Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

Biology

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Summary

Se introduce un inmunohistoquímica todo el montaje y la microscopía confocal de barrido láser con múltiples etiquetas para analizar la formación de complejos de la red vascular de la piel del ratón extremidades embrionarias.

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Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo. J. Vis. Exp. (51), e2620, doi:10.3791/2620 (2011).

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Abstract

Todo el montaje análisis inmunohistoquímico para obtener imágenes de todo el sistema vascular es fundamental para la comprensión de los mecanismos celulares de la ramificación morfogénesis. Hemos desarrollado el modelo de la piel del miembro vasculatura para estudiar el desarrollo vascular en el que un pre-existentes primitivo plexo capilar se reorganiza en una red jerárquica ramificada vascular. Todo el montaje de microscopía confocal con el etiquetado múltiple permite a la imagen robusta de los vasos sanguíneos intactos, así como sus componentes celulares incluyendo las células endoteliales, pericitos y células de músculo liso, utilizando marcadores fluorescentes específicos. Los avances en este modelo las extremidades vasculatura la piel con los estudios genéticos han permitido comprender los mecanismos moleculares del desarrollo vascular y el patrón. La piel del miembro vasculatura modelo ha sido utilizado para estudiar cómo los nervios periféricos proporcionan un modelo espacial para la diferenciación y el patrón de las arterias. En este artículo se describe un protocolo de vídeo sencillo y robusto para teñir los vasos sanguíneos intactos con vascular anticuerpos específicos y anticuerpos fluorescentes secundaria, que es aplicable para vascularizado órganos embrionarios en los que son capaces de seguir el proceso de desarrollo vascular.

Protocol

1. Ratón recogida de la piel del miembro embrionarias (E13.5 E17.5 ~)

  1. Eutanasia conectado mujeres mediante el procedimiento de aprobación. De acuerdo con el protocolo aprobado animales, las hembras se sacrifican por el CO 2 de exposición y luego aseguró por dislocación cervical. Coloque el animal en su toalla de papel absorbente y disfrutar a fondo en el 70% de EtOH / H 2 O de un frasco.
  2. Diseccionar el útero intacto y colocarlo en un 100 x 15 mm placa de Petri que contiene solución salina equilibrada de helado de Hanks (HBSS) para limpiarla de sangre.
  3. Separados y diseccionar el embrión. Quitar el amnios muy delgada a partir del embrión.
  4. (Opción) la disección de un solo embrión en un plato de 35 x 10 mm Petri si cada embrión debe ser genotipo. Cola disecados se transfiere a un tubo de PCR de 0,2 ml para el genotipado.
  5. Cortar las extremidades anteriores del embrión y la transferencia de las extremidades anteriores con una pinza de anillo en 24 pocillos con 2 ml de helado de dulce 4% paraformaldehído (PFA) en tampón fosfato salino (PBS).
  6. Fijar las patas delanteras con una suave mezcla en el mezclador Nutator a 4 ° C durante la noche.
  7. Al día siguiente, retire la PFA y lavar tres veces durante 5 minutos en 2 ml de PBS con agitación suave en el mezclador de Nutator a temperatura ambiente.
  8. Transferencia de las patas delanteras en el 100% de metanol (MeOH) y almacenarlas a -20 ° C congelador enzima (el congelador con el control de la temperatura crítica y sin función automática de descongelación). Anticuerpos primarios en la tabla 1 el trabajo después del tratamiento con MeOH al 100%.
  9. La piel de fuera de la extremidad anterior con unas pinzas finas. La piel del miembro, cuando se deshidrata, deben separarse fácilmente de la extremidad. En primer lugar la extremidad con la cara ventral (lado de la palma) hacia arriba. Luego, usando unas pinzas finas, cortar la piel, como se muestra en el video. A continuación diseccionar alrededor de toda la extremidad, el pelado de la piel de suavidad sin ningún tipo de daño.

2. Todo el montaje la tinción inmunohistoquímica de Skins extremidades

  1. Rehidratar la piel de las extremidades en polipropileno de 5 ml de fondo redondo de tubo mediante la incubación a través de la serie graduada de MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) durante 5 minutos cada uno. Tenga en cuenta que el intercambio de soluciones debe tener cuidado para no dañar las pieles de las extremidades.
  2. Lavar dos veces durante 5 min en PBT con una suave mezcla en el mezclador de Nutator a temperatura ambiente.
  3. Bloquear la piel del miembro, ya sea con 10% de suero de cabra / PBS 0,2% TX100 tampón de bloqueo para detectar anticuerpos de cabra secundaria o el 10% de suero burro / PBS 0,2% TX100 tampón de bloqueo para detectar anticuerpos burro secundaria durante 2 horas con agitación suave en el mezclador en Nutator a temperatura ambiente.
  4. Colocar las cáscaras en una extremidad 35 x 10 mm placa de Petri y la transferencia con una pinza de anillo en el tubo de 2 ml-microcentrífuga con 800μl de anticuerpos primarios (dilución adecuada como se indica en las tablas) en el tampón de bloqueo (ya sea de cabra 10% de suero / PBS 0,2 TX100% o 10% de suero de burro / PBS 0,2% TX100). Incubar las pieles de las extremidades con una suave mezcla en el mezclador de Nutator a 4 ° C durante la noche. Tenga en cuenta que varios anticuerpos primarios derivados de las diferentes especies (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de rata + anticuerpo policlonal de conejo) se pueden utilizar simultáneamente.
  5. Al día siguiente, el lugar de la piel del miembro en un 35 x 10 mm placa de Petri y la transferencia con una pinza de anillo en polipropileno de 5 ml de fondo redondo de tubo con 4 ml de la solución de lavado (ya sea de cabra 2% de suero / PBS 0,2% o 2 TX100 % burro suero / PBS 0,2% TX100).
  6. Lavar cinco veces durante 15 minutos con la mezcla suave en el mezclador de Nutator a temperatura ambiente.
  7. Colocar las cáscaras en una extremidad 35 x 10 mm placa de Petri y la transferencia con una pinza de anillo en el tubo de 2 ml-microcentrífuga con 800μl de secundaria de anticuerpos en el amortiguador de bloqueo (ya sea de cabra 10% de suero / PBS 0,2% TX100 o el 10% burro suero / PBS 0,2% TX100). Normalmente se utiliza anticuerpos secundarios de Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 diluciones) o Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 dilución). Filtrar la solución secundaria de anticuerpos con 0.22μm PVDF filtros de jeringa de membrana para eliminar las partículas de agregados de la secundaria de anticuerpos. Incubar la piel de las extremidades en la oscuridad o envuelto con papel de aluminio durante 1 hora con agitación suave en el mezclador de Nutator a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que diferentes anticuerpos conjugados fluorescentes secundarios derivados de las diferentes especies se pueden utilizar simultáneamente.
  8. Colocar las cáscaras en una extremidad 35 x 10 mm placa de Petri y la transferencia con una pinza de anillo en polipropileno de 5 ml de fondo redondo de tubo con 4 ml de la solución de lavado (ya sea de cabra 2% de suero / PBS 0,2% o 2% TX100 burro suero / PBS 0,2% TX100). Lavar cinco veces durante 15 minutos en la oscuridad o envuelto con papel de aluminio con mezclado suave en el mezclador de Nutator a temperatura ambiente.
  9. (Opción para contratinción contra el núcleo) Incubar las pieles de las extremidades con 4 ml de la solución de lavado (ya sea de cabra 2% de suero / PBS 0,2% o 2% TX100 burro suero / PBS 0,2% TX100) con A-Pro-3 (Invitrogen T3605 , dilución 1:3000) en la oscuridad o envuelto con papel de aluminio durante 10 minutos con la mezcla suave en el mezclador de Nutator en la sala de temre. A continuación, lavar tres veces por 5 min con 4 ml de la solución de lavado (ya sea de cabra 2% de suero / PBS 0,2% o 2% TX100 burro suero / PBS 0,2% TX100) en la oscuridad o envuelto con papel de aluminio con mezcla suave el mezclador Nutator a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que la tinción fuerte y específica para los núcleos que se observa para To-Pro-3 en una emisión específica (HeNe 633 nm de excitación).

3. Montaje de los Skins en la extremidad de diapositivas

  1. Colocar las cáscaras en una extremidad 35 x 10 mm plato de Petri. Eliminar el polvo, los cristales, las fibras de la capa interna de la piel con unas pinzas finas bajo el microscopio estereoscópico con poca iluminación para evitar la foto de un extenso descoloramiento.
  2. Transferencia de las pieles de las extremidades para portaobjetos adhesivos con una pinza de anillo. Coloque las pieles con la capa interna mentir al alza en la diapositiva (es decir, hacia cubreobjetos). Aplanar la piel cuidadosamente con unas pinzas finas y eliminar traspaso de tampón de lavado por Kimwipe.
  3. Monte en la lucha contra la decoloración medios de montaje sin burbujas de aire. Utilizamos 25 "x25" cubreobjetos. Cura en una superficie plana en la oscuridad (por ejemplo, las muestras montadas con prolongar el reactivo de oro se colocan durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente antes de ver). Para almacenamiento a largo plazo, sellar el cubreobjetos a la diapositiva y se almacenan a 4 ° C.

4. Microscopía Confocal

  1. Establecer láser adecuado para fluoróforos. Utilizamos microscopio Leica TCS SP5 confocal con tres fuentes láser de argón incluyendo 488nm (por Alexa Fluor 488 y GFP), 561nm DPSS (por Alexa Fluor 568 y Cy3) y HeNe 633 nm (por Alexa Fluor 633, Cy5 y To-Pro-3) .
  2. Use la herramienta de búsqueda secuencial para evitar o reducir la interferencia en la que todos los colorantes en las muestras de doble o triple del manchar-se entusiasma al mismo tiempo. En el modo de exploración secuencial, las imágenes se grabarán en un orden secuencial.
  3. Más información general sobre los tintes fluorescentes y láser para la excitación puede ser fundada en "Microscopía Confocal de Biología" por Hibbs (2004)

5. Resultados representante

Todo el montaje immnofluorescence microscopía confocal de triple sello en la piel del ratón en el miembro anterior E15.5 con anticuerpos para el marcador de células endoteliales pan-PECAM-1 (Figura 1-C, D azul), el marcador de neurofilamentos 2H3 (Figura 1 verde), y las células de músculo liso marcador αSMA (Figura 1 A, B rojo) revela un patrón característico de ramificación de las arterias αSMA +, alineado con 2H3 + nervios periféricos en la piel del miembro. Además de la ramificación de los vasos sanguíneos, la piel esta extremidad modelo vascular se utiliza para estudiar los patrones de ramificación de vasos linfáticos con anticuerpos para el marcador de las células endoteliales linfáticas LYVE-1 (Figura 1 D, E de color rojo) y Neuropilin2 (NRP2) (Figura 1 D, F verde ).

Figura 1
Figura 1. (AC) Las arterias se alinean con los nervios periféricos en la piel del miembro embrionario. Todo el montaje de triple sello microscopía confocal immnofluorescence con anticuerpos para el marcador de células endoteliales pan-PECAM-1 (AC, azul), el marcador de neurofilamentos 2H3 (A, verde), y el marcador de las células musculares lisas αSMA (A y B, de color rojo ) se muestra. En E15.5, 2H3 + nervios periféricos (flechas abiertas) asociados con las arterias (puntas de flecha), que están cubiertos por αSMA + en las células del músculo liso. (DF) linfático vascular en la piel del miembro embrionario. Triple-etiqueta de la microscopía confocal immnofluorescence con anticuerpos para el marcador de células endoteliales pan-PECAM-1 (D, azul), el marcador de las células endoteliales linfáticas LYVE-1 (D y E, de color rojo) y Neuropilin2 (NRP2) (D y F, verde ) se muestra. Los vasos linfáticos son visualizados por tanto LYVE-1 y NRP2, mientras que LYVE-1 también se expresa por una parte de los macrófagos (puntas de flecha abierta). Barra de escala: 100μm.

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Discussion

El sistema vascular es fundamental para el desarrollo de órganos durante la embriogénesis, así como para el mantenimiento de órganos y funciones de reproducción en los adultos, ya que proporciona suficiente oxígeno y nutrientes a los órganos. Red vascular adecuado es bien establecido, con procesos complejos y múltiples pasos por la angiogénesis en el que se reorganiza pre-existentes de la red capilar con estructuras muy ramificadas y jerárquica. A pesar de numerosos trabajos han demostrado que una variedad de moléculas involucradas en estos procesos, no ha sido clara la cantidad de órganos o de sus componentes proporcionan las señales para promover el proceso gradual de desarrollo vascular, incluida la diferenciación endotelial vascular y el patrón de ramificación. Para abordar esta cuestión, los órganos competentes de vascularización en el que son capaces de seguir el proceso de desarrollo vascular es necesario. La piel del miembro modelo de vascularización con ganancia de función y la pérdida de la función de la manipulación genética de alta resolución permite el análisis del desarrollo vascular.

Se describe aquí un protocolo detallado que incluye la disección de las extremidades anteriores de embriones de ratón, todo el montaje la tinción inmunohistoquímica y microscopía confocal que se utiliza habitualmente en nuestro laboratorio para analizar la angiogénesis las extremidades y la piel linfangiogénesis. El protocolo proporciona resultados reproducibles y los vasos intactos para principios y finales de la piel del miembro embrionarias es fácil de imágenes de microscopía confocal. También es aplicable para los adultos oído piel vasculatura (YM y K. Perkins, inédito). Para profundizar en la imagen de la dinámica de crecimiento de vasos sanguíneos y la remodelación, sin embargo, un modelo animal pez cebra como otros con los vasos sanguíneos marcados con fluorescencia es útil para time-lapse de la vasculatura en vivo de alta resolución.

Todo el montaje de microscopía confocal con el etiquetado de múltiples marcadores vasculares nos permite a la sangre de la imagen y las células endoteliales linfáticas, y sus vecinos, incluyendo las células musculares lisas y pericitos en la piel. Además de los anticuerpos marcadores vasculares (Tabla 2), los anticuerpos de los productos del gen reportero (proteína β-galactosidasa, β-gal y verde fluorescente, GFP, Tabla 2) que recapitular el patrón de expresión de genes endógenos de su interés puede ser utilizado. Por ejemplo, podemos utilizar la piel de la extremidad anterior embriones que el reportero lacZ dirigidos a los ephrinB2 (Wang et al., 1998) o EphB4 locus (Gerety et al., 1999), que proporciona un indicador de histoquímica de ephrinB2 o EphB4. EphrinB2, un ligando transmembrana, se expresa en las arterias, pero no las venas, mientras que su receptor, el EphB4 tirosina quinasa se ​​expresa preferentemente por las venas (Wang et al., 1998). Todo el montaje análisis inmunohistoquímico con pieles de extremidad anterior de E15.5 ephrinB2 lacZ + / lacZ o EphB4 / embriones + heterocigotos reveló que los nervios sensoriales periféricos asociados preferentemente con los vasos arteriales (Mukouyama et al. 2002). Estos ratones están disponibles en el Laboratorio Jackson (Efnb2 tm1And / J: stock # 006039, EphB4 tm1And / J: stock # 006044).

El estudio de las diferentes etapas de estos sistemas vasculares revela la dinámica celular de la angiogénesis como la ramificación vascular, la diferenciación arterial / venosa, el desarrollo de vasos linfáticos y músculo liso / pericitos cobertura en la piel del miembro en desarrollo. Por E13.5, primitivo plexo capilar se estableció en la piel del miembro, pero no hay asociación entre los nervios sensoriales y los vasos sanguíneos se observó. Por E14.5, remodelación vascular ocurrido y nervioso asociado a una remodelación vasos ramificados, que expresan marcadores de células endoteliales arteriales y han αSMA + en las células del músculo liso (Mukouyama et al. 2002). Estudios genéticos sugieren que los nervios sensoriales periféricos proporcionan un modelo para determinar los patrones de ramificación de los vasos sanguíneos y la diferenciación arterial (Mukouyama et al. 2002). El análisis de los nervios-VEGF-A mutantes condicionales reveló que los nervios derivados de VEGF-A es necesario para la diferenciación arterial en el miembro piel vasculatura (Mukouyama et al. 2005). Nuestros resultados también mostraron que el VEGF-A los nervios mutantes condicionales presentan menos deterioro de la alineación de los nervios de los vasos, lo que indica la participación de los factores angiogénicos adicionales (s). Esto sugiere que la piel del miembro vasculatura modelo nos permite estudiar los diferentes mecanismos que controlan la diferenciación arterial y el patrón de ramificación vascular. Por otra parte, lo que controla la diferenciación y el patrón venoso de los vasos venosos y linfáticos ramificación aún queda por responder.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Damos las gracias a K. Gill para obtener ayuda con la cría del ratón y el cuidado y la gestión de laboratorio. Gracias también a los miembros Mukoyama laboratorio para ayuda técnica. El financiamiento fue proporcionado por el Programa de Investigación Intramural del Instituto de Salud Naitonal.

Materials

Antibodies

Pan-endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
PECAM-1 Armenian hamster (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 dilution#1
PECAM-1 Rat (M) BD 553369 1:300 dilution
VEGFR2 Rat (M) eBioscience 14-5821-82 1:200 dilution
CD34 Rat (M) eBioscience 13-0341 1:300 dilution
Collagen IV Rabbit (P) AbD Serotec 2150-1470 1:300 dilution#2

Arterial endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
Neuropilin1 Rabbit (P) The Alex Kolodkin’s lab#3 1:3000 dilution
Unc5H2 Goat (P) R&D AF1006 1:200 dilution

Venous endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
EphB4 Goat (P) R&D AF446 1:100 dilution

Lymphatic endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
LYVE-1#4 Rabbit (P) Abcam ab14917 1:200 dilution
LYVE-1#4 Rat (M) MBL D225-3 1:200 dilution
Prox-1 Rabbit (P) Chemicon AB5475 1:1000 dilution
Prox-1 Goat (P) R&D AF2727 1:50 dilution
Neuropilin2 Rabbit (P) Cell Signaling 3366 1;100 dilution
Podoplanin Syrian hamster (M) Hybridoma Bank 8.1.1 1:200 dilution

Smooth muscle cell/pericyte marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
αSMA-Cy3 Mouse (M)#5 Sigma c-6198 1:500 dilution#6
NG2 Rabbit (P) Chemicon AB5320 1:200 dilution
SM22α Rabbit (P) Abcam ab14106 1:200 dilution

Antibodies forGFP reporter

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
GFP Rabbit (P) Invitrogen A11122 1:300 dilution
GFP Rat (M) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 dilution
GFP Chick (P) Chemicon P42212 1:300 dilution

Antibodies for LacZ reporter

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
β-gal Rabbit (P) MP Biomedical 55976 1:5000 dilution
β-gal Goat (P) AbD Serotec 4600-1409 1:500 dilution
β-gal Chick (P) Abcam ab9361 1:200 dilution

Antibodies for peripheral axon

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
2H3 Mouse (M)#7 Hybridoma Bank 2H3 1:200 dilution
Tuj1 Mouse (M)#8 Covance MMS-435P 1:500 dilution
Peripherin Rabbit (P) Chemicon AB1530 1:1000 dilution

Antibodies for migrating Schwann cells

BFABP Rabbit (P) The Thomas Müller’s lab#9 1:3000 dilution

(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody

#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.

#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.

#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.

#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.

#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.

#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.

#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.

#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin.

#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.

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References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
  3. Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
  4. Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).

Comments

5 Comments

  1. excellent! I learned a lot

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 12, 2011 - 5:38 PM
  2. Very detailed and helpful !!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 9:54 AM
  3. it is the first time I saw the image of nerves and vessels so lively. it is a GREAT model to study the dynamic development during mouse embryonic stage even in adult mouse! it is amazing that you found this technic!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 8, 2012 - 11:26 AM
  4. Thanks for the very useful method!
    Have you tried adult mouse skin? What would you recommend to modify if I do whole mount staining of adult mouse skin?
    Thanks a lot!

    Reply
    Posted by: Dong W.
    February 6, 2013 - 10:36 PM
  5. Yes, this method works on adult mouse skin as well. The detailed protocols are descibed in our revision paper submitting to Developmental Dynamics. Thanks!

    Reply
    Posted by: wenling l.
    February 7, 2013 - 2:19 PM

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