Laddar Drosophila nervterminaler med kalcium indikatorer

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Kalcium är en allestädes närvarande budbärare i nervsystemet som är viktiga för att utlösa frisättningen av neurotransmittorer och förändringar i synaptisk styrka. Här visar vi en teknik för laddning Ca 2 +-indikatorer i Drosophila nervändslut. Vi visar också tillverkningen av de erforderliga apparater och understryka punkter kritiska för tekniken framgång.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (6), e250, doi:10.3791/250 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kalcium spelar många roller i nervsystemet, men ingen mer imponerande än som utlösare för frisättningen av neurotransmittorer, och ingen djupare än som budbärare viktigt för synaptisk plasticitet som stödjer inlärning och minne. För att ytterligare klarlägga den molekylära grunderna för Ca2 +-beroende synaptiska mekanismer, är en modell som krävs som är både genetiskt formbar och fysiologiskt tillgängliga. Drosophila melanogaster ger en sådan modell. I detta system, genetiskt kodade fluorescerande indikatorer för att upptäcka Ca 2 + förändringar i nervändslut. Har dock dessa indikatorer begränsad känslighet för Ca 2 + och ofta visar en icke-linjär respons. Syntetiska fluorescerande indikatorer är bättre lämpade för att mäta snabba Ca 2 + förändringar i samband med nerv aktivitet. Här visar vi en teknik för laddning dextran-konjugerade syntetiska Ca 2 + indikatorer till levande nerv terminaler i Drosophila larver. Särskild tonvikt läggs på de aspekter av protokollet mest kritiska till tekniken framgång, exempelvis hur man kan undvika statisk elektricitet utsläpp längs den isolerade nerver, bevara hälsan av preparatet under längre lastning perioder, och se till Axon överlevnad genom att ge Ca 2 + för att främja tätning av avhuggna Axon slut. Låg affinitet dextran-konjugerade Ca2 +-indikatorer, såsom fluo-4 och Rhod, finns tillgängliga som visar ett högt signal-brus-förhållande medan minimalt störa presynaptiska Ca 2 + dynamik. Dextran-konjugering förhindrar Ca 2 + indikatorer som binds in i organeller som mitokondrier. Lastning teknik kan tillämpas lika på larver, embryon och vuxna.

Protocol

  1. Välj en ren dissektion maträtt som inte har varit utsatt för någon fixeringsmedel.

  2. Dissekera en vandrande 3: e INSTAR Drosophila larv i Schneiders Drosophila medium som innehåller Ca 2 + och L-glutamin, (skär inte några nerver eller skada muskelfibrer Nos 7, 6, 13 eller 12).

  3. Välj ett glas fyllning-pipett med en 12 micron spets (inre diameter).

  4. Med hjälp av en spruta och slang (för att tillämpa undertryck på pipett) se till att pipettspetsen inte hindras.

  5. Välj en fin plastfyllning-filament som kan sättas ner längden på glaspipett.

  6. Rita ~ 1 cm på 5 mm dextran-konjugerade Ca2 +-indikator i plasten glödtråden.

  7. Klipp alla segment nerver.

  8. Stöd pipetten på en ramp som gör det möjligt för pipettspetsen att närma sig den ventrala mittlinjen av dissekeras larv.

  9. Rita den avskurna ändan av en nerv att segmentera No.4, utan att klämma nerven, i slutet av pipetten (inkluderar en liten mängd av Schneiders medium).

  10. Ta bort slangen och sätt in plast glödtråden i pipetten till slutet av glödtråden är inom 50 mikron på den kapade ändan av nerven (undvik att röra nerven).

  11. Mata ut tillräckligt Ca2 +-indikator på nervänden att öka volymen av Schneiders mediet med ca 33% (slutliga koncentrationen ska vara <2mm). Viktigt - Det här måste vara avslutad inom 5 minuter att klippa nerven.

  12. Placera preparatet i mörker vid rumstemperatur medan nerven laster.

  13. Efter 40 minuter bort Ca2 +-indikator med hjälp av glödtråden.

  14. Låt pipetten på plats och fylla den helt med färska Schneiders medium, eftersom detta kommer att användas för att tillämpa stimulerande pulser till nerven.

  15. Låt Ca 2 +-indikatorn att balansera i nerven i minst 60 minuter, men inte mer än 4 timmar, innan Ca2 +-avbildning.

  16. Skölj preparatet med färska Schneiders medel var 30 minuter medan den utjämnande.

  17. 20 minuter innan bildhantering ersätta Schneider medium med Hemolymph-Som No.6 lösning (HL6; Macleod et al 2002;. 2003).

  18. L-glutaminsyra eller glutamat kan läggas till HL6 lösning på 7mm att okänsliga postsynaptiska glutamatreceptorer för att förhindra nerv-framkallat muskelkontraktion (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Schneider’s Insect Medium Reagent Sigma-Aldrich S0146 must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Reagent Sigma-Aldrich G1626

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
  2. Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
  3. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
  4. Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).

Comments

6 Comments

  1. I would like to know what do you use as dissection pins for the larvae, and where do you get them from?
    With thanks
    Eyal Gruntman
    Cold Spring Harbor Labs, NY

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 4:10 PM
  2. Hello Eyal. You can purchase the entomology pins from Fine Science Tools (FST) at Foster City, CA (Cat. No.²600²-10).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 5:41 PM
  3. Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 27, 2009 - 2:18 PM
  4. Would you please provide me the catalogue numbers for the micro-instruments used in the larva dissection? I am starting similar dissections and have found considerable difficulty with the available intruments.
    Thanks,
    Mike Quinn
    Brock University, ON

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 4:54 PM
  5. Hello Mike. We use scissors from Fine Science Tools (FST) (Cat.No.15000-08) and No. 5 forceps, also from FST (Dumoxel).

    Reply
    Posted by: Greg M.
    January 19, 2010 - 5:14 PM
  6. Thanks Greg.
    Cheers

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 9:43 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics