Beredning och användning av HIV-1 infekterade Primär CD4 + T-celler som målceller i Natural Cytotoxiska Killer Cell analyser

Immunology and Infection
 

Summary

Cytotoxiciteten Analyser för att mäta naturliga mördarceller cell lytisk svar på hiv-infekterade celler begränsas av renhet målceller. Vi visar här en isolering av ett mycket rent population av HIV-1 infekterade primära T-cells blaster genom att dra nytta av HIV-1 förmåga att ned-modulera CD4.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Davis, Z. B., Ward, J. P., Barker, E. Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays. J. Vis. Exp. (49), e2668, doi:10.3791/2668 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Naturliga mördarceller (NK) celler är en viktig del av det medfödda immunsvaret mot virus-infekterade celler. Det är viktigt att förstå förmågan hos NK-celler att känna igen och lyse HIV-1-infekterade celler eftersom identifiera eventuella AVVIKELSE i NK-cellernas funktion mot HIV-infekterade celler kan potentiellt leda till behandlingar som skulle öka deras cytolytisk aktivitet. Det finns ett behov av att använda HIV-infekterade primära T-cells blaster som målceller snarare än infekterade T-cellinjer i cytotoxicitet analyser. T-cellinjer, även utan infektion, är ganska mottagliga för NK cellslys. Vidare är det nödvändigt att använda autologa galvaniska element för att förebygga allvarliga klass histocompatibility komplexa Jag obalans mellan målet och effektor cell som kommer att resultera i lys. Tidiga studier som utvärderar NK-celler cytolytisk svar på primär HIV-infekterade celler misslyckats med att visa betydande dödandet av infekterade celler 1,2. Men med hjälp av HIV-1 infekterade primära T-celler som målceller i NK-cell funktionella analysmetoder har varit svårt på grund av förekomsten av förorenande oinfekterade celler 3. Denna inkonsekventa infekterad cell till oinfekterade celler förhållandet kommer att resultera i variationer i NK celldöd mellan prover som inte kan bero på variabilitet i givaren NK cellernas funktion. Därför skulle det vara fördelaktigt att arbeta med ett renat infekterad cell befolkningen i syfte att standardisera effektor till målcellen förhållandet mellan experiment 3,4. Här kan vi visa isolering av ett mycket rent population av HIV-1-infekterade celler genom att dra nytta av HIV-1: s förmåga att hämta ner modulera CD4 på infekterade celler och tillgången till kommersiella kit för att ta bort döda eller döende celler 3-6. Det renade infekterade primära T-cells blaster kan sedan användas som mål i antingen en degranulering eller cytotoxiska assay med renat NK-celler som effektor befolkningen 5-7. Användning av NK-celler som effektenheter i en degranulering analys utvärderar möjligheten för en NK-celler att frigöra lytiska innehållet i specialiserade lysosomer 8 kallas "cytolytisk korn". Genom färgning med en fluorokrom konjugerad antikropp mot CD107a, en lysosomala membran protein som blir uttrycks på NK cellens yta när cytolytisk granulat säkringen till plasmamembranet, kan vi bestämma hur många procent av NK-celler degranulate som svar på målcellen erkännande. Alternativt kan NK-celler lytisk verksamheten utvärderas i ett cytotoxiskt test som gör det möjligt för bestämning av andelen målceller lyseras genom frisättning av 51 Cr inifrån målcellen i närvaro av NK-celler.

Protocol

1. Isolering av Human CD4 + T-celler från perifert blod (se figur 1)

  1. Perifert venöst blod (40 till 60 MLS) samlas in i Vacutainer Rör innehållande natrium heparin (Becton Dickenson).
  2. Perifert blod överförs sedan från Vacutainer Rör till 50 koniska mL polystyren rör (20 mL blod per rör).
  3. RosetteSep CD4 + T-cell isolering reagens (StemCell Technologies) läggs i en 1 mL volym för att inte mer än 20 ml blod i ett 50 ml rör och blandas väl.
  4. Blandningen sedan inkuberas vid 20-25 ° C i 20 minuter.
  5. Efter 20 minuter, kalcium och magnesium-fria (CMF) fosfatbuffrad koksaltlösning [PBS (HyClone] w / 2% värmeinaktiveras (56 ° C i 30 minuter) fetalt bovinserum [FBS (HyClone)] skall läggas till de blandningar för att nå en slutlig volym på 40 ml.
  6. Den utspädda blandningar (30 ml) är sedan lager på toppen av 15 mL Lymphocyte Separation Medium [LSM (Cellgro)] i färska 50 ml polystyren koniska rör.
  7. Den 50 ml rör sedan centrifugeras vid 1200 x g i 20 minuter med bromsen avstängd.
  8. Den 50 ml rör tas bort från centrifugen noga, så att gränssnittet mellan LSM och medelstora inte störs. Cellerna i gränssnittet samlas in med en 10 ml pipett och placeras i frisk 50 mL polystyren koniska rör.
  9. De insamlade gränssnitt späds med PBS w / 2% FBS till en slutlig volym på 50 ml.
  10. Den 50 ml rör som innehåller den utspädda gränssnitten centrifugeras vid 1200 x g under 10 minuter med broms på.
  11. Efter centrifugering, är supernatanterna aspirerade och pellets återsuspenderade i 10 ml av PBS w / 2% FBS.
  12. Den cellsuspensioner sedan kombineras till en enda 50 ml koniska rör och spädas till 50 MLS med PBS w / 2% FBS.
  13. Röret med den kombinerade cellsuspension är centrifugeras vid 300 x gi 10 minuter för att avlägsna alla återstående LSM.
  14. Supernatanten aspireras och pellets är då suspenderade i 10 ml av RPMI-1640 medium (HyClone) med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ​​ml streptomycin (HyClone) och 2 mm L-glutamin (CellGro ) (RPMI-komplett) och räknas med hjälp av en hemocytometer.
  15. Koncentrationen av renade CD4 + T-celler justeras sedan 3x10 6 / ml med RPMI-klar.
  16. CD4 + är sedan stimuleras genom odling av dem med anti-CD3/anti-CD28 kopplade till pärlor [T-Cell Expansion Kit (Miltenyi Biotec)] på en tre kulor per cell-talet för 72 timmar vid 37 ° C i en 5% C0 2 fuktad inkubator.

2. Infektion av CD4 + T-celler med HIV-1 (se figur 1)

  1. Cellsuspension innehåller stimuleras CD4 + T-celler tas bort från den kultur plattan och räknade med en hemocytometer.
  2. CD4 + T-celler (~ 2x10 6) läggs till ett 15 ml koniskt rör för användning som osmittad kontroll.
  3. Resten av CD4 + T-cellsuspension placeras i ett 50 ml koniskt rör för infektion.
  4. Rören innehåller CD4 + T-cellsuspensioner centrifugeras vid 300 x g i 10 minuter och den kultur supernatanten aspireras.
  5. Stimulerade CD4 + T-celler är suspenderade direkt i kultur vätskor som innehåller virioner och sedan spinn-infekterade vid 1200 x g 2 timmar vid 20-25 ° C 9. Normalt har vi infektera CD4 + T-celler med en mångfald av infektion (MOI) för 5 för en replikering bristfällig hiv-stam (t.ex. DHIV-3) eller en MOI på 0,01 för ett replikationskompetenta virus (t.ex. HIV-1 NL4 / 3) . Slutliga volymen är oviktiga, utan tuber måste vara balanserad för centrifugering. Polybrene (Santa Cruz) läggs till den kultur vätskan innan spinfection till en slutlig koncentration på 10 mikrogram / ​​ml.
  6. Efter avslutad spinfection är supernatanterna bort och celler resuspenderas i en cell densitet på 3x10 6 / ml RPMI-komplett kompletteras med 100 E / ml IL-2. Den infekterade och oinfekterade celler är kultur för 72 timmar, om ett inaktiverat virus som användes för att infektera cellen eller 5-7 dagar om en replikationskompetenta virus användes för att infektera cellerna. Media bör bytas var 48 timmar under kultur.

3. Isolering av mänskliga naturliga mördarceller från perifert blod

  1. Perifert venöst blod (~ 100 ml) samlas in från samma givare som används för att isolera de CD4 + T-celler i Vacutainer Rör innehållande natrium heparin (Becton Dickenson).
  2. Blodet överförs sedan från Vacutainer Rör i 50 ml koniska rör i 20 ml.
  3. Den Vacutainer Rör sedan tvättas med 8 ml CMF Hanks Balanced Salt Solution [HBSS (Hyclone)] och tvättar överförs till 50 ml conicals containing den 20 mL perifert blod. Den resulterande volymen i varje 50 ml konisk är 35 ml.
  4. Den utspädda blodet sedan lager på toppen av 15 mL LSM i en fräsch 50 ml koniska rör och rören centrifugeras vid 400 x g i 30 minuter med bromsen avstängd.
  5. Rören är försiktigt bort från centrifugen och den resulterande gränssnittet mellan LSM och medelstora skördas från varje rör med hjälp av en 10 ml pipett och placeras i färska 50 ml koniska rör.
  6. Den cellsuspensioner tvättas en gång med CMF HBSS (centrifugeras vid 400 x g i 15 minuter med bromsen på).
  7. Efter den första tvätta supernatanterna tas bort och de resulterande pellets kombineras till en enda 50 ml koniska och tvättas två gånger med CMF HBSS (centrifugeras vid 30 x gi 10 minuter med broms på) för att avlägsna alla återstående LSM.
  8. Efter den sista tvättningen pelleten är resupended i 10 ml ACK lyseringsbuffert (150 mm NH 4 Cl, 1,0 mm KHCO 3 och 0,1 mM EDTA pH 7,3) och inkuberas vid rumstemperatur (20-25 ° C) i 5 min. Detta steg är nödvändigt för att avlägsna kontaminerande erytrocyter från perifera mononukleära blodceller (PBMC).
  9. Efter 10 minuter. 40 ml av CMF PBS läggs till cellsuspension för att stoppa lys reaktionen.
  10. Röret med cellsuspensionen innehåller PBMC och lyserade erytrocyter sedan centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på.
  11. Supernatanten tas bort och pellets är suspenderade i 5 ml PBS med 2% FBS och 2 mM EDTA och räknas med hjälp av en hemocytometer.
  12. Den naturliga mördarceller (NK) celler därefter isoleras från PBMC med en NK-Kit Cell Isolering [negativt urval-mänskliga (Miltenyi Biotec)] enligt tillverkarens anvisningar.
  13. Den genomströmning från kolumnerna samlas i 15 ml rör och rören centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på.
  14. Den supernatanterna tas bort och pellets återsuspenderade. Den återsuspenderade pellets är kombinerade i ett rör i en total volym av 1 ml Iscove ändrade Dulbecco medellång [IMDM (Gibco)] kompletterad med 10% AB + värmeinaktiverad (56 ° C i 30 minuter) humanserum (HS) och räknas med en hemacytometer.
  15. Volymen cellsuspension justeras med IMDM w/10% HS så att den slutliga tätheten av NK-celler är 3x10 6 / mL. Cellsuspensionen delas i hälften. En uppsättning av NK-celler tar emot 200 U / ml rekombinant humant interleukin-2. Den andra uppsättningen celler som finns kvar i medium utan cytokin behandling.
  16. NK cell kulturerna inkuberas därefter över natten vid 37 ° C, 5% CO 2
  17. Den resulterande NK-celler används sedan som effektorceller celler för antingen en CD107a degranulering analysen eller 51 Cr-släpp-analysen.

4. Rening av HIV-1-infekterade celler (se figur 1)

  1. Kulturen vätskor som innehåller infekterade cellerna tas bort från plattorna och centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på.
  2. Supernatanten aspireras och pellets är suspenderade i 2 ml PBS med 2% FBS och 2 mM EDTA och celler räknade med en hemocytometer.
  3. Infekterade celler som inte innehåller HIV-1 är isolerade från de som hysa viruset genom att utnyttja det faktum att HIV-1 ner modulerar CD4. För detta ändamål CD4-positiva Isolation Kit (Invitrogen) används enligt tillverkarens anvisningar med undantag för att en en-CD4 pärla per cell utväxling.
  4. Vid borttagning av CD4 + T-celler, är de döda cellerna bort från det renade cellpopulation hysa viruset med hjälp av en död Kit Cell borttagning (Miltenyi Biotec) enligt tillverkarens anvisningar.
  5. Den genomströmning efter döda celler avlägsnas i spalterna är centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på. Supernatanten bort, återsuspenderade pellets i 1 ml RPMI-komplett och cellerna räknas.
  6. Det renade infekterade cellerna är nu redo för att användas som mål i en CD107a degranulering analysen eller 51 Cr-släpp-analysen.

5. CD107a degranulering-analys (se figur 2)

  1. NK cellkulturer tas bort från plattorna och cellsuspension räknas.
  2. NK cellsuspensioner är centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på.
  3. NK-celler är suspenderade i RPMI-klar och den slutliga koncentrationen justeras till 10 6 celler / ml.
  4. Cellsuspensioner från den isolerade infekterade och oinfekterade T-celler som genereras i ovanstående steg centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på.
  5. Supernatanterna tas bort och pellets suspenderade i RPMI-komplett på 2x10 6 celler / ml.
  6. K562 celler används som positiva celler kontroll målet, eftersom de är mycket mottagliga för NK lys. THan celler centrifugeras vid 300 x gi 10 minuter med broms på, är supernatanterna bort och pellets suspenderade i RPMI-komplett på 2x10 6 celler / ml
  7. I en 96-V-botten och platta 100 MCL mål och 100 MCL effektenheter läggs till brunnarna.
  8. En väl innehåller 100 mcLof effektenheter och 100 MCL av medium utan målceller kommer att användas för icke-specifika NK cell degranulering.
  9. Till varje brunn 10 mcLFITC-konjugerat anti-CD107a (BDIS) tillsätts.
  10. Plattan är centrifugeras sedan vid 20 x g 2 minuter med broms på.
  11. Den centrifugeras plattan inkuberas i 4 timmar vid 37 ° C och 5% CO 2.
  12. Efter inkubation plattan centrifugeras vid 400 x g 5 minuter med broms på.
  13. Supernatanten bort från pelleten.
  14. Varje väl färgas sedan med följande panel av fluorokromkonjugerade antikroppar på is i 20 minuter i sammanlagt 100 mcLof flöde buffert (PBS w / 2% FBS och 0,1% NaN 3)
    1. anti-CD3/14/20 [Pacific Blue-konjugerade (Biolegend)]
    2. anti-CD56 [APC (Biolegend)]
  15. Efter 20 minuters inkubation, är 200 MCL av flödet buffert till varje brunn och skivan är centrifugeras vid 400 x g 5 minuter med broms på.
  16. Flödet bufferten är sedan försiktigt aspireras från varje brunn med en 2 ml aspirerande pipett utrustad med en 200 MCL mikropipett spets samtidigt se till att inte störa pelleten.
  17. Steg 15 och 16 upprepas ännu en gång.
  18. Pellets är suspenderade i 200 MCL 1% paraformaldehyd i CMF PBS. Den cellsuspensioner överförs sedan flyta rör.
  19. Total volym tas upp till 300 MCL genom att lägga ~ 100 MCL på 1% paraformaldehyd i CMF PBS till varje rör.
  20. Händelserna (2x10 4) motsvarande NK-celler samlas in av en flödescytometer med FACS DIVA (BDIS) programvara för förvärv och analyseras med hjälp av Flow Jo programvara (TreeStar).

6. CD107a gating strategi (se figur 3)

  1. Enda cell grindar skapas med hjälp av en forward scatter höjd (FSC-H) vs Forward Scatter bredd (FSC-W) komplott.
  2. För storlek kontra granularitet tomt ett FSC vs sidospridning (SSC) plot skapas på en enda cell grinden. Vanligtvis lymfocyter har relativt låg detaljnivå och medelstora cellstorlek.
  3. Cellerna i lymfocyter porten sedan ritade i ett dot plot av CD3/14/20 färgade celler mot CD56 färgade celler till grind på NK-celler och samtidigt utelämna monocyter (CD14), T-celler (CD3) och B-celler ( CD20).
  4. Den CD56 POS gated befolkningen sedan utvärderas CD107a.
  5. Den NK-celler utan mål grupp används för att ställa portarna för vad som anses CD107a negativ.

7. 51 Cr Släpp analys (se figur 4)

  1. Infekterade målceller är märkta med 125 MCCI 51 Cr (Perkin Elmer) i saline/10 6 celler för 2 timmar i totalt 500 MCL vid 37 ° C och 5% CO 2. Som positiv kontroll 10 6 K562 celler är märkta med 100 MCCI 51 Cr för 2 timmar i totalt 500 MCL vid 37 ° C och 5% CO 2. Den totala volymen tas upp till 500 MCL med RPMI-klar. Volymen av 51 Cr läggs till målceller beräknas här: (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator)
  2. Medan målceller är märkning, är tidigare isolerade NK-celler bort från kulturen och räknas. Cellkulturer som innehåller NK-celler centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med bromsarna på.
  3. Pellets innehåller NK-celler är suspenderade i RPMI-komplett och delas upp i tre rör. Cellen densiteten justeras till 10 5 / ml i ett rör, 2.5x10 5 / ml i det andra röret och 5x10 5 / ml i den tredje röret.
  4. Märkta mål celler tas bort från inkubatorn och 4,5 mL RPMI-komplett läggs till varje rör. Rör sedan centrifugeras vid 300 x GF eller 10 minuter.
  5. Supernatanten hälls ut försiktigt för att inte störa pelleten i en behållare för radioaktivt flytande avfall.
  6. Steg 4 och 5 upprepas två gånger att ta bort alla icke absorberat 51 Cr. Supernatanterna från tredje tvättningen kan avyttras i en container för icke-radioaktivt flytande avfall.
  7. Märkta mål sedan suspenderade i RPMI-komplett till ett slutligt celltäthet av 10 5 / ml.
  8. 100 MCL av märkt mål alikvoteras i brunnar i en 96-V-botten brunnar för en sista cell antal 10 4 målceller / brunn.
  9. Tabell 1 är ett exempel på en typisk konfiguration för ett 51 Cr släpp analys. Varje grupp görs i tre exemplar.
    1 2 4 5 6 7 8 9
    En K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (5:1) K562 E: T (5:1) K562 E: T (5:1)
    B UI E: T (1:1) UI E: T (1:1) UI E: T (1:1) UI E: T (2,5:1) UI E: T (2,5:1) UI E: T (2,5:1) UI E: T (5:1) UI E: T (5:1) UI E: T (5:1)
    C HIV-1 infekterade E: T (1:1) HIV-1 infekterade E: T (1:1) HIV-1 infekterade E: T (1:1) HIV-1 infekterade E: T (2,5:1) HIV-1 infekterade E: T (2,5:1) HIV-1 infekterade E: T (2,5:1) HIV-1 infekterade E: T (1:1) HIV-1 infekterade E: T (1:1) HIV-1 infekterade E: T (1:1)
    D
    E
    F K562 spontan frigörelse K562 spontan frigörelse K562 spontan frigörelse UI spontan frigörelse UI spontan frigörelse UI spontan frigörelse HIV-1 infekterade spontan frigörelse HIV-1 infekterade spontan frigörelse HIV-1 infekterade spontan frigörelse
    G K562 Högsta Släpp K562 Högsta Släpp K562 Högsta Släpp UI Högsta Släpp UI Högsta Släpp UI Högsta Släpp HIV-1 infekterade Maxmum Släpp HIV-1 infekterade Maxmum Släpp HIV-1 infekterade Maxmum Släpp
  10. 100 MCL av ovanstående NK cellsuspensioner läggs till varje brunn som innehåller målceller.
  11. 100 MCL mål läggs till motsvarande brunnar där effektorceller celler frånvarande för de högsta och spontan frigörelse grupper. Den spontana släpper gruppen är inkuberas med ytterligare 100 MCL av RPMI-klar.
  12. Den 96-brunnar är centrifugeras vid 20 x g 2 minuter med broms på.
  13. Den centrifugeras plattan är sedan inkuberas vid 37 ° C och 5% CO 2 i 4 timmar.
  14. Efter 4-timmars inkubation 5 MCL av en 1:10 spädning av mänskliga röda blodkroppar i RPMI-komplett tillsätts till varje brunn förutom det maximala släpper brunnar.
  15. 100 MCL 10% natriumdodecylsulfat läggs till det maximala släpper brunnar.
  16. Plattan är centrifugeras vid 400 x g i 5 minuter till pellets cellerna.
  17. 100 MCL av cell-fria supernatanten skördas från varje brunn och placeras i separata gamma-rör (Perkin Elmer). Rören placeras i en 2470 Automatisk Gamma Counter (Perkin Elmer). Mängden 51 Cr som finns i kulturen vätskan mäts som räknas per minut från genomsnittet av en 2-minuters läsning.
  18. Räknar per minut (CPM) avläsningar av proverna och kontrollerna används för att beräkna% specifika lysering med hjälp av följande ekvation:
    [(Experimentell CPM - medelvärdet av spontana CPM) / (medelvärde högsta CPM - innebär spontana CPM)] x 100

8. Representativa resultat:

Figur 1
Figur 1. Stegen i isoleringen av naturliga mördarceller och generering av HIV-1 infekterade målceller från perifert blod.

Figur 2
Figur 2. Stegen i byggandet av en CD107a degranulering analys utnyttja NK-celler som effektenheter och K562 celler, oinfekterade CD4 + T-celler och HIV-1 infekterade T-celler som mål.

Figur 3
Figur 3. Flödescytometri-gating strategi för en CD107a degranulering analys. (A) gating på enskilda celler och exklusive klumpar eller dubletter på en tomt av FSC-A (Forward Scatter område) vs FSC-H (Forward Scatter höjd). (B) Enkel cell grind ritas som FSC-A mot SSC (Side Scatter) gating på lymfocyter befolkningen. (C) Lymphocyte grind ritas som CD3/14/20(T-celler, monocyter, B-celler) jämfört med CD56 (NK-celler) gating på CD56 POS andCD3/14/20 neg befolkning (NK gate). (D) NK grind ritas som CD107a vs CD56 för att visualisera NK-celler som har degranulated (CD107a POS).

Figur 4
Figur 4. Stegen i byggandet av ett 51 Cr släppa analys utnyttja NK-celler som effektenheter och K562 celler, oinfekterade CD4 + T-celler och HIV-1 infekterade T-celler som mål.

Figur 5
Figur 5. Representativa resultat för att bedöma cytotoxiska svar naturliga mördarceller mot HIV-1-infekterade celler. (A) NK-celler utvärderades för sin förmåga att degranulate utan mål och som svar på K562 element, CD4 + T-celler och HIV-infekterade primära T-celler enligt bedömning av den andel av NK-celler som uttrycker ytan CD107a. Siffrorna i varje kvadrant representerar andel av de totala NK-celler. B) NK-celler bedöms för sin förmåga att Lyse K562 celler, oinfekterade CD4 + T-celler och HIV-1 infekterade T-celler i ett 51 Cr släppa test på olika effektorcellpopulationerna till målcellen nyckeltal (E: T).

Discussion

När du gjort korrekt analyserna som beskrivs i detta protokoll bör ge en representativ bild av NK-cellernas förmåga att degranulate mot och Lyse HIV-1-infekterade celler (se Figur 5). NK cell degranulering som svar på HIV-infekterade celler och NK-celler lys HIV-infekterade celler bör stå i direkt proportion 10. Tillförlitliga resultat för de två NK-cellen funktionella analysmetoder för att mäta cytotoxiska reaktioner på HIV-infekterade celler är beroende av isolering av renade NK-celler samt ett renat population av infekterade celler. Efter att ha renat NK-celler och HIV-1-infekterade celler är avgörande för att uppnå en ganska exakt effektor till målcellen förhållande. Likaså är borttagande av döda och apoptotiska celler från de populationer målcellen viktigt innan 51 Cr-märkning eller inkubation med effektorceller cellerna. 51 Cr kan internaliseras av celler som genomgår apoptos förekomsten av döda eller apoptotiska celler under isotopen märkningssteget kommer att resultera i en hög spontan frigörelse och kommer att snedvrida den beräknade% specifika lys. Dessutom kan förekomsten av döda eller apoptotiska celler utlösa NK-celler degranulering resulterar i onormalt höga nivåer av CD107a uttryck. Exakt pipettering är nödvändig när du tar bort cellfria supernatanterna efter inkubation av NK celler och mål i den 51 Cr släppa analyser, liksom skillnader i volymen av supernatant som avlägsnats ur varje replikat väl kommer resultera i höga standardavvikelser. Ändringar kan göras för att dessa protokoll för att utvärdera betydelsen av specifika NK receptorer i utlösa NK-celler lys av HIV-infekterade celler genom inkubering av effektenheter eller mål före co-kultur med antagonistiska antikroppar mot specifika receptorer eller ligander 6,11. Cytokin-behandlade NK-celler (t.ex. IL-2, IL-15) kan användas för att utvärdera funktionaliteten hos stimuleras NK-celler 12. På samma sätt kan antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet analyser utföras med hjälp av dessa protokoll. Anti-HIV-antikroppar (t.ex. anti-gp120) kan läggas till målceller för erkännande av NK-cellen låg affinitet Fc-receptorn CD16 13. Dessa analyser, även inrättats för att mäta NK-celler cytotoxiska reaktioner på HIV-infekterade celler, kan också ändras för att mäta förmågan hos NK-celler att producera cytokiner efter hiv-infekterad cell erkännande. Även om vi som beskrivs i detta protokoll användningen av in vitro-infekterade celler som målceller vi nyligen beskrivit generationen målet celler från patienter infekterade med HIV. Detta kräver isolering av CD4 + T-celler följt av expansion av celler under en två veckors period efter stimulering med mitogener i närvaro av interleukin-2 11. Efter två veckors period av expansion, är de protokoll som beskrivs i denna artikel användas för att isolera målceller.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin) BD Biosciences 367874
RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit Stem Cell Technologies 15062
CMF PBS Hyclone SH30256.01
FBS Hyclone 10437-028
Lymphocyte Separation Medium Cellgro 25-072-CV
RPMI-1640 Hyclone SH30096.01
Penicillin / Streptomycin Hyclone SV30010
L-glutamine Cellgro 25-005-Cl
T-cell Expansion Kit Miltenyi Biotec 130-091-441
CMF HBSS (1x) Hyclone SH30588.01
0.5M EDTA 46-034-Cl
NK Cell Negative Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-092-657
IMDM GIBCO, by Life Technologies 12440-046
CD4+ Positive Isolation Kit Invitrogen 113.31D
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Polybrene Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-134220
CD3 PacificBlue BD Biosciences 558117
CD14 PacificBlue Biolegend 325616
CD20 PacificBlue Biolegend 302328
CD56 APC Biolegend 318310
CD69 PE BD Biosciences 555531
CD107a FITC BD Biosciences 555800
51Chromium PerkinElmer, Inc. NEZ030002MC
Gamma Counter Tubes PerkinElmer, Inc. 1270-401
2470 Automatic Gamma Counter PerkinElmer, Inc. 2470-0050
FACS Diva BD Biosciences 643629
FlowJo Tree Star, Inc. FJ-9-1YR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ruscetti, F. W. Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells. J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).
  2. Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets. J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).
  3. Ferrari, G. Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).
  4. Shankar, P. Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection. Blood. 96, 3094-3101 (2000).
  5. Ward, J. HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response. PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).
  6. Ward, J. HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts. Blood. 110, 1207-1214 (2007).
  7. Bonaparte, M. I., Barker, E. Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules. Blood. 104, 2087-2094 (2004).
  8. Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).
  9. O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 74, 10074-10080 (2000).
  10. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).
  11. Fogli, M. Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals. PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).
  12. Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells. J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).
  13. Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts. Aids. 18, 1769-1779 (2004).

Comments

1 Comment

  1. I'm scientist and now I have a patent about a new approach of treatment and prevention of HIV/AIDS.In this approach, it is easy to cure the AIDS by restoring the dysfunctional immune system to seek to kill out of the viruses whose insulation poses problem In This approach, we find that it possible to treat this illness by re

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 30, 2011 - 2:22 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics