BALB / C脑组织中的高灵敏度检测5 - hydroxymethylcytosine

Neuroscience
 

Summary

EpiMark 5 HMC和5 - MC分析套件,可用于分析和定量内SPE太平洋轨迹的5 - 甲基胞嘧啶和5 hydroxymethylcytosine。该试剂盒区别于5 HMC 5 - MC除了通过对葡萄糖的酶,利用β-葡萄糖(T4 - BGT)反应羟基组的5 HMC。当5 HMC在CCGG背景下发生,这种修改裂解MSPI网站转换成非裂解网站。

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Davis, T., Vaisvila, R. High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue. J. Vis. Exp. (48), e2661, doi:10.3791/2661 (2011).

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Abstract

DNA羟甲基化是一个久负盛名的DNA修饰,但最近已成为表观遗传学研究的重点。哺乳动物的DNA酶修饰的5 碳的位置,胞嘧啶(C)残留5 - MC,他们主要在CpG二核苷酸中。 5 - MC是服从酶氧化酶的春节家庭,这被认为是涉及发育和疾病5 - HMC。目前,5 HMC的生物作用是不完全理解,但产生了很多的利益,由于其作为生物标志物的潜力。这是由于几个开创性的研究确定,在小鼠胚胎干(ES)和神经细胞的5 - hydroxymethylcytosine。

研究技术,包括重亚硫酸盐测序方法,是无法容易分辨5 - MC和5 HMC。几个协议存在,可以衡量全球基因组中的5 - hydroxymethylcytosine的金额,包括液相色谱与质谱分析或薄层色谱法从基因组DNA消化的单核苷,的。抗体,目标5 - hydroxymethylcytosine也存在,可用于点杂交分析,免疫荧光,或羟甲基化的DNA沉淀,但这些抗体不具备单基地resolution.In此外,分辨率取决于免疫沉淀的DNA的大小和微阵列实验,取决于探头设计。由于它是未知的5 hydroxymethylcytosine在基因组的表观遗传调控中的作用存在的确切位置,新技术,它可以识别位点的具体羟甲基。 EpiMark 5 HMC和5 - MC分析套件提供了一个区分在特定位点的这两个修改的解决方案。

EpiMark 5 HMC和5 - MC分析套件是为5 - 甲基胞嘧啶和5 hydroxymethylcytosine在一个特定的DNA位点的识别和定量分析的简单和可靠的方法。这种酶的方法,利用同裂酶MSPI和HpaII差甲基化的敏感性,在一个简单的3步协议。

被视为与T4 - BGT感兴趣的基因组DNA,加入葡萄糖moeity 5 hydroxymethylcytosine。这种反应是序列独立的,因此所有5 - HMC将glucosylated;未修改或5 - MC含有DNA不会受到影响。

这glucosylation是随后由酶切。 MSPI和HpaII认识到相同的序列(CCGG),但不同的甲基化状态很敏感。 HpaII切割只有一个完全未修改的网站:任何修改或者胞嘧啶块裂解(5 - MC,5 HMC或5 ghmC)。 MSPI识别和切割5 - MC和5 HMC,但不是5 ghmC。

该协议的第三部分是通过PCR的轨迹审讯。可用于输入DNA低至20纳克。实验(glucosylated和消化)和控制(模拟glucosylated和消化)的目标与侧翼利益CCGG网站(100-200 BP)引物的DNA进行扩增。如果中央人民政府网站包含5 hydroxymethylcytosine,带检测glucosylation和消化后,但不能在非glucosylated控制反应。实时PCR将在这个特殊的网站是多少hydroxymethylcytosine逼近。

在这个实验中,我们将分析终点PCR方法在小鼠BABL / C大脑样本5 hydroxymethylcytosine金额。

Protocol

1。 DNA Glucosylation和控制反应

  1. 在反应管上冰的1.5毫升,混合5-10微克的基因组DNA(终浓度为30微克/毫升),12.4微升UDP -葡萄糖(终浓度为80微摩尔),31 NEBuffer 4微升高达310微升无核酸酶水带来的总体积310微升。
  2. 拆分成两个,每管155微升反应混合物。
  3. 然后添加30个单位,或3微升的T4 -β-葡萄糖,一管。向上和向下轻轻吹打混合。第二管是控制反应,所以加水3微升,而不是T4 - BGT。
  4. 孵育都管,在37度摄氏12至18小时,在此期间,T4 - BGT将增加葡萄糖的5 hydroxymethylcytosine组样品中的羟基组。

2。限制性内切酶消化

  1. 三个标签0.2毫升PCR条管1至3号。分装到每个反应混合物50 UL。
  2. 三个标签0.2毫升PCR条管4至6号。 UL混合控制到每一个分装50。
  3. 添加到试管1和4 100个单位,或MSPI 1微升。向上和向下轻轻吹打混合。
  4. 添加到管2和5的50个单位,或HpaII 1微升。向上和向下轻轻吹打混合。
  5. 不要添加任何管3和6,因为他们控制。
  6. 至少4个小时,在37摄氏度孵育的所有6个管。
  7. 添加到每管1微升的蛋白酶K孵育30分钟,摄氏40度。
  8. 灭活蛋白酶K孵育10分钟,摄氏95度。

3。分析DNA PCR / qPCR的

该协议使用,NEB的LongAmp Taq酶终点PCR这已被证明表现良好。可以取代其他PCR检测。

  1. 在冰上0.2毫升PCR反应管:10微升5X LongAmp Taq酶反应缓冲液,1.5微升,10毫摩尔dNTPs,1微升10微摩尔正向引物,1微升10微摩尔的反向引物,3微升模板添加下列组件从前面的步骤,LongAmp Taq DNA聚合酶1微升,无核酸酶水至50微升的DNA。根据PCR的协议,用于这些卷可能会改变。
  2. 轻轻地混合反应。如果有必要,收集所有液体的试管底部,由快速旋转。
  3. 与矿物油覆盖的样本,没有加热的盖子,如果使用一个热循环。
  4. PCR管冰转移到一个热循环与预热到94摄氏度的块,并开始循环程序。例行3步PCR,应在94摄氏度的初始变性30秒,30个循环94度摄氏变性15秒,55至65度摄氏30秒退火,延伸度和65摄氏度的步骤20秒或50秒每KB。这之后,应在65度摄氏5分钟的最后一次延长。实时PCR也可以进行定量5 - 甲基胞嘧啶和5 hydroxymethylcytosine金额。请参考产品使用说明书,在neb.com发现特定的信息。

4。代表性的成果:

图1
图1 5 hydroxymethylcytosine金额在12位点的比较不同的小鼠BALB / C组织样本。 (一),终点PCR扩增。 (二),实时PCR。

从四个小鼠组织DNA进行了分析。为便于比较,未切割DNA的实时PCR数据正常化。标准曲线来确定套数。未消化的控制的拷贝数(5)除以样品没有1-6的拷贝数的样品可以归。盒装凝胶泳道显示在5 HMC目前的变化。

Discussion

设立这个实验时,有几个关键的事情要考虑。首先,它是非常重要的基因组DNA glucosylation收益来完成。 T4 - BGT序列特异性是不为人所知,并且,它似乎已经为基材序列别无选择。因此,在某些情况下,潜伏期较长时间,可能是必要的。其次,MSPI和HpaII消化必须是完整的,以避免背景信号。对于这些限制性内切酶,我们推荐的4个小时的潜伏期的时间,但不完全卵裂是观察时,可以进行较长的孵化。第三,输入DNA量可以调整取决于可用性,自20农工商超市的DNA可用于终点PCR。最后,我们建议使用提供的对照DNA,这可能是基因组DNA的同时运行5 - MC和5 - HMC量化。

Disclosures

泰德和吉卜赛人,这篇文章的作者,是NEB员工;罗姆人是该套件的主要开发者特德的应用与发展部,负责本试剂盒的发展署署长。

Acknowledgments

Sriharsa普拉丹,香侬 - 莫雷金尼,恒庆钦Jurate Bitinaite,郑瑜,皮埃尔奥利维尔Esteve,Romualdas Vaisvila,史蒂芬五雅各布森的实验室,加州大学洛杉矶分校。部分支持这项工作是由美国国立卫生研究院1R44GM095209 - 01。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit New England Biolabs E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0323
dNTPs New England Biolabs N0447
molecular biology grade water

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References

  1. Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).
  2. Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).
  3. Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).
  4. Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).
  5. Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).
  6. Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5, (1), e8888-e8888 (2010).

Comments

3 Comments

  1. Will you please send me this article of "High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue". I just cannot download it.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2011 - 11:15 PM
  2. Linkejimai nuo Audriaus Buskeviciaus. Sekmes.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 23, 2011 - 2:48 PM
  3. Can glucosylation of C happen in vivo and is it possible that MspI digestion could be partially blocked by such a modification (without prior treatment with T4 BGT)? Thanks.

    Reply
    Posted by: Lise R.
    October 2, 2012 - 5:09 AM

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