Author Produced

En Organotypic Slice-analys för högupplöst Time-lapse avbildning av neuronala migration i Postnatal Brain

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll beskriver en organotypic slice analys optimerad för den postnatala hjärnan och högupplösta tidsförlopp avbildning av neuroblast migrationen i rostralt flyttande strömmen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jacquet, B. V., Ruckart, P., Ghashghaei, H. T. An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain. J. Vis. Exp. (46), e2486, doi:10.3791/2486 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neurogenes i den postnatala hjärnan beror på underhåll av tre biologiska händelser: spridning av progenitorceller, migration av neuroblaster samt differentiering och integration av nya nervceller i existerande neurala kretsar. För postnatal neurogenes i lukt lökar, är dessa händelser segregerade inom tre anatomiskt skilda områden: spridning till stor del sker i subependymala zon (SEZ) i den laterala ventriklarna, vandrar neuroblaster passera genom rostralt vandrande ström (RMS), och nya nervceller differentiera och integreras inom luktsinnet lökar (OB). De tre områden utgör idealiska plattformar för att studera de cellulära, molekylära och fysiologiska mekanismer som reglerar vart och ett av biologiska händelser tydligt. Detta dokument beskriver en organotypic slice analys optimerad för postnatal hjärnvävnad, där den extracellulära villkoren noga efterlikna in vivo-miljö för flyttande neuroblaster. Vi visar att vår analys ger enhetlig, orienterad, och snabb förflyttning av neuroblaster inom RMS. Denna analys kommer att vara mycket lämplig för studier av cellens autonoma och icke-självständiga reglering av neuronala migreringen genom att använda cross-transplantation metoder från möss på olika genetiska bakgrunder.

Protocol

I. Förfaranden

Följande tekniker bör utföras under sterila förhållanden, i ett laminärt flöde huva, med steriliserade verktyg.

Beredning av maträtter glas botten för organotypic skivor

  1. Rätter måste utarbetas i steril miljö och använder steriliserade verktyg.
  2. En 150μL droppe skiva medium (se recept) är placerad i mitten av glaset-nedre delen av skålen med försiktighet för att undvika luftbubblor i mediet.
  3. Med en engångsspruta utrustad med en 23 gauge kanyl, flera fläckar av lim (gummi Cement - Elmer-talet, katt # E904) placeras på torget utkanter intill den cirkulära täckglas som upptar mitten av kulturen skålen, medan en sida Olimmad för vätska utbyte (Figur 1). De listade typ av lim är inte giftigt för skivor eller de celler som tillämpas i detta protokoll. Försiktighet måste iakttas för att undvika att placera något lim på skyddsglaset halka eftersom detta kommer att inkräkta på och hindrar avbildning av skivor senare. En nucleopore membran (diameter 25mm, porstorlek 8.0μm - Whatman, katt # 110.614) är placerad på toppen av glaset täckglas, med hjälp av lim punkter för att säkra den på plats. Detta bör göras med hjälp av en mikro pincett, samtidigt som luftbubblor inte är fångade mellan glaset täckglas och membranet.
  4. Tillsätt 1 medelstor mL skiva ovanpå membranet. Rätterna placeras i en inkubator i 30 minuter och sedan på is, tills den ska användas.

Utvinning av tidig postnatal hjärnor

Bäst resultat erhålls när skivor är beredda från unga postnatal möss (P1-P10).

  1. Valparna är obotligt bedövas (överdoserat) genom isofluorane eller andra godkända metoder. Huvudet kan besprutas med 70% etanol för att öka sterilitet, följt av en snabb halshuggning med vass sax.
  2. Huvudet är stabiliserade genom fastspänning underkäken med mikro pincett. Huden skärs längs från nacken till nos. Skallen skärs längs-och anteriorly början i Cisterna Magna, genom att göra 1 mediala och 2 laterala snitt (en på varje sida - Figur 2A). Försiktighet bör vidtas för att minimera kontakt med underliggande kortikal vävnad som den kraniella luckor tas bort från hjärnan.
  3. För att förbättra stabiliteten i vävnaden under vibratome sektionering, är de laterala-de flesta aspekter av hjärnan bort genom att göra två sagittal nedskärningar. Den caudal aspekt av hjärnan är också bort genom att göra ett snitt på rostralt basen av lillhjärnan (Figur 2B).
  4. De två hjärnhalvorna är åtskilda genom att göra ett smidigt skär längs mittlinjen spricka, och de två hjärnhalvorna är noga öste ur skallen och placerade, mediala ytan ner i en inbäddning mögel (Fig. 2C-D).

Sektionering i den mottagande hjärnan

  1. De två hjärnhalvorna i inbäddning mögel omedelbart täcks med smält 3% låg smältpunkt DNA-grade agarosgel (Fisher, katt # BP1360-100) löst i vävnaden förberedelse buffert som hålls vid 37 ° C (se recept). Efter 2 minuter på en stabilisering på en plan horisontell yta för att säkerställa en jämn härdning av agaros, är mögel placerade på is för att slutföra inställningen.
  2. När gelen innehåller hemisfärerna är inställd, det är bort från mögel och trimmade och lämnar 2-3mm gel runt om i hjärnvävnaden.
  3. Gelen-inbäddad vävnad är sedan monteras på provet skiva av vibratome, med den mediala ytan upp och fäst med cyanoakrylatlim (Krazy lim eller motsvarande). Man måste vara försiktig att gälla endast minimala mängder av lim för mycket kommer att ha toxiska effekter på skivor och flyttar celler. För mycket lim på sidorna av kvarteret kommer också att hämma den skärande och orsaka potentiell skada i vävnaden.
  4. Skivan är installerat i vibratome provet bricka fylld med iskallt vävnad förberedelse medium.
  5. Vävnaden är uppställd på 150μm tjocklek, med vibratome hastigheten inställd på ett långsamt till medellång räckvidd (beror på vilken vibratome, och därför måste bestämmas individuellt för bästa resultat). I våra händer är vibrationsfrekvensen optimala när den är inställd på max. De första skivorna kan kasseras.
  6. Så snart RMS innehåller skivor frigörs från bladet (RMS är synlig med blotta ögat som en grå U-formad struktur sträcker sig från SEZ till OB), de är noga benas ut av gelen mögel, och öste med en liten Flathead spatel. Skivorna är placerade på nucleopore membranet i glasbottnade rätter som innehåller slice medium (Figur 3A-B). En typisk tidig postnatal musen hjärnan kommer att ge cirka 2-3 RMS sektioner per halvklotet Vid ett snitt på 150 ìm. Det är viktigt att hantera skivorna hålls till ett minimum eftersom de är mycket bräcklig. Rätterna med skivor överförs sedan till en inkubator.

Donator hjärnansektionering och RMS transplantation

  1. Donator hjärnor (hjärnor uttrycker fluorescerande reportrar i migrera neuroblaster) sektioneras på 250μm tjocklek och skivor samlas i iskallt vävnad förberedelse buffert.
  2. Segment inte omedelbart hänförs till ett dissekera mikroskop med epifluorescence kapacitet, och RMS är försiktigt microdissected, med hjälp av mikro pincett. En pincett används för att stabilisera segmentet medan den andra används för att göra små snitt runt RMS tills det frigörs från segmentet. Den censurerade RMS skärs sedan i små explants (ca 200-500 nm i diameter) före transplantation.
  3. Glas-botten rätter som innehåller värd skivor placerad på nucleopore filter tas bort från inkubatorn och placeras under dissekera mikroskop. Använda synligt ljus är RMS tydligt identifieras och ett litet snitt görs i den första delen av RMS.
  4. Med hjälp av en pipett utrustad med en 20 mikroliter spets, är en enda givare RMS Explantation överförs till inristade plats i den mottagande RMS. Den Explantation är försiktigt trycks in i snitt för att skapa kontakt mellan två vävnader. För att säkerställa denna kontakt är stabilt, är explants skjuts något i mellan segmentet och nucleopore membranet.
  5. När alla värden skivor med RMS transplanteras, är de rätter tillbaka till inkubatorn i minst 1 timme så att avsnitt för att sätta sig på membranet. Neuroblaster ska börja migrera från Explantation i den mottagande RMS efter ca 1-2 timmar.

Time-lapse avbildning av neuronala migration

  1. Den glasbottnade rätter överförs från inkubatorn till inkuberas kammare på mikroskop (Figur 3C). Fluorescerande neuroblaster kan avbildas i intervall från 0 till 10 minuter beroende på önskad analys. Till exempel har vi bilden cytoskelettala dynamik under flyttande cykel av enskilda neuroblaster genom att sätta våra intervall på mindre än eller lika med 2,5 minuter. Men populationsdynamik såsom orientering och hastighet migration bättre fångas i intervaller från 5 till 10 minuter. Valet av mål är mycket varierande beroende på fabrikat av mikroskop. För en Nikon C1 konfokalmikroskop, finner vi att 20x torra objektivet (Nikon Pan Fluor, NA 0,75, WD 0,35 mm) passar bäst för våra analyser. För bästa resultat på denna konfokala system är hål öppnas för en medelstor (60μm diameter). För de flesta lämpliga vandrande beteende, avbildning begränsad till celler djupt inne i tjocklek RMS, minst 20 m avstånd från någon av Snittytorna i segmentet. Lasereffekt bör optimeras så att det är minst, men att detaljerna i enskilda neuroblaster förbli synligt.
  2. När avbildning är klar skivor kan fixas med iskallt, och nytillagade 4% paraformaldehyd, immunostained och monterad på bilderna för vidare bildbehandling. Eftersom vi inte päls vårt membran med alla tillhörande substrat såsom laminin, skivorna flyter vanligtvis bort från membranet när de är nedsänkta i färgning buffertar. Avsnitten är avbildade med bibehållet 150 ìm tjocklek. Det är också möjligt att cryopreserve och frysa skivor och använda en kryostat att få tunnare delar av den ursprungliga skivor. Men kommer detta att leda till ökad incidens av artefakter i färgning samt ändra integriteten av vävnaden.

II. Material / utrustning

Beredning av maträtter glas botten för organotypic skivor

  • Små sprutor (1 ml)
  • 23-gauge nålar
  • Nucleopore Track-Etch Membrane - diameter 25mm, porstorlek 8.0μm - Whatman, katt # 110.614
  • Glass Bottom Kultur rätter - 35mm petriskål, 14mm Microwell, nr 1,5 coverglass - MatTech, katt # P35G-1.5-14-C
  • Gummi Cement - Elmer-talet, katt # E904
  • Bassubstratets Eagle - Gibco, katt # 21.010
  • 1M Hepes (pH7.4)
  • 1M D-glukos
  • 100mm CaCl 2
  • 100mm MgSO 4
  • 1M NaHCO 3
  • dH 2 O
  • 200mm L-glutamin
  • Penicillin-streptomycin

Brain utvinning och inbäddning

  • Bedövning (isofluorane, etc.)
  • Mikrovågsugn
  • Låg smältpunkt agaros - Fisher, katt # BP1360-100
  • Krazy lim - katt # KG585
  • Peel-A-Way Disponibel Bädda formar (R-40) - 22mmx40mm rektangulär, 20mm djup - Polysciences, katt # 18646C

Brain sektionering och RMS transplantation

  • Vibratome - Leica VT1000S och alla komponenter tillbehör för bit förbereda
  • 10X Hanks Balanced Salt Solution - Gibco, katt # 14.185
  • Microdissecting pincett # 5 - Roboz, katt # RS-4976
  • Microspatula - Fisher, katt # 21-401-15
  • Stereomikroskop

Time-lapse avbildning avorganotypic skivor

  • Fuktad Incubator, 5% CO 2
  • Inverterat mikroskop utrustat med inkubator kammare och långa distansarbete mål (NA på 0,6 eller högre)

III. Recept

Buffertlösning för mjukpapper dissektion och skiva förberedelse (vävnad förberedelse buffert)

Stamlösning Volym Final Concetration
10X HBSS 50 ml 1X
1M Hepes (pH 7,4) 1,25 ml 2.5mm
1M D-glukos 15 ml 30mm
1M CaCl 2 0,5 ml 1mm
1M MgSO 4 0,5 ml 1mm
1M NaHCO 3 2 ml 4mm
dH 2 O 430,75 ml

Filtrera sterilisera med 0,2 ìm filter och förvara vid 4 ° C.

Odlingsmedium för organotypic skivor, vävnadstransplantation och bildbehandling (skiva medium)

Stamlösning Volym Slutlig koncentration
Bassubstratets Eagle 35 ml
Tissue förberedelse buffert 12,9 ml
1M D-glukos 1,35 ml 20MM
200mm L-glutamin 0,25 ml 1mm
Penicillin-streptomycin 0,5 ml 100units / ml penicillin och 0,1 mg / ml streptomycin

Filtrera sterilisera med 0,2 ìm filter och förvara vid 4 ° C.

Beredning av låg smältpunkt agarosgel

Låg smältpunkt agaros späds ut i vävnad förberedelse buffert på 0,3 g / ml i en 50 ml koniskt rör (se recept). Röret mikrad i steg om 5-10 sekunder på hög effekt. Antalet steg är beroende av totala volymen, för 10 ml, skall tre steg (10-8-5 sekunder vardera) räcka. Röret cap är omsorgsfullt skruvas mellan värme steg att släppa lufttryck och undvika explosion av röret. Försiktighet måste iakttas när röret innehållet kommer att vara mycket varm. När agarosen är fullständigt upplöst, är röret hållas i 37 ° C vattenbad i minst 5 minuter så att temperaturen stabiliseras före användning. Långvarig exponering för rumstemperatur härdar gelen. Även om detta måste undvikas så mycket som möjligt, kan härdad gel värmas och åter smälte för omedelbar användning inom 24 timmar efter första beredning.

Immunohistokemi på organotypic skivor

Efter bildbehandling på konfokalmikroskop kan skivor fastställas över natten vid 4 ° C med 4% formaldehyd i PBS. Avsnitten är sedan blockerade natten vid 4 ° C, i 10% get serum med 1% Triton X (Sigma, Cat. # S26-36-23) i PBS följt av natten inkubering med primära antikroppar vid 4 ° C. Fluorescerande-märkta get sekundära antikroppar används för visualisering (alla utspädd 1:1000, 1 timme inkubation vid rumstemperatur). Märkta skivor är grundligt tvättas 5-6 gånger med iskallt PBS före montering på objektglas och coverslipping.

IV. Representativa resultat

Vår organotypic skiva kultur protokollet har noggrant testade och optimerade över det senaste åren för konsekvens i migrations mönster och orientering. Analys av celler emigrera från explants från möss där uttrycket av den röda fluorescerande proteinet, Td-tomat, induceras under nestin promotor (nestin-Td tomat), visar mycket orienterad och snabb migration av tdTomato + neuroblaster i den mottagande RMS ( Figur 4A). Hög förstoring tidsförlopp analys illustrerar utmärkt upplösning av hela längden av en vandrande neuroblast under en 20-minuters imaging session (Figur 4B).

Skivor med donerade Td-tomat + celler var fasta och immunostained för olika cellulära komponenter inom RMS. GFAP + astrocyter och CD31 + blodkärl avslöjades med fluorescerande immunohistokemi (Figur 5A). Hög förstoring analys av skivor färgade för cytoskelettala proteiner aktin och tubulin avslöja icke-enhetligt uttryck för dessa komponenter av en cell mitt i migreringen (Figur 5B).

Antikroppar som används idessa exempel: kanin anti-RFP (Abcam, 1:250), kanin anti-GFAP (Dako, 1:1000), råtta anti-CD31 (BD Pharmigen, 1:100), mus-anti-aktin (Santa Cruz, 1: 500), kanin anti-tubulin (Sigma, 1:1000), get-anti-mus Cy3 (Chemicon, 1:1000), get-anti-kanin AlexaFluor 647 (Invitrogen, 1:1000), get-anti-råtta AlexaFluor 488 (Invitrogen , 1:1000), get-anti-kanin AlexaFluor 488 (Invitrogen, 1:1000).

Figur 1
Figur 1. Beredning av glasbottnade rätter för organotypic skivor. Flera fläckar av lim är placerade runt den runda glasbottnade komponent i skålen (röd), lämnar en sida öppen för utbyte av medel från undersidan av filtret. En 150μL droppe skiva medium är placerad i mitten av glaset täckglas. En nucleopore membran (blå) tillämpas sedan, blanka sidan nedåt, samtidigt som inga luftbubblor fastnar mellan glaset täckglas och membranet. En milliliter av skiva medium (grå) är spridd på toppen av membran, och maträtter inkuberas vid 37 ° C före användning.

Figur 2
Figur 2. Brain utvinning och förberedelse för sektionering. (A) Skalle exponeras genom öppning i hårbotten från halsen till nosen (streckade linjen längs mittlinjen). Skallen är sedan klippa längs-och anteriorly början i Cisterna Magna, genom att göra 1 mediala och 2 laterala snitt (en på varje sida, 2A). (B) lateralt de flesta aspekter av hjärnbarken och den bakre delen av CNS är opererande för att förbättra stabiliteten i vävnaden under vibratome snittning. (CD) De två hjärnhalvorna är därefter separeras och placeras mediala nedåt i en inbäddning mögel före applicering av 3% agarosgel lösta i vävnad förberedelse buffert.

Figur 3
Figur 3. Brain snittning och cross-transplantation. (A) värdvävnaden är uppställd på 150μm tjocklek och RMS innehåller avsnitten är omsorgsfullt placerade platt på nucleopore membran av kallt glas-botten rätter. (B) Givarens hjärnor (hjärnor uttrycker fluorescerande reportrar i RMS) sektioneras på 250μm tjocklek och skivorna samlas i iskallt vävnad förberedelse buffert. Givaren RMS microdissected och skär i små explants. Med hjälp av en pipett utrustad med en 20 mikroliter spets, är individuella RMS explants överföras till en snittas plats i den mottagande RMS. (C) Efter 1-2 timmars inkubering, är rätter överförs till en inkuberas skede på ett konfokalmikroskop och migration fångas med time-lapse avbildning. Den photomicrograph är en representativ låg förstoring bild av en typisk skiva (grå), som inrättats 1 timme efter transplantation (röd Explantation från tdTomato + RMS en givare mus, röda streckade linjerna kontur RMS i den mottagande slice).

Figur 4
Figur 4. Migration av neuroblaster från explants i den mottagande RMS. (A) nestin-tdTomato + neuroblaster (röd) migrera från explants i den mottagande RMS (streckad grön linje) 1 timme efter transplantation. tdTomato + celler invaderar RMS i den mottagande organotypic skivor röra sig i en mycket orienterad och snabbt sätt bort från SEZ och mot OB. (B) flyttande cykel kan observeras i hög effekt tidsförlopp bilder av en neuroblast under cirka en 20 minuters period. Skala = 10 mikrometer.

Figur 5
Figur 5. Immunhistokemisk bedömning av organotypic skivor. Explanterade neuroblaster (röd) fastställdes i mitten av migration 12 timmar efter transplantation. (A) Lysrör immunhistokemisk färgning av skiva visar en tät pool av GFAP + astrocyter (blå) och spridda CD31 + blodkärl (grön) inom RMS i den mottagande slice. (B) cytoskelettet i en isolerad tdTomato + är migrerar cell (röd) i en mängd RMS avslöjades av samarbete immunfärgning med antikroppar mot aktin (blå) och tubulin (grön).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neuronala migration i RMS är en viktig del av postnatal neurogenes i luktsinnet lökar 1. Migration genom RMS sker i ett plan som tangerar ytan av hjärnan. Tangentiellt migrera neuroblaster skiljer sig från radiellt migrera celler baserat på lokaliseringen av deras stamceller källa, liksom de skiljaktiga öde deras slutliga neuronala produkterna 1, 2, 3. Den relativt rena befolkning tangentiellt vandrar celler under den postnatala RMS gör detta anatomiskt definierbara regionen en optimal plattform för att studera mekanismer tangentiella migration. Dechiffrera de cellulära och molekylära mekanismer för neuronal migration är avgörande för att förstå många nervsystemets sjukdomar (t.ex., Ref. 4). Denna kunskap kan ytterligare underlätta identifieringen av mekanismer som ligger bakom bildningen och spridningen av hjärntumörer (t.ex. Ref. 5), och är nödvändigt för att styra omprogrammeras neuroblaster till platser av skada eller neurodegeneration i framtiden neuronala ersättare strategier.

Trots enorma framsteg under de senaste åren, är den nuvarande förståelsen av genetiska och molekylära mekanismerna bakom neuronala migration, och deras koppling till specifika subcellulära händelser fragmenterad. Mycket av svårigheten att göra tidsintervall i denna strävan beror på att beroendet av de flesta migration studier på vävnad fixering och immunohistokemi, som har använts för att dra indirekta slutsatser om mekanismer av migration i RMS och andra vattendrag migration i den embryonala hjärnan. Den "fasta" tillvägagångssätt är optimalt eftersom det bara ger en ögonblicksbild av en cell, medan temporala upplösningen är ett centralt krav för att förstå en mycket dynamisk process som cellulära migration. Några insiktsfulla studier har tagit upp mekanismer för cell-migration med hjälp av ett in vitro-metod där explants, liknande dem som används i våra protokoll är pläterade på plast eller glas substrat belagda med komponenter i den extracellulära matrisen (t.ex. Refs. 6, 7). Även studier där man använt denna analys har identifierat ett antal mekanismer med tydliga roller i migration, är betydelsen av sina iakttagelser till in vivo-förhållanden oklart. På senare tid har direkt in vivo avbildning av neuroblaster hjälp av fibered konfokalmikroskopi och MRT utförts 8-10. Men sådana tekniker ger bilder med låg upplösning och därmed inte är tillräckligt subcellulära bedömning av neuronala migration. En annan metod, hela berget beredningen utarbetats av Alvarez-Buylla grupp 11, har använts för att generera viktiga fysiologiska insikter i regleringen av subependymala stamceller nisch 12-14. Ändå kan detta eleganta metoden inte användas för att studera neuroblast migration i RMS. Tidigare rapporter utnyttja organotypic skivor för analys av migration i den embryonala hjärnan 15 och den postnatala RMS har publicerats 16-18. Vi har fulländat denna strategi och anger här det protokoll som möjliggör hög genomströmning inspelning av orientering, hastighet och intra-och intercellulära dynamik av migration i RMS med hög upplösning.

De presenterade protokollet innebär vissa utmaningar som kräver praktik, tålamod och avsatt tid för både förberedelser och analys av resultaten. Följande förslag kommer att bistå med att genomföra detta protokoll:

  • Vår erfarenhet är möss i åldrarna i P1 till P10 ge bästa resultat. Ålder-matchning mellan donator och hjärna mottagare förbättrar också reproducerbarhet experiment.
  • Eftersom de flesta reagenser och rätter kulturen måste vara nyberedda, kräver vår skiva analys flera timmars oavbruten förberedelse och bildbehandling på en enda dag. När hjärnan skördas efterföljande steg måste ske så snabbt som möjligt.
  • Mellan halshuggning och beredning av skivor bör alla steg utföras med iskall reagens och vävnad manipulation bör hållas till ett minimum för att undvika anatomiska störningar.
  • De verktyg som används i detta dissektioner bör vara sterila och reserveras för levande vävnad manipulationer bara. Aldrig använda verktyg som någonsin i kontakt med fixativ såsom formaldehyd.
  • Skivorna är i allmänhet lönsamt för upp till 36 timmar, med en synlig nedgång i migrations-hastighet och riktning mellan 24 och 36 timmar. Se upp för denna begränsning när du planerar dina experiment och analyser.

Såvitt vi vet, och erbjuder presenterade organotypic slice-analysen de bästa kända metod för att dechiffrera genetiska och molekylära mekanismer neuroblast migration från SEZ till OB. Med tanke på den nya information om uttryck för signalering nätverk i RMS-19, framtida experiment för att länka de identifieradesignalering kaskader till neuronal migration kommer att kraftigt dra nytta av vår analys. Vårt protokoll kommer att underlätta identifieringen av kandidaten signalmolekyler som kan reglera neuroblast migration självständigt, samtidigt som det ger utredare att bedöma betydelsen av kemokiner och utsöndras faktorer i regleringen av invandringen på ett icke-självständigt sätt, som vi har nyligen visat 18, 20 . Vi presenterade tekniken kan lätt modifieras för studiet av stamcellstransplantation, dendritiska / axonutväxt, och en rad andra ämnen i utveckling neurobiologi och vuxen neurogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive North Carolina State University och College of Veterinary Medicine. Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Vi tackar Dan McWhorter för berätta protokollet i videon. Detta arbete stöds av NIH Grant 5R01NS062182, ett bidrag från American Federation för Aging Research, och institutionella medel som beviljats ​​HTG.

References

  1. Ghashghaei, H. T., Lai, C., Anton, E. S. Neuronal migration in the adult brain: are we there yet. Nat. Rev. Neurosci. 8, 141-151 (2007).
  2. Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
  3. Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nat. Rev. Neurosci. 10, 724-735 (2009).
  4. Jaglin, X. H., Chelly, J. Tubulin-related cortical dysgeneses: microtubule dysfunction underlying neuronal migration defects. Trends Genet. 25, 555-566 (2009).
  5. Carro, M. S. The transcriptional network for mesenchymal transformation of brain tumours. Nature. 463, 318-325 (2010).
  6. Wu, W. Directional guidance of neuronal migration in the olfactory system by the protein Slit. Nature. 400, 331-336 (1999).
  7. Hu, H., Tomasiewicz, H., Magnuson, T., Rutishauser, U., U, The role of polysialic acid in migration of olfactory bulb interneuron precursors in the subventricular zone. Neuron. 16, 735-743 (1996).
  8. Shapiro, E. M., Gonzalez-Perez, O., Garcia-Verdugo, M. anuel, Alvarez-Buylla, J., &, A., Koretsky, A. P. Magnetic resonance imaging of the migration of neuronal precursors generated in the adult rodent brain. Neuroimage. (2006).
  9. Vreys, R. MRI visualization of endogenous neural progenitor cell migration along the RMS in the adult mouse brain: validation of various MPIO labeling strategies. Neuroimage. 49, 2094-2103 (2010).
  10. Davenne, M., Custody, C., Charneau, P., Lledo, P. M. In vivo imaging of migrating neurons in the mammalian forebrain. Chem. Senses. 30, Suppl 1. 115-116 (2005).
  11. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal. J. Vis. Exp. (2010).
  12. Shen, Q. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
  13. Tavazoie, M. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).
  14. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural Stem Cells Confer Unique Pinwheel Architecture to the Ventricular Surface in Neurogenic Regions of the Adult Brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
  15. Polleux, F. &, Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. L9-L9 (2002).
  16. Murase, S. &, Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
  17. Suzuki, S. O. &, Goldman, J. E. Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration. J. Neurosci. 23, 4240-4250 (2003).
  18. Ghashghaei, H. T. The role of neuregulin-ErbB4 interactions on the proliferation and organization of cells in the subventricular zone. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 1930-1935 (2006).
  19. Khodosevich, K., Seeburg, P. H., Monyer, H. Major signaling pathways in migrating neuroblasts. Front Mol. Neurosci. 2, 7-7 (2009).
  20. Jacquet, B. V. Analysis of neuronal proliferation, migration and differentiation in the postnatal brain using equine infectious anemia virus-based lentiviral vectors. Gene Ther. 16, 1021-1033 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics