확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

Published 2/02/2011
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Immunology and Infection
 

Summary

여기 우리는 효율적으로 확장하고 정화 인간 NK 세포의 큰 숫자를하고 기능을 평가하는 방법을 설명합니다.

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Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells . J. Vis. Exp. (48), e2540, doi:10.3791/2540 (2011).

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Abstract

자연 킬러 (NK) 세포가 전염성 미생물 및 종양의 다양한 대한 면역 감시에 중요한 역할을한다. NK 세포와 체외에서 확장 기능의 제한 여부는 NK 세포 immunotherapy의 개발을 제한하고 있습니다. 여기 우리는 효율적으로 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로, 멤브레인 - 바운드 IL21을 표현하는 K562 세포를 사용하여 기능성 NK 세포의 생체내 예 방대한 수량을 확장하는 방법을 설명합니다.

최신 NK 세포 입양 요법은 T 세포 혹은 NK 세포의 긍정적인 선택의 고갈 다음 기증자의 정상 상태 leukapheresis 얻은 세포 제품을 활용했습니다. 이 제품은 일반적으로 하룻밤 사이에 IL - 2 활성화하고 다음 1 일 관리합니다. 때문에 주변 혈액 NK 세포의 낮은 주파수의 NK 세포의 상대적으로 작은 숫자는 임상 실험에 전달되었습니다.

체외에서 NK 세포를 증식하는 무능력은 최적의 임상 결과에 대한 충분한 세포 번호를 생성을위한 제한 요인을하고 있습니다. NK 세포의 일부 확장 (1~2주 이상의 50-10 배)이 높은 선량 IL - 2 혼자 2 일까지 달성될 수있다. autologous T 세포의 활성화는 지역 시토킨 3 출시를 통해 또 아마도, NK 세포 확장을 중재 수 있습니다. mesenchymal 기질이나 인공 항원 제시 세포 (aAPCs)로 지원 말초혈 및 코드 혈액 모두에서 NK 세포의 확장을 지원할 수 있습니다. 연합 NKp46와 항체 - 코팅 구슬로 CD2 인증은 현재 21일 약 100 배 확장의 결과, NK 세포 확장 (Miltenyi Biotec, 오번 CA)에 판매합니다.

NK 세포를 aAPC - 확장 또는 활성화 사용하는 임상 실험이 진행, 상당한 확장을하지 않고 leukemic 세포 라인 최고급 및 활성화 NK 세포 CTV - 15을 사용 하나입니다. 두 번째 재판은 21일 6 건 490 배 확장을 달성, NK 세포 확장을위한 EBV - LCL을 활용합니다. 세 번째는 K562 기반 aAPC 21 일 이내에 277 배 의미 NK 확장을 달성 4 - 1BBL (CD137L) 및 막 - 바운드 IL - 15 (MIL - 15) 7과 transduced 사용합니다. NK 세포 K562 - 41BBL - mIL15를 사용하여 확대 있지만 aAPC가 unexpanded 북한 세포에 비해 체외 및 생체내 높은 세포 독성 있으며, ADCC에 참여, 자신의 증식이 노화 telomere 단축 8 귀속에 의해 제한됩니다. 최근에는 NK 세포의 350 배 확장은 K562 표현 미카, 4 1BBL와 IL15 9를 사용 보도했다.

NK 세포 확장의 우리의 방법은 여기 21일에 평균 21,000 배 확대를 달성 노화하지 않고 NK 세포의 급속한 확산을 생산하고 설명했다.

Protocol

1. 버피 코트에서 PBMCs의 분리

주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)는 leukapheresis에서 파생된 건강한 기증자 버피 코트를 샘플에서 Ficoll - Paque에 대한 낙관적인 밀도 원심 분리하여 얻을 수 있습니다.

  1. Ficoll - Paque 원심 분리는 사소한 수정 따라 제조 업체의 프로토콜로 이루어집니다.
  2. 140 ML (일반 버피의 코팅 량이 40-70 ML합니다)의 최종 볼륨 혈액 은행 버피 코트를 정상 기증자에 PBS를 추가합니다.
  3. 레이어 Ficoll - Paque (4 튜브) 15 ML에 버피의 외투 샘플 35 ML.
  4. 브레이크없이 20 분 동안 400g의 원심 분리기.
  5. Ficoll - Paque에서 PBMCs 복구 : 플라즈마 인터페이스를 Ficoll - Paque의 하단에있는 RBCs을 삭제하지 않습니다.
  6. 10 분 400g 각 시간을 centrifuging, PBS로 PBMCs 세 번 씻으십시오.
  7. PBMCs는 (제 4) RosetteSep에 의해 격리 수있는이 단계에서 NK 세포 확장 또는 NK 세포에 대한 직접 사용할 수 있습니다
  8. 남은 PBMCs는 액화 질소에 10 % DMSO를 포함 FBS에 냉동 수 있습니다.
  9. Ficoll을 대기음 두 50 ML의 원심 관에 5 단계에서 RBCs를 수집, PBS (50 ML 표시 추가)로 세 번 씻어, 각 시간 RBC 계층의 맨 위에는 granulocytes를 제​​거 뜨는 감추고 대기음.
  10. RBCs는 NK 세포의 RosetteSep  정화 (4 항 참조)에 즉시 사용 또는 4 알서버의 솔루션의 같은 볼륨에 저장할 수 있습니다 ° C 나중에 사용하기 위해 (RBCs 4 주 최대 저장할 수 있습니다.)

2. NK 셀 확장

NK 세포 확장이 PBMCs를 사용하거나 NK 세포를 정화 시작하실 수 있습니다. 확장에 사용 PBMCs의 금액이 세 주 확장의 끝에 원하는 NK 세포의 크기에 따라 다양 수 있습니다 자세한 내용은 대표적인 결과 섹션을 참조하십시오. (참고 1 참조)

자극 하나

주 영

  1. 확장 각 5x10 6 PBMCs, 백작과 100 쥐에서 감마 irradiator를 사용하여 10x10 6 K562 Cl9 mIL21을 비추다.
  2. 우편 조사, NK 세포 확장 미디어 (NKEM)에 PBS와 resuspend로 세포를 씻어.
  3. 10x10 6 조사 K562 Cl9 T75 플라스크에 NKEM 40 ML에 mIL21 (1시 2분 비율)과 37 인큐베이터에 똑바로 놓으 ° C와 5% CO 2.와 종자 5x10 6 PBMCs

일 3과 5

  1. 5 분 400g에 원심 분리하여 세포를 복구하고 신선한 NKEM으로 미디어의 절반을 교체 (전체 미디어 볼륨에 대한 신선한 IL2 추가)과 문화를 계속합니다.

자극이

일 6.25

  1. 1 주일 끝에 문화에 세포의 수를 계산합니다.
  2. 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 5x10 5 세포를 (참고 2 참조) 제쳐두
  3. restimulated하는 각 5x10 6 셀, 백작과 100 쥐에서 감마 irradiator를 사용하여 5x10 6 K562 Cl9 mIL21을 비추다.
  4. (참고 3 참조) 2.5x10 5 총 세포 / ML에서 NKEM의 조사 K562 Cl9 mIL21 (1:1 비율)과 resuspend의 동일한 숫자를 추가합니다.
  5. T75 flasks의 종자 세포 (플라스크 당 최대 50 ML)를.

10 12 일

  1. 세포의 개수를 계산합니다.
  2. (참고 3 참조) 셀 번호를 기반으로 신선한 NKEM로 전체 미디어를 변경합니다.

일 14

  1. 확장 2 주의 끝에 문화에 세포의 개수를 계산합니다.
  2. 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 5x10 5 세포를 (참고 2 참조) 제쳐두
  3. 확장이 PBMCs에서 시작된 경우 NK 세포는 RosetteSep 정화 프로토콜 (제 IV 참조)를 사용하여 확장이 단계에서 정화 수 있습니다. 확장은 자극 3 진행 NK 세포를 정화로부터 시작되었습니다하십시오.
  4. 정화는 NK 세포 (8 단계에서와 같이)의 순도를 확인 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 별도 5x10 5 세포를 설정하면.
  5. 정화 NK 세포의 모든 (참고 4 참조)를 사용하여 자극 3 진행합니다.

자극 3

  1. 휴대폰 번호에 따라 NKEM에서 조사 K562 Cl9 mIL21 (1:1 비율) (참고 3 참조) Resuspend NK 세포.

17 19 일

  1. 세포의 개수를 계산합니다.
  2. (참고 3 참조) 셀 번호를 기반으로 신선한 NKEM와 미디어를 변경합니다.

일 21

  1. 확장 세 주 끝에 문화에 세포의 개수를 계산합니다.
  2. 전체 NK 세포 phenotyping 항체 패널 유동세포계측법 분석을위한 1x10 6 세포를 (표 1 참조) 복구.
  3. 나중에 사용하기 위해 유리병 당 5x10 7 세포의 최대 농도에서 10 % DMSO를 포함 FBS에서 세포를 고정.

3. NK 세포 세포 독성 분석

  1. NKEM의 NK 세포와 씨앗의 유리병, PE하기 전에 하루 해동복구를 허용 세포 독성 분석을 rforming.
  2. 하나의 타겟 세포 라인, 6x10 5 NK 세포 3x10 대상 세포를 사용하여 각 NK 세포 세포 독성 분석을 위해 (주 5 참조)가 필요합니다.
  3. NKEM에 Calcein - AM (재고 1 DMSO에 MG / ML)을 (참고 6 참조) diluting하여 CAM - 미디어를 준비합니다.
  4. (주 7 참조) CAM - 미디어 1 ML 10 6 타겟 세포를 Resuspend.
  5. 가끔 잡고, 37 ° C에서 1 H에 대한 부화.
  6. Resuspend NK의 1x10 6 셀 / ML에서 세포 및 U - 하단의 3 우물 각 NK 세포 현탁액의 200uL을 추가 96 - 웰 플레이트에 해당 to10 : 1 E : 그림 1에 표시된 T 비율. (주 8 참조)
  7. "최대"를 제외한 모든 나머지 우물에 완전한 미디어 100uL을 추가합니다.
  8. "최대"로 2% 트리톤의 100uL X - 100을 추가합니다.
  9. 5 후속 E에 대한 NK 세포의 시리얼 dilutions를 수행합니다 : 세포의 100uL 때마다 전송하여 T 비율은 잘 섞는다. 마지막 우물 (0.3125:1의 T 비율 E)에서 100uL 폐기하십시오.
  10. calcein 로딩 1 시간 후, 1200 rpm으로 5 분 centrifuging 두 번 NKEM의 목표 세포를 씻으십시오. (참고 9 참조)
  11. 1x10 5 셀 / ML에서 대상 세포와 resuspend를 다시 계산합니다.
  12. (1x10 4 / 잘) 각 잘하는 대상 세포 100 μL를 추가합니다. 세포 접촉을 시작 100g 1 분 원심 분리기.
  13. 37 품어 ° C, 5 % 4 시간 CO 2.
  14. 균일 출시 calcein을 중지하기 위해서는 100 μL pipetter로 pipetting하여 부드럽게 문화를 혼합, 펠릿 세포 5 분 100g에 접시를 스핀 다운하여 거품을 피하기 위해 관리하는 새 접시에 뜨는 100 μL를 전송합니다. 미세 바늘을 사용하여 양식을 수있는 거품 팝.
  15. 형광 플레이트 리더 (여기 필터 485 NM, 방사 필터 530 NM)를 사용하여 번호판을 읽어보십시오. 히프 읽기를 권장합니다.
  16. X 100. - [/ (시험 자료 - 자연 릴리스) (자발적인 자료 최대 릴리스)] 공식에 따라 특정 용해 비율을 계산

4. RosetteSep하여 NK 세포 정제

  1. 50 ML 튜브 (PBMC 100:1 RBC)로, PBMCs 또는 확장 세포의에 RBCs의 100 배 초과를 가져가라.
  2. 사용 신선한 RBCs 다음 단계로 바로 진행하거나 RBCs가 알서버의 솔루션에 저장된이라면 1,200 rpm으로 centrifuging, RBCs의 수를 계산하고 (100 배 초과) 2퍼센트 FBS와 세 번 보충 PBS로 RBCs의 양을 적절한 세척하는 경우 십분 때마다.
  3. 단계 1.7 또는 PBS 단계에서 2.10에서 확장된 세포에서 PBMCs와 RBCs를 결합 + 2% FBS PBMCs 또는 확장 셀 5x10 7 당 1 ML의 마지막 볼륨.
  4. RosetteSep의 1μL PBMCs 또는 확장 셀 1x10 6 회  인간 NK 세포 농축 칵테일을 추가합니다.
  5. 잘 믹스하고 5 분마다 혼합 부드러운 20 분 동안 상온에서 알을 품다.
  6. 같은 부드럽게 PBS + 2% FBS 믹스의 볼륨과 Ficoll - Paque 상단에 레이어를 추가합니다.
  7. PBMC 분리에 대한 설명 Ficoll - Paque 원심 분리의 단계 (제 I)를 반복합니다.
  8. 정화 후 복구 NK 세포를 카운트하고 북한 세포 순도 (8 단계)에 대한 유동세포계측법에 의해 phenotpying에 대한 5x105 세포를 따로 설정할 수 있습니다.

5. 노트

참고 1. NK 세포가 PBMCs에서 직접 확장 또는 RosetteSep  정화 NK 세포에서하실 수 있습니다. 우리는 유사한 확장 효율성을 지적했지만 어떤 장기 기증자가 확장 이전 RosetteSep로 어려움 정화의 결과로 매우 낮은 NK 세포 번호가있을 수 있습니다.

참고 2. 우리는 일상적 인 경우에는 3 번 CD에 들어 음수 및 CD16 또는 CD56 양성하는 것과 같은 NK 세포를 열거, 확장하는 동안 phenotyping에 대한 CD56 - FITC, CD16 - PE, 그리고 인 경우에는 3 번 CD - PE - Cy5를 사용합니다.

참고 3. 각 매체 변경하거나 자극에서, 2.5 × 10 5 / ML에 resuspend 세포는 확장의 최고 단계에 ML 당 또는 2 백만 이하 NK / PBMC 휴대폰 번호를 유지합니다. 이것은 영양분의 고갈을 방지하고 최대한의 확장과 생존을 달성하는 데 도움이됩니다.

참고 4. NK 확장 속도 stimulations 1 또는 냉동 수있는 세포의 2 부분의 끝에 기증에 의존하고 있으며, 일부는 실험이 필요에 따라 더욱 확대했습니다. 우리는 나중에 확장을위한 냉동 세포를 사용하여 좋은 성공을 있었다.

참고 5. 우리가 NKEM 및 세포 독성 분석을 설정하기위한 NKEM 4 ML에 resuspended 4x10 5 Calcein - AM 스테인드 대상 세포의 700 uls에 resuspended 7x10 5 NK 세포의 최소를 사용하는 것이 좋습니다 오류를위한 공간을 마련하도록하기 위해서. 경우 대상 세포에게 세포의 높은 볼륨에 (최대 6x10 5-6 ML)을 사용중인 미디어 분지의 크기에 따라 필요할 수 있습니다 시딩위한 멀티채널 피펫을 사용합니다. 또한 권장 NK 세포 숫자는 E에 대해 구체적으로 다음과 같습니다 T 비율이 높은 E를 사용, 프로토콜에 게재 : T 비율이 증가이에 따라 ML 당 NK 세포 숫자 (40:1 E 들어 예 : T 비율 사용 4x10 6 셀 / ML)

6 참고. 우리는 1:500, 1:400의 다음 dilutions를 사용하여 원하는 대상 세포 라인에 대한 예비 Calcein - AM 로딩 적정을 수행하는 것이 좋습니다. 1:300, 1:200 1:100과 최대 및 자발적인 릴리스 사이의 최적의 차이를 달성하기 위해.

참고 7. 대상으로 자기편 세포주를 사용하여, 먼저 비 효소 세포 분리 버퍼를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. ADCC을 수행하는 경우, CAM - 미디어 대상 세포의 중복 튜브를 준비합니다.

참고 8 ADCC을 수행하는 경우, 10시 1분 E에 대응하는 세 우물에 동일한 NK 세포를 추가합니다. ADCC를위한 T. 추가 기증자에 대한 반복합니다. 추가 대상 세포에 대해 반복합니다.

참고 9. ADCC 실험을 수행하는 경우, calcein 로딩 45 분 후, 대상 세포에 대한 ADCC를 유도하는 특정 항체의 10ug를 추가합니다. 15 분 후에, 1,200 rpm으로 5 분 centrifuging 두 번 완벽한 매체 목표 세포를 씻으십시오. Resuspend 1x10 5 셀 / ML에서 세포 프로토콜의 다음 단계로 진행합니다.

6. 대표 결과

그림 2
그림 2. 확장이 계획하신대로 수행하면 시작 소재, 1x10 9 10 10 전지 (기증자 의존 다양성)에 전형적인 NK 세포 수율 범위로 5x106 PBMCs를 사용하여, 위에서 설명한. 그림은 북한 세포 배 확장을 보여줍니다 (N = 19) 원래 제품에있는 NK 세포에 비해 (평균 + / - quartile).

그림 3
그림 3. 확장된 NK 세포는 몇 가지 예외 (CD11b, CD160과 CD244)로 unexpanded 기본 NK 세포에 비해 각종 NK 세포 수용체를 표현한다.

그림 4
그림 4. 버피 코트에서 PBMCs 복구 의존 기증하고 300x10 800x10 6 6 범위 수 있습니다. PBMCs의 18 % - NK 세포는 2 %를 구성 수 있습니다. 확대 세포의 RosetteSep 정화 들어, 40~70%에서 하루에 순수 NK 세포 14 범위의 회복. 확장 및 정화의 추천 프로토콜에 따라 99 %의 NK 세포 순도가 기대할 수 있습니다.

그림 5
그림 5. 확장된 NK 세포는 neuroblastoma, AML, osteosarcoma 및 흑색증 (대표 AML 살인은 %가 특정 용해으로 표시)을 포함하여 종양 세포 라인의 범위에 대한 세포 독성을 증명하고있다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

저자는 초기 K562 aAPC 및 mIL21 퓨전 벡터를 만드는 그들의 작업에 로렌스 쿠퍼, Harjeet 싱, 그리고 렌카 Hurton 감사하고 싶습니다.

이 작품에 대한 자금은 UT MD 앤더슨 의사 과학 프로그램, 세인트 Baldrick의 재단, 그리고 프렌즈의 전설에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM)

90% RPMI 1640 Cellgro
10% Fetal Bovine Serum Gibco
1x Penicillin / Streptomycin Cellgro
1x L-Glutamine Gibco Filter Sterilize media before use.
50 U/ mL IL2 Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc) Diluted from a 200 IU/μl stock. Add IL2 to desired amount of media just before use each time.
Name Company Catalog Number Comments

PBMC and NK Cell Isolation

Ficoll-Paque GE Healthcare
Alsever's solution Sigma)
RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail Stemcell Technologies)
Name Company Catalog Number Comments

NK Cell Cytotoxicity Assay

Calcein-AM Invitrogen
Name Company Catalog Number Comments

Antibodies

The list of antibodies used for NK cell phenotyping are listed in table below:

Tube 1: (total volume 100)

Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 555748 Volume: 5
Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 555749 Volume: 5
Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 557224 Volume: 5
Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 340442 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

Tube 2: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: NKp30 PE BD Pharmingen 558407 Volume: 5
Antibody: NKp44 PE BD Pharmingen 558563 Volume: 5
Antibody: NKp46 PE BD Pharmingen 557991 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD16 Alexa 647 BD Pharmingen 557710 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 70

Tube 3: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: KIR2DL1 PE R&D Systems FAB1844P Volume: 5
Antibody: KIR2DL2/3 PE Miltenyi Biotec 130-092-618 Volume: 5
Antibody: KIR3DL1 PE R&D Systems FAB12251P Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: NKG2D APC BD Pharmingen 558071 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 70

Tube 4: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: CD11b PE BD Pharmingen 555388 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD27 APC BD Pharmingen 558664 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

Tube 5: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: CD266 (DNAM-1) PE BD Pharmingen 559789 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD160 Alexa647 eBiosciences 51-1609-42 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

Tube 6: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: CD244 (2B4) PE BD Pharmingen 550816 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD197 (CCR7) APC eBiosciences 17-1979-42 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

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References

  1. McKenna, D. H. Jr Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience. Transfusion. 47, 520-520 (2007).
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Comments

8 Comments

  1. I found this video very interesting:) thank you so much for such a wonderful information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2011 - 2:10 PM
  2. You are very welcome! it was perhaps the most fun I have had in writing a paper :-)
    Let me know if we can be of any help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2011 - 3:41 PM
  3. Very interesting protocol. Would it be possible to obtain your K56² Cl9 mIL²1 cell line? If so, how should one proceed to make that happen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 5:55 AM
  4. We have shared the cell line with many investigators in the US and abroad. Please contact me directly at dalee@mdanderson.org and I can initiate the process. You may also see our recent publication in PLoSONE with more detailed phenotypic and functional analysis using this expansion system at http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0030²64

    Reply
    Posted by: Dean L.
    January 23, 2012 - 9:42 PM
  5. I'm very interested in this ,rencenly I have been searching for data about NK cells,and thank you for sharing the information.

    Reply
    Posted by: zhang y.
    February 28, 2013 - 5:10 AM
  6. I found your article very interesting; and I am sure it will be very useful for my research.
    I have a question: how do you calculate the fold increase in NK-cell numbers, when you start from PBMC?
    Thank you in advance.

    Reply
    Posted by: Uriel M.
    April 7, 2015 - 9:35 PM
  7. Thank you. I will be happy to elaborate on how we calculate fold expansion of NK cells. Please contact me at sssomanchi@mdanderson.org.

    Reply
    Posted by: Srinivas S.
    April 20, 2015 - 5:14 PM
  8. Thank you for this comprehensive video. It was really useful.
    In our lab we made an analogous feeder cell line: derivative of K562 with expression of 4-1BBL and mbIL21. I have performed a set of experiments with donor's PBMC according to your methodology. As a result we have got some problems with viability of donor's cells. So, if it is convenient for you, can we discuss our results in details?

    Reply
    Posted by: Alexandr M.
    March 21, 2017 - 9:48 AM

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