25 μL जोड़ने यू / एमएल oligo (टी) घ 12-18, और 37 पर 10 μCi / एमएल 3 एक अच्छी तरह से सेते और एच टीटीपी ° सी 18 7 घंटे के लिए .
  3. ऊष्मायन के बाद, हर अच्छी तरह से ठंडा 10% trichloroacetic एसिड (TCA) का 50 μL जोड़ें. ग्लास फाइबर फिल्टर पर कुओं हार्वेस्ट, और β-जगमगाहट 7 स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा 3 एच टीटीपी समावेश के लिए फिल्टर का आकलन.

13. एचआईवी - 1p24 detections

  1. धो को दोहराने के कोशिकाओं से जो रेट्रोवायरल ट्रांसक्रिपटेस मध्यम नमूना 11.3 चरण में पीबीएस 3 बार 1 एमएल के साथ rinsing द्वारा हटा दिया गया था.
  2. 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं 4 पर रातोंरात ठीक डिग्री सेल्सियस निम्नलिखित सुबह पीबीएस के साथ कोशिकाओं 3 बार कुल्ला.
  3. एचआईवी-1 p24 (01:10, Dako, Carpinteria, सीए) के लिए माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए एचआईवी संक्रमण कल्पना. उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत छवि कोशिकाओं को एक 40x उद्देश्य (चित्रा 6) का उपयोग.

14. प्रतिनिधि परिणाम:

दवा आकार
(एनएम)
PDI प्रभार
(Mv)
Surfactants
IDV 1052 0.286 -24.58 0.5% P188, 5.0% एसडीएस, 9.25% Sucrose
RTV 233 0.273 -7.47 0.5 P188%, 9.25% Sucrose
ATZ 840 0.192 25.47 0.5% P188, 0.1% DSPE MPEG-2000, 1.0% DOTAP, 9.25% Sucrose
EFV 347 0.235 -13.52 1.0% PVA

NanoART की तालिका 1. शारीरिक विशेषताओं
तालिका प्रदर्शित करता है nanoART योगों की शारीरिक विशेषताओं के लिए संभावित प्रतिनिधि मूल्यों संकेत surfactants का उपयोग कर निर्मित है. मान मतलब बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता, polydispersity सूचकांक (PDI, एक अनुमान के कण आकार के वितरण के), और संभावित जीटा विभिन्न nanoformulation नमूनों के लिए प्राप्त मूल्यों पर आधारित व्यास शामिल हैं. तालिका में इस्तेमाल किया. Abbreviations: IDV: indinavir, RTV: ritonavir, एटीवी: atazanavir, EFV: effavirenz, PVA: polyvinylalcohol, एसडीएस सोडियम dodecyl सल्फेट, P188: poloxamer 188 (भी F68 Pluronic करार दिया); DSPE MPEG-2000: मिथाइल पाली (ethylene glycol) 1,2 - distearoyl - phosphatidyl - ethanolamine, DOTAP: (1 oleoyl - 2 [6 [(7 नाइट्रो-2-1 ,3--benzoxadiazol 4-YL) एमिनो] hexanoyl] 3-trimethylammonium प्रोपेन.

चित्रा 1
चित्रा 1 फ्लो चार्ट सारांश nanoART निर्माण के लिए इस्तेमाल किया विभिन्न तरीकों.
चित्रा 1 nanoART निर्माण करने के लिए इस्तेमाल विभिन्न तरीकों का सार. प्रवाह संचित्र संबंधित तरीकों के महत्वपूर्ण चरणों में से प्रत्येक के लिए एक समय आवंटन प्रत्याशित शामिल हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 वांछनीय और अवांछनीय NanoART आकारिकी की छवियों प्रतिनिधि. RTV nanoART के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण (आवर्धन, एक्स १५,०००) स्कैन homogenization, गीला मिलिंग, और एक 0.2 सुक्ष्ममापी polycarbonate निस्पंदन झिल्ली के शीर्ष पर sonication द्वारा उत्पादित. उपाय बार सभी फ्रेम में 2.0 सुक्ष्ममापी बराबर होती है. वांछनीय nanoART औसत पर मिलकर बनता है, छोटे (≤ 2 सुक्ष्ममापी) चिकनी किनारों के साथ आत्म निहित कणों कि एक या समान आकार हैं. अवांछनीय nanoART दोनों आकार और आकार में काफी भिन्नता है और एक दूसरे से और / या छड़ी फ्यूज कर सकते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3 वांछनीय nanoART समाधान के और एमडीएम nanoART लेने की छवियाँ. Homogenized RTV एनपी और मध्याह्न भोजन के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी छवियों (सभी अधिग्रहीत एक 20x उद्देश्य का उपयोग) nanoART लेने. एक गिलास को कवर पर्ची के शीर्ष पर 100 पीबीएस की μL RTV-एनपी समाधान के साथ 10 μL के संयोजन के बाद, कण दिखाई दे रहे हैं और केवल एक बड़ा व्यक्तिगत पहचान योग्य होने के कणों के कुछ (ए) के साथ रेत जैसे लगते हैं. की छवि पूरी तरह से विभेदित और धुरी nanoART उपचार (बी) के पहले आकार एमडीएम. बाद कोशिकाओं को nanoART ले लिया है, वे गहरा हो गया और उनके नाभिक अधिक nanoART के perinuclear वितरण के कारण स्पष्ट हो, लेकिन वे अभी भी उनके धुरी आकार सेल शरीर (सी) को बनाए रखने. एक बार कोशिकाओं nanoART, छिप बन नाभिक के साथ अतिभारित हो, और कोशिकाओं गोल हो जाते हैं, उनके धुरी आकार संरचना को खोने और संभावित अच्छी तरह से (डी) के नीचे से detaching.

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चित्रा 4 nanoART के सेलुलर निगमन के मध्याह्न भोजन में पुष्टिकरण. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (आवर्धन, 15,000 एक्स) homogenization (ए), RTV-एनपी से गीला मिलिंग (बी), RTV-एनपी sonication (सी) से, और अनुपचारित कोशिकाओं (डी से RTV-एनपी के लिए संपर्क में मध्याह्न भोजन में nanoART के तेज दर्शाता ). कोशिकाओं के भीतर, nanoART उनके ज्यामितीय आकार के द्वारा आसानी से पहचाने जाने योग्य होना चाहिए. नियंत्रण कक्ष (डी) में किसी भी स्पष्ट ज्यामितीय संरचनाओं की कमी नोट. प्रत्येक कण का एक उदाहरण उल्लिखित किया गया है: homogenization के लिए लाल (ए), गीला मिलिंग, (बी) के लिए हरी sonication (सी) के लिए नीला. कण संरचना समान होना चाहिए कि जो SEM का उपयोग करते हुए देखा गया था. उपाय बार सभी फ्रेम में 5.0 सुक्ष्ममापी बराबर होती है.

चित्रा 5
चित्रा 5 nanoART के एंटीरेट्रोवाइरल प्रभावकारिता परीक्षण के लिए विधि का आरेख . आदेश में वायरल प्रतिकृति मध्याह्न भोजन के लिए बाधित पहले nanoART के साथ इलाज किया जाना चाहिए और फिर एडीए एचआईवी -1 उजागर nanoART की क्षमता का परीक्षण करने के लिए. एआरटी रिलीज के अध्ययन के लिए इसी प्रकार, मध्याह्न भोजन nanoART के साथ लोड कर रहे हैं और तब कि भली भाँति नहीं किया गया है किसी भी कणों को दूर धोया. NanoART लदी एमडीएम तो 15 दिनों के लिए कर रहे हैं हर दूसरे दिन एक आधा मध्यम मुद्रा के साथ सुसंस्कृत. इस समय के दौरान (आम तौर पर 1 दिन, 5, 10, और 15 पर) मध्याह्न भोजन एडीए एचआईवी -1 के साथ चुनौती दी है. प्रत्येक वायरल जोखिम कोशिकाओं के बाद एक और 10 दिनों के लिए सुसंस्कृत क्रम में संक्रमण प्रगति करने की अनुमति. आरटी विश्लेषण और तय की और p24 प्रतिजन के लिए दाग कोशिकाओं के लिए दिन में 10 के बाद संक्रमण मीडिया नमूने एकत्र कर रहे हैं. गैर nanoART इलाज मध्याह्न भोजन, दोनों संक्रमित और uninfected भी समानांतर में सुसंस्कृत हैं और p24 प्रतिजन और आरटी गतिविधि की उपस्थिति के लिए परीक्षण किया गया.

चित्रा 6
6 आंकड़ा p24 धुंधला द्वारा एचआईवी -1 संक्रमित मध्याह्न भोजन में nanoART प्रभावकारिता का परीक्षण. RTV-एनपी के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (20x उद्देश्य) 10 दिनों के बाद एडीए एचआईवी -1 के साथ चुनौती दी जा रहा मध्याह्न भोजन का इलाज किया. कोई संक्रमण मौजूद था जब कोशिकाओं virus1 दिन उपचार के बाद nanoART (ए) के साथ चुनौती दी थी, सबसे कोशिकाओं (एक इनसेट तीर द्वारा इंगित) के भीतर cytoplasm एनपी की उपस्थिति ध्यान दें. संक्रमण मौजूद था जब कोशिकाओं nanoART उपचार (बी) के 10 दिनों के बाद वायरस से अवगत कराया गया, हालांकि बहुत कम nanoART के साथ इलाज नहीं किया कोशिकाओं की तुलना में (डी); एनपी के कुछ कोशिकाओं (इनसेट बी तीर द्वारा संकेत) में बनाए रखा उपस्थिति ध्यान दें, लेकिन दिन 1 उपचार के बाद nanoART (ए इनसेट) की तुलना में कम है. कोशिकाओं है कि न तो nanoART न ही संक्रमित (सी) के साथ इलाज किया गया की छवि, एनपी के cytoplasm कोशिका के भीतर नोट कमी (इनसेट सी). NanoART के साथ इलाज नहीं थे, लेकिन एचआईवी -1 एडीए (डी) को उजागर कोशिकाओं की छवि.

वीडियो 1. सेल confocal माइक्रोस्कोपी एमडीएम द्वारा गरीब तेज RTV-एनपी के जीते. मध्याह्न भोजन के प्रतिदीप्त माइक्रोस्कोपी Vybrant डियो समाधान सेल लेबलिंग के साथ हरी लेबल और RTV-एनपी लाल लेबल के साथ इलाज किया. एक छवि 60x बढ़ाई 4 घंटे के लिए हर 30 सेकंड लिया गया था. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के

वीडियो 2. एमडीएम द्वारा सफल तेज RTV-एनपी के सेल confocal माइक्रोस्कोपी जीते. मध्याह्न भोजन के प्रतिदीप्त माइक्रोस्कोपी Vybrant डियो समाधान सेल लेबलिंग के साथ हरी लेबल और RTV-एनपी लाल लेबल के साथ इलाज किया. एक छवि 60x बढ़ाई 4 घंटे के लिए हर 30 सेकंड लिया गया था. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के

Discussion

NanoART एचआईवी -1 चिकित्सा विज्ञान में सुधार के लिए बनाया गया हैं. हम एक पहला कदम के रूप में नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए इस तरह की तकनीकों को विकसित और nanoformulated दवा के विकास के लिए एक प्रयोगशाला परीक्षण प्रणाली के रूप में एक monocyte बृहतभक्षककोशिका आधारित दवा वितरण प्रणाली का प्रस्ताव किया है. हमारे अतीत के कार्यों से पता चला है कि प्रणाली इस तरह के एक 5,6 आवेदन के लिए व्यवहार्य है.

वर्तमान रिपोर्ट में, हम सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले एचआईवी 1-दवाओं (ritonovir, RTV; इफावरेन्ज EFV, और atazanavir, एटीवी indinavir, IDV) के एनपी synthesizing के लिए तरीकों सचित्र है. यह गीला मिलिंग, homogenization और ultrasonication के द्वारा प्राप्त किया गया था. महत्वपूर्ण बात, हमारे दृष्टिकोण nanoART शारीरिक आकार, आकार और 5,6 प्रभारी के रूप में ऐसी विशेषताओं के संशोधन के लिए अनुमति देता है. Surfactants का चयन सावधानी से, एक बेहद सकारात्मक तटस्थ अत्यधिक नकारात्मक से कण के प्रभारी को नियंत्रित कर सकते हैं. प्रसंस्करण समय और तीव्रता में फेरबदल करके, एक आकार पर नियंत्रण और रेंडर के रूप में ≤ 200 एनएम के रूप में छोटे या ≥ 3 सुक्ष्ममापी के रूप में के रूप में बड़े कणों कर सकते हैं. लेकिन कण का आकार भी अन्य शारीरिक विशेषताओं की तुलना में एक हद तक कम करने के लिए नियंत्रित किया जा सकता है,. उदाहरण के लिए, गोलाकार कणों पॉलिमर के साथ sonication के माध्यम से किया जा सकता है जबकि बहु - पक्षीय ज्यामितीय आकृतियों गीला मिलिंग या homogenization के माध्यम से उत्पादन किया जा सकता है. गीले मिलिंग और homogenization अलग आकार के कणों का उत्पादन, लेकिन इस प्रक्रिया fractionation पद्धति पर निर्भर है और हो सकता है के लिए नहीं कर सकते हैं सीधे नियंत्रित. निर्माण विधियों के इन गुणों शोध आसानी से सटीक डिजाइन विनिर्देशों के लिए nanoART उत्पादन के लिए सक्षम कर सकते हैं. यह vitally महत्वपूर्ण है के बाद से nanoART के भौतिक गुणों दोनों अपनी स्थिरता पर एक शक्तिशाली प्रभाव है और कैसे वे कोशिकाओं के साथ बातचीत. उदाहरण के लिए, हम पता चला है कि nanoART कि आकार में लगभग 1 सुक्ष्ममापी हैं, एक मजबूत सकारात्मक चार्ज है, और एक multisided ज्यामितीय आकार मैक्रोफेज, कोशिकाओं के अंदर एक बार और अधिक स्थिर और अधिक तेजी से कर रहे हैं ले लिया है, और एक लंबी अवधि में जारी 6 समय है.

परीक्षण nanoART के लिए एक विधि विकसित किया गया था कि कणों 'करने के लिए लिया जा करने की क्षमता की सरल जांच के लिए अनुमति देता है बनाए रखा, और उनके वायरल प्रतिकृति को बाधित करने की क्षमता के अलावा, मैक्रोफेज, एक एचआईवी -1 के सिद्धांत लक्ष्य कोशिकाओं के द्वारा जारी है. यह आसानी से प्रदर्शन के आधार पर nanoART अंतर और उन है कि vivo मॉडल में एक में सफल है, इस प्रकार, दोनों और मानव उपयोग के लिए nanoART के विकास की दक्षता और गति में वृद्धि का सबसे अच्छा मौका है पहचान की अनुमति देता है.

यह दिखाया गया है कि जब माउस अस्थि मज्जा मैक्रोफेज nanoART साथ पूर्व vivo भरी हुई है और adoptively humanized एचआईवी 1 संक्रमित चूहों सक्रिय संक्रमण की साइटों के लिए यात्रा, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सहित सकते हैं, और रिलीज दवाओं अप करने के लिए 2 सप्ताह में अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा स्थानांतरित वायरल प्रतिकृति 2-4 बाधित. इसके अलावा, इन nanoART लोड कोशिकाओं को भी प्रभावी ढंग से प्लाज्मा में वायरस से संक्रमित कोशिकाओं की संख्या कम करने में सक्षम थे, लिम्फ नोड्स, तिल्ली, जिगर और फेफड़ों के रूप में अच्छी तरह के रूप में सीडी 4 + कोशिकाओं 2 की रक्षा. इन अध्ययनों, हालांकि प्रारंभिक प्रदर्शन, कि एक सेल की मध्यस्थता nanoART वितरण प्रणाली दवा की चिकित्सकीय महत्वपूर्ण मात्रा दोनों के रक्त और संक्रमित ऊतकों को वितरित कर सकते हैं. एचआईवी -1 संक्रमित माउस अध्ययन से उत्साहजनक प्रारंभिक परिणामों की वजह से, हम वर्तमान में एक प्रकार का बंदर इम्युनो कमी वायरस संक्रमित मकाक मॉडल विकसित कर रहे हैं करने के लिए आगे नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए nanoART की क्षमता का परीक्षण.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

काम 1P01DA028555 01A1 अनुदान NS034239 2R01, NS36126 2R37, P01 NS31492, P20RR 15635, P01MH64570, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के से NS43985 P01 (HEG के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों पांडुलिपि और बकाया ग्राफिक और साहित्यिक समर्थन की आलोचना पढ़ने के लिए धन्यवाद सुश्री रॉबिन टेलर. हम अपनी विशेषज्ञता गीला मिलिंग के लिए स्टीव Grzelak धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी स्कैनिंग और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों की आपूर्ति के लिए नेब्रास्का के लिंकन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा के विश्वविद्यालय के डॉ. हान चेन धन्यवाद देना चाहूंगा. अंत में, हम उसे जीना confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग विशेषज्ञता के लिए मेगन Marquart धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
nanoART Manufacture
Indinavir sulfate Reagent Longshem Co., Shanghai, China Cas # 157810-81-6
Ritonavir Reagent China Shengda Pharmaceutical Company, China Cas # 155213-67-5
Atazanavir sulfate Reagent Gyma Laboratories of America INC Cas # 198904-31-3
Effavirenz Reagent Hetero Labs LTD, India Cas # 154598-52-4
PVA Reagent Sigma-Aldrich P 8136
SDS Reagent Bio-Rad 161-0301
Sucrose Reagent Fluka 84097
P188 Reagent Sigma-Aldrich P 1300
mPEG 2000-DSPE Reagent Genzyme LP-R4-039
Dotap Reagent Avanti Polar Lipid, Inc 890890 P
Hepes Reagent Sigma-Aldrich 83264
PLGA 75:25 Reagent Sigma-Aldrich P1941
Dichloromethane Reagent Acros Organics 75-09-2
Mannitol Reagent Sigma-Aldrich M9546
CTAB Reagent Sigma-Aldrich H 9151
Analytical Balance Tool Denver Instrument
T-18 Mixer Tool IKA
Ultra Sonicator Tool Cole-Parmer
Wet milling, MicroCer Tool Netzsch Fine Particle Technology, LLC
Homogenizer, EmulsiFlex-C5 Tool Avestin, Inc.
Zetapotentiometer Tool Malvern Instruments
Gas Manifold System Tool Victor Technologies
In Vitro Testing
DMEM Reagent Mediatech, Inc. 10-013-CV
Gentamicin Reagent Invitrogen 15710-064
Ciprofloxin Reagent Sigma-Aldrich 17850
Human MCSF Reagent Miltenyi Biotec 130-093-964
Pooled normal human serum Reagent Cole-Parmer WU-88061-68
6-well tissue culture plates Tool Corning 3524
Methanol (HPLC Grade) Reagent Fisher Scientific A452SK-4
1.7 ml microcentrifuge tubes Tool National Scientific Company CN1700GT
Glutaraldehyde solution Reagent Sigma-Aldrich 49632
Osmium tetroxide solution Reagent Sigma-Aldrich 75632
Centrifuge 5417R Tool Eppendorf 022621807
F-45-30-11 fixed angle rotor Tool Eppendorf 022636006
HIV-1ADA Reagent
HIV-1 p24 mouse monoclonal antibody Reagent Dako M0857
Microscope slide cover slips Tool Fisher Scientific 12-548-5P

Abbreviations used in the table: IDV: indinavir; RTV: ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS sodium dodecyl sulfate; P188: poloxamer 188 (also termed Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: methyl-poly(ethylene-glycol)1,2-distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2–1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane); PLGA: poly(lactic-co-glycolic acid); CTAB: cetyltrimethyl ammonium bromide; DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; MCSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor; HPLC: high-pressure liquid chromatography; HIV-1: Human Immunodeficiency Virus-1

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References

  1. Gendelman, H. E. Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes. J Exp Med. 167, (4), 1428-1441 (1988).
  2. Dou, H. Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery. Blood. 108, (8), 2827-2835 (2006).
  3. Dou, H. Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages. Virology. 358, 148-158 (2007).
  4. Dou, H. Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS. J Immunol. 183, (1), 661-669 (2009).
  5. Nowacek, A. S. Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics. J Neuroimmune Pharmacol. (2010).
  6. Nowacek, A. S. NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery. Nanomed. 4, (8), 903-917 (2009).
  7. Kalter, D. C. Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes. J Immunol. 146, (1), 298-306 (1991).

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