אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

Bioengineering
 

Summary

שיטה ייחודית בהנדסת רקמות פותחה כדי להאריך סיבי עצב רבים בתרבות ידי משחזרת למתוח צמיחה האקסון, סוג של גידול במערכת העצבים לפיה עצבים להאריך בשילוב עם צמיחה של הגוף והרחבת.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Loverde, J. R., Tolentino, R. E., Pfister, B. J. Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth. J. Vis. Exp. (54), e2753, doi:10.3791/2753 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

במהלך ההתפתחות העוברית מראש הסינפטי, תהליכים עצביים לעבור מרחקים קצרים כדי להגיע ליעדם דרך חרוט צמיחה. במשך הזמן, somata העצבית מופרדים מסופי האקסון שלהם בשל הצמיחה השלד של האורגניזם הגדלת (וייס 1941,. גריי, Hukkanen et al 1992). Mechanotransduction זה משרה מצב משני של צמיחה עצבית המסוגלת להכיל התארכות מתמשך של האקסון (בריי 1984; היידמן בוקסבאום 1994; היידמן, Lamoureux et al 1995;. פפיסטר, איווטה et al 2004)..

צמיחה אקסון מתיחה (ASG) היא להעלות על הדעת גורם מרכזי ההבשלה של תהליכים עובריים קצר לתוך העצבים ארוך קטעי החומר הלבן המאפיין של מערכת העצבים הבוגרת. כדי ללמוד ASG במבחנה, אנחנו מהונדסים bioreactors ליישם מתח לתהליכים axonal קצר של תרבויות העצבית (Loverde, Ozoka et al. 2011). כאן, אנו בפירוט את השיטות בהם אנו משתמשים כדי להכין bioreactors והתנהגות ASG. ראשית, בתוך נתיב כל מתיחה של bioreactor, הנוירונים מצופה על מצע גרירה מיקרו מניפולציה. בשלב הבא, נוירונים להתחדש תהליכים axonal שלהם, באמצעות הארכת חרוט צמיחה, על מצע נייח. לבסוף, צמיחה למתוח מבוצע על ידי גרירה הגופים התא מצופה מן מסופי האקסון דבק המצע נייחים; השחזור צמיחה השלד לאחר הארכה חרוט צמיחה.

עבודות קודמות הראו כי ASG של עוברי העכברים הגב נוירונים שורש הגרעינים מסוגלים שיעורי צמיחה חסרת תקדים עד 10mm/day והגיע באורכים של עד 10 ס"מ; ובמקביל וכתוצאה מכך בקטרים ​​axonal מוגברת (סמית, וולף et al 2001;. פפיסטר, איווטה et al 2004;. פפיסטר, Bonislawski et al 2006;. פפיסטר, איווטה et al 2006;. סמית 2009). זאת בניגוד דרמטי הרחבה חרוט משובי צמיחה (בהיעדר גירויים מכני) שבו קצב הצמיחה הממוצע 1mm/day עם התחדשות מוצלחת מוגבל באורכים של פחות מ 3 ס"מ (פו גורדון 1997;. פפיסטר, גורדון et al 2011). לפיכך, מחקר נוסף של ASG עשוי לחשוף מנגנוני צמיחה dysregulated המגבילים התחדשות בהעדר גירוי מכני.

Protocol

1. סקירה כללית של מערכת צמיחה למתוח אקסון bioreactor

  1. שתי גישות השולט כבר נוצלו ליישם כוחות ניסיוני נוירונים. לפי הגישה הראשונה, כוחות מוחלים על כל נוירון (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, ליו et al 2010). לפי הגישה השנייה, כוחות מוחלים ישירות האקסון על ידי משיכת חרוט הצמיחה. שימוש במחטים זכוכית, גישה זו האחרונה שימש ליצירת מודל חדש של האקסון (ברנל, Pullarkat et al 2007;. אוטול, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, היידמן, et al 2010), כדי לזהות ספי כוח עבור התארכות לבין הפתיחה (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. נג, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, נג et al 1992), ולנתח באשכולות הנוירוטרנסמיטר במסופי האקסון (Siechen, יאנג et al 2009).. רקמה ייחודית הנדסה הרחבה של שיטה זו פותחה כדי לייצר עצב גדול בונה באמצעות אקסון אוטומטיות למתוח צמיחה (ASG) מערכת bioreactor (איווטה, בראון et al 2006;.. פפיסטר, איווטה et al 2006). לאחרונה, פיתחנו גרסה מוקטנת של מערכת bioreactor ללמוד ASG מיקרוסקופית בזמן אמת (Loverde, Ozoka et al. 2011). כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול 9 ימים (לוח 1) אנו משתמשים כיום כדי להכין ולבצע bioreactors ASG שגרתי.
  2. בסך הכל מבצע: המערכת bioreactor ASG מורכב משלושה מרכיבים עיקריים, 1) תא bioreactor עם מסלולים עצמאיים (בארות מוארכים) שבו הנוירונים תרבותי התמתחה, 2) שולחן אוטומטיות תנועה ליניארית ליישם כוחות מתיחה 3) מנוע צעד בקר הכונן עם תוכנת שליטה צמיחה למתוח (איור 1).
  3. בקצרה, ייצור של אבי טיפוס bioreactor בוצעה בחנות מכונת באמצעות מכונת טחינה אנכיים (Bridgeport, אלמירה, ניו יורק). עבור biocompatibility, קלות עיקור ועמידות, הרכיבים הפנימיים bioreactor היו במכונה מ polyetheretherketone "08/03 (הצצה). פוליקרבונט שקוף שימש העפעפיים על מנת לאפשר צפייה במיקרוסקופ אור של תרבויות. קורוזיה עמידים 316 ברגים נירוסטה חומרה המלא ההרכבה (מקמאסטר-קאר, Elmhurst, IL).
  4. החדר bioreactor מורכבת מסגרת מתיחה המהווה 3 נתיבים, לחסום גרירה מתכווננת אשר מתפעל תאים לרוחב הנתיבים, ומוטות גרירה בולטות למניפולציות חיצוניות (איור 2). תרבויות נוירונים הם מצופה על Aclar מצעים הפנויה גרירה תרבות נתמך על ידי לחסום את גרירה (דמויות 2 ו -3). המצע coverslip הפנויה נייח מתחבר אל החלק התחתון של המסגרת מתיחות משתרע על פני כל 3 נתיבים. לפני מתיחה, הנוירונים מצופה חייב להרחיב תהליכים axonal מן המצע גרירה על גבי מצע נייח באמצעות הרחבה חרוט צמיחה. אוכלוסיית האקסונים כי הגשר מצעים יהיה לאחר מכן עוברים מתיחה ידי עקירה השליטה לחסום את הגרירה.
  5. הטבלה אוטומטיות תנועה ליניארית מורכב מנוע צעד (HT23-397, מוצרים Motion יישומית, Watsonville, CA) ואת שולחן תנועה ליניארית (MIPS-2-10-1.0mm, מערכות סרוו, Monteville, NJ) רכוב על שולחן יישור delrin . החדר bioreactor יושב בתוך הטבלה במקביל השולחן תנועה ליניארית. מוטות גרירה המשתרעת החדר bioreactor מהודקים אל השולחן בתנועה ליניארית באמצעות מתאם.
  6. צעד הכונן המנוע בקר (Si 2035, מוצרים Motion יישומית) מתוכנת באמצעות תוכנה כלולה סי מתכנת לשלוט מניפולציה של מצעים גרירה. למתוח axonal מוחל באופן הדרגתי על ידי לקיחת שורה של צעדים תזוזה קטנה במרווחים על ידי לשכון פעמים (פפיסטר, איווטה et al 2004;.. פפיסטר, איווטה et al 2006). מערכת מבוקרת מחשב מספק את היכולת התוכנית פרופילים מותאמים אישית עבור ASG, והוא חיוני ניסויים רציפה על פני כמה ימים עד שבועות.

2. הכנת bioreactor הקאמרית

  1. הכנת מצעים הפנויה תרבות גרירה נייח לתרבות העצבית:
    1. מצעים גרירה בתרבות נחתכים מ 8.5 "x 11" גיליונות של הסרט Aclar (33 ג 2.0 מיליון, בדיקה מבנה, West Chester, PA). בעזרת סכין חד לחתוך את מצעים כ 0.5 x 2.5cm, או מעט קצר יותר מאשר רוחב של נתיבים כדי לאפשר לפחות 1-2mm אישור משני הצדדים.
    2. קלות חול התחתון 1 / 3 rd של מצעים תרבות גרירה משני הצדדים באמצעות נייר זכוכית עדין 1200, חצץ (מקמאסטר קאר). מלטש של מצעים גרירה מאפשרת צמיחה של אקסונים מן מצעים גרירה על גבי המצע coverslip נייח.
    3. גזור 5 x 7 ס"מ פיסת Aclar או להשתמש מס '1 coverslip זכוכית לשמש מצע נייח (# 4865-1, המוח מעבדות מחקר, ניוטון, MA).
    4. נקו המצעים דואר התרבות פתרון Alconox לדלל ולשטוף היטב עם מטוהרים DH 2 O.
    5. לעקר את תרבות מצעים ידי טבילה באתנול 70% במשך 30 דקות. אפשר מצעים לייבוש באוויר בתוך ברדס רקמה סטרילית תרבות.
  2. נקו את תא bioreactor עם Alconox לדלל ו החיטוי לעקר בתוך מיכל החיטוי. מיד לאחר מעוקר, להעביר ברדס סטרילית ולאפשר לאוויר יבש.
  3. המשך בתוך דבק סטרילי מכסה המנוע, מצעים תרבות bioreactor באמצעות סיליקון RTV (Dow Corning # 732, מקמאסטר קאר), כותנה סטרילי היטה מטליות (מקמאסטר קאר):
    1. עם הרגליים לחסום גרירה במצב זקוף המלא שלהם, הדבק מצעים תרבות גרירה לרגליים לחסום גרירה על החלק הלא שייף. הימנעו ממגע עם המשטח תרבות שייף.
    2. דבק המצע תרבות נייח אל החלק התחתון של החדר bioreactor.
    3. הסרת דבק עודף כיסי אוויר ידי בעדינות מדכא משטח יבש נגד מצעים מודבק.
    4. מאז חומצה אצטית RTV סיליקון מדיחים כי הוא רעיל נוירונים, bioreactor הוא נותר יבש תחת אור UV בתוך מכסה המנוע של 2 ימים מלאים לפני מציגה תרבויות עצביים.
  4. מנמיכים את הרגליים לחסום גרירה להשיג 2-3mm חפיפה בין קצות sanded גרירה מצעים ואת המצע נייח. תשומת לב חיוני חייב להיות משולם לגודל של חפיפה, אם הוא גדול מדי, את הטיפים של מצעים גרירה עלול להסיט את המצע נייחים; צמצום מספר אקסונים כי ההיקף החפיפה (איור 3).
  5. מקם את הבלוק גרירה בעמדת הזינוק, עם מוטות גרירה חזר בו בתוך bioreactor. הדקו את הברגים immobilization כדי למנוע תנועה של מוטות גרירה לפני למתוח את הצמיחה.

3. עצבי תרבויות

  1. בריכת 1mL של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​משקל מולקולרי גבוה poly-d-ליזין (חתול # 354210, BD, בדפורד, מסצ'וסטס) בסרום ללא התקשורת באזור המצע ממשק של כל מסלול. אפשר פתרון לדבוק באין מפריע במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. יש לשטוף בעדינות 3x עם DH 2 O, ואחריו סופי לשטוף עם התקשורת והתרבות. Pipetting צריכה להתבצע בחלק האחורי של הנתיבים, הרחוקה ממשק המצע.
  2. בודד הגבי בגרעיני הבסיס explants (DRGs) מן החולדה E16 הגור. שימוש stereomicroscope, לדלל את explants לתוך טיפות באמצעות בצלחות פטרי. איסוף explants 3-4 בעזרת פיפטה 100 צלחת μL ואל קצה המצע שייף את התרבות גרירה. יש להקפיד על הצלחת explants בקצה המצע גרירה באמצעות שלולית קטנה של התקשורת. עד 1mL של התקשורת בתרבות לכל נתיב מספיקה כדי למנוע אידוי במשך כמה שעות תוך הגבלת התנועה של explants. ניסוח מדיה: Neurobasal עם B-27 + 0.5mm-L-גלוטמין (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2.5G / L D-גלוקוז (G-7528, Sigma, רח' . לואיס, מיזורי), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) ו - 20 מיקרומטר FdU + 20 מיקרומטר mitotic uridine מעכבי (F-0503, U-3003, סיגמא).
  3. צרף את המכסה כדי להעביר את bioreactor באינקובטור במשך שעה או עד 1 תאים לדבוק.
  4. מלאו את bioreactor עם התקשורת בתרבות בנקודה הרחוקה ביותר explants כדי למנוע dislodgment. דגירה bioreactor מינימום של 5 ימים ואילו נוירונים להאריך תהליכים axonal על מצע נייח.

4. אקסון צמיחה למתוח

  1. Bioreactor עובר תהליכי הכנה סופית בתוך ברדס סטרילי:
    1. מילוי מאגרי בתוך bioreactor עם פוספט שנאגרו מלוחים כדי ללחלח את החדר והתאיידות להגביל את אמצעי התקשורת והתרבות. במערכת שלנו, את קירות המתחם חלולים לשמש המאגרים. לחלופין, קטן מכסים בצלחת פטרי יוטלו על צדי הרחוב גרירה על גבי נתיבים תרבות.
    2. החלף את המדיה תרבות למלא את הנתיבים עד אפס מקום. Pipetting צריכה להתבצע בחלק האחורי של הנתיבים, הרחוקה ממשק המצע.
  2. במושב bioreactor בתוך הטבלה תנועה אוטומטית הליניארי. אם הניסוי יש להפעיל בתוך אינקובטור, זה לא חייב להיות humidified עקב קורוזיה הפוטנציאל של שולחן תנועה אוטומטית הליניארי.
  3. הדקו את מתאם מוט הגרירה על מוטות גרירה.
  4. באמצעות תוכנה סי מתכנת לרוץ שלב בטבלה תנועה ליניארית ליישר עם מתאם מוט הגרירה להדק אותה אל הבמה. לנוחיותך, להכין רצפים סי מתכנת מראש על מנת לתפעל את הבמה במרווחים ספציפיים.
  5. שחררו את הברגים immobilization על החדר bioreactor כדי לאפשר תנועה חופשית של גוש גרירה.
  6. מתיחה מוחל באופן הדרגתי על ידי ייזום סדרה של צעדים קטנים במרווחים על ידי עקירה לשכון פעמים (פפיסטר, איווטה et al. 2006). הפרדיגמה שלנו מתחיל ידי לקיחת 2 צעדים מיקרומטר כל 172 שניות,וכתוצאה מכך למתוח 1mm נטו מעל 24 שעות. אחרי יום אחד, שיעור למתוח ניתן ramped ידי הגדלת עקירה או להקטין את זמן להתעכב (לוח 2).
  7. לאחר ASG הוא יזם, שינויים בתקשורת הם בדרך כלל לא נדרש. במשך הזמן, עם זאת, תרבות התקשורת בדרך כלל הופך חומצי ניכרת על ידי שינוי בצבע צהבהב. ניסויים נוספים אם נדרש, המדיה הישנה לא ריקה לחלוטין, אך במקום לשנות באופן חלקי בלבד על מנת למזער את הטראומה אקסונים צף.

5. נציג תוצאות:

תהליכים axonal יכול לעבור לצמיחה מתיחה מהירה מאוד חזקים. בתחילה, התהליך מתחיל בתקופה של מתיחות איטי (≤ 1mm/day) שמורכבת, התקות קטנות נדירים. בתוך 24 השעות הראשונות של מתיחות, mechanotransduction של מסלולים עצביים מתרחשת צמיחה, לפיה הנוירונים מתחילים בנוסף הגליל האקסון. תוך 24 שעות חברת ASG רציפה, אקסונים להראות סובלנות גוברת התקות יותר תכופים יותר. באופן כללי, אקסונים יכול לעמוד עלייה בשיעור של למתוח 1mm/day כל 12-24 שעות (פפיסטר, איווטה et al 2004;. פפיסטר, Bonislawski et al 2006;.. פפיסטר, איווטה et al 2006). הגדלת שיעור למתוח מוקדם מדי, לעומת זאת, עלול להוביל לצמיחה מהירה יותר של אקסונים לבחור אבל תביא גם חסימה פתולוגית הגורמת לניתוק.

מתיחה וגדלה אקסונים יש נטייה ליצור חבילות, שמזכיר את הארכיטקטורה של fascicles. ניצול פרוטוקולים הנוכחי, החלק המרכזי, גדל מתיחה של חבילות האקסון אין הידבקויות למצע תרבות. רק דבק בתחילה, קטעי הפרוקסימלית ומ דיסטלי של למתוח וגדלה אקסונים להישאר צמודים מצעים תרבות. לפיכך, החלק המרכזי של אקסונים גדל למתוח צפים בחופשיות, רגישים הפרעה עקב הטיפול.

עבור מגוון רחב של סיבות, אקסונים מסוימים לא יכול לצמוח בשיעור למתוח מיושם. לדוגמה, תא עצב DRG עם שני תהליכים axonal, אשר שניהם עוברים מתיחה, לא יוכל לתרגם את החלבון מספיקות לצמוח בקצב להחיל את המתיחה. אקסונים שלא יכול להכיל את המתיחה להחיל יהיה דק הבאים אפקט של פואסון. מתיחה לאחר יוביל חסימה של אקסונים, הרכבה עיכוב, המוביל ניתוק פתולוגי. רוב האקסונים, לעומת זאת, מסוגלים לעבור ASG בהצלחה רק אחוז קטן של האקסונים עוברים את התהליך הזה כמו גיזום.

איור 1
באיור 1. הצמיחה אקסון למתוח מערכת bioreactor. (א) bioreactor קאמרית תרבות & תנועה אוטומטי שולחן ליניארי, (ב) שלב מנוע כונן בקר ותוכנה סי תכנות.

איור 2
2. איור לשכת bioreactor תרבות. הקריקטורה מתארת ​​את החדר bioreactor מלמעלה עם מכסה הסיר. העמדה של גוש גרירה משקף את סוף שלב הצמיחה למתוח את האקסון. אקסונים גדל מתיחה ניתן לראות צרורות בתוך נתיבי תרבות.

איור 3
איור 3. התשתית תרבות ממשק ציפוי. הקריקטורה מתארת ​​את הרכיבים של מנגנון גרירה בתוך נתיב אחד bioreactor מתצוגת הצד. (למעלה) חפיפה נכונה של מצעים תרבות גרירה נייח. (התחתון) חפיפה מוגזמת של מצעים גרירה נייח גורם קצה המצע גרירה להתכרבל.

סרט 1. קובץ מצורף של מצעים התרבות bioreactor הקאמרית. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

סרט 2. ציפוי של DRG Explants על גבי מצעים גרירה. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

סרט 3. שימוש SiProgrammer. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

סרט 4. קון צמיחה הרחבה על מצע נייחים. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

סרט 5. הצמיחה אקסון מתיחה. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

יום צעד
1 עיקור & ייבוש
2 הדבקה & האסיפה
4 ציפויים ו-PCB תרבות העצבית
9 צמיחה למתוח התחלה

1. טבלת ניסוי לו"ז.

זמן [שעות] דרג למתוח [mm / יום] להתעכב זמן [s] סה"כ אורך [מ"מ] זמן למתוח סה"כ [ימים]
היומרה 24 1 172.8 0 1
למתוח 24 1 172.8 1 2
למתוח 24 2 86.4 3 3
למתוח 24 3 57.6 6 4
למתוח 24 4 43.2 10 5
למתוח 24 5 34.6 15 6

2. טבלה מתיחה שיעור התוספת. כל הצעדים מתיחה הם 2 מיקרומטר עקירה (10 מנוע צעדים צעד = 2 למתוח מיקרומטר).

Discussion

שני צעדים קריטיים יש לשים לב במהלך הכנת bioreactors. ראשית, חפיפה אופטימלית בממשק המצע יש צורך להבטיח כי האקסונים יכולים לעבור על המצע נייח. Aclar כי היא מכורבלת מוגזם או לא מושלם אחרת לא אמור לשמש (איור 3). כדי לייעל את החפיפה, לאשר את המצע גרירה הוא שייף שווה וקשרים המצע נייח באופן אחיד על פני תיקון 2-3mm קשר ארוך. חפיפה צריך להיות מותאם לפני כל ניסוי בקפידה על ידי התאמת גובה הרגליים גרירה.

שנית, תוך מתן עבור התקשרות של נוירונים, ציפויים המצע לקיים כוחות הסתייגותו ניכר שנגרם על ידי עקירה של מתח bioreactor ועל התכווצות של אקסונים (היידמן בוקסבאום 1990; פפיסטר, איווטה et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011). מצעים יש לשטוף היטב במים מעוקרים הן לפני ואחרי ציפוי ליזין. ציפוי צריך להיות מיושם החל aliquots מופשר טרי ולהפיץ בצורה שווה ככל האפשר. חשוב לציין, מצעים לא צריך להתרגש או מופרע אחרת במהלך תקופת ההדבקה. בשלבים הבאים, להימנע ממגע עם מצעים במהלך ציפוי, ו pipet כל הפתרונות מן הקצה המרוחק של נתיבים מן הממשק המצע.

טולרנסים בקשרים של כל רכיב bioreactor יכול להתבטא בצורה של רפוי. בתקופה הראשונה של ASG, רפיון במערכת ניכרת תנועה של הטבלה תנועה אוטומטית הליניארי מתרחשת ללא תנועה של גוש גרירה. הנטוש יכול להשתנות בכל ניסוי, אבל הוא בדרך כלל <1mm בחוויה שלנו. מסיבה זו, "טרום מתח" שלב חיסול רפיון של 1mm/day, ליום אחד, מקדים את לוח הזמנים ASG שבמהלכו חלקים bioreactor לעסוק ולהתחיל התנועה של מצעים גרירה.

בעיות עשויות להידרש אם הצעד עקירה של הטבלה תנועה אוטומטית הליניארי אינו תואם את העקירה של גוש גרירה לאחר שלב טרום מתח תושלם. Asynchronous, התקות מדויק של גוש גרירה המשויכים "stiction 'או חיכוך סטטי בתוך החומרה גרירה כיפוף של מתאם. כדי למנוע בעיות אלה התרחשות, תנועה של גוש גרירה צריך להיבדק על ידי יד, לאחר ההרכבה, תנועה חלקה ללא מאמץ כמעט. אם מחייב מתרחשת, הרכבה הגרירה צריך להיות משוחרר לפני ניסויים. קשיחות מספקת של מתאם זה נחוץ גם כדי להבטיח מדויק, התקות סינכרוני אינם להתגבר על ידי stiction של החומרה גרירה.

Disclosures

התארכות לשעבר vivo מכניות של תאים עצביים הוא תחת פטנט פטנטים בארה"ב # # 6264944 ו 7429267.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי קריירה NSF CBET-0747615. המחברים מבקשים להודות בני הזוג. דאגלס ח סמית ודיוויד פ 'שמיני עבור הדרכה ותמיכתם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PolyEtherEtherKetone (PEEK) McMaster-Carr 8504K69 Custom made bioreactor chamber
Polycarbonate McMaster-Carr 8574K28 Custom made bioreactor chamber lid
Stepper motor Applied Motion Products, Watsonville, CA HT23-397
Linear motion table Servo Systems, Montville, NJ MIPS-2-10-1.0mm
Step motor drive controller Applied Motion Products, Watsonville, CA Si2035
Aclar Structure Probe Inc., West Chester, PA 1859 Towing culture substrates
No. 1 coverslip Brain Research Labs, Newton, MA 4865-1 Stationary culture substrate
Silicon RTV McMaster-Carr 7587A37
Cotton-tipped swabs McMaster-Carr 7074T62
Poly-D-Lysine BD Biosciences 354210

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
  2. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
  3. Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
  4. Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
  5. Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
  6. Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
  7. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
  8. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  9. Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
  10. Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
  11. Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
  12. Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
  13. Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
  14. Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. Forthcoming (2011).
  15. Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
  16. O'Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
  17. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  18. Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
  19. Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
  20. Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
  21. Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
  22. Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
  23. Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
  24. Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
  25. Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).

Comments

5 Comments

  1. This is a nice article..thanks alot fr sharing this useful information..Please visit my blog also and share my ideas : http://dentistryandmedicine.blogspot.com/

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 11:24 AM
  2. Could someone tell me what is the radius of cruvature of the "towing leg"? Was this critical to maintaining the ²-3 mm overlap described in the paper?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 21, 2013 - 12:56 PM
  3. The towing legs were made by drilling a 0.5" hole in a square block, followed by some sanding, which yielded ² towing legs per block. So, the radius would be about 0.²5" for each leg. Frankly, the substrate interface is more art than science. If you have tension at the tip of the towing substrate where it contacts the stationary substrate, you will be successful. The numbers we provide merely help to recreate what we have done. Thanks for your questions, please post again if I can be of any further assistance.

    Reply
    Posted by: Joseph L.
    June 2, 2013 - 12:48 AM
  4. How were the cells imaged during the stretching process? Do you have an incubator that allows live cell imaging?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 23, 2013 - 9:36 AM
  5. The bioreactor shown here was in fact used for live imaging atop the microscope stage. Air was circulated from a nearby incubator through luer lock ports (silver ports visible on fig 1a). A heating element was built into the base and a transparent heated lid was used to prevent condensation. All of the details were published in our 2011 Neurotrauma paper, reference #14.

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21663384

    Reply
    Posted by: Joseph L.
    July 23, 2013 - 1:32 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics