Preimplantation भ्रूण के मवेशी, भेड़, और बकरी के cryopreservation

Biology
 

Summary

Preimplantation भ्रूण hypertonic cryoprotective समाधान में नियुक्ति के बाद cryopreserved सेलुलर निर्जलीकरण के कारण हो सकता है. संतुलन के बाद, बर्फ क्रिस्टल गठन के भ्रूण के आसपास के समाधान में प्रेरित है. इसके अलावा निर्जलीकरण होता है के रूप में भ्रूण धीरे भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में डूबनेवाला से पहले subzero तापमान ठंडा करने के लिए.

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Youngs, C. R. Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats. J. Vis. Exp. (54), e2764, doi:10.3791/2764 (2011).

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Abstract

पशु, भेड़ और बकरियों से Preimplantation भ्रूण कम या लंबी अवधि के भंडारण के लिए cryopreserved हो सकता है. Preimplantation भ्रूण पानी की मुख्य रूप से मिलकर बनता है, और cryopreservation प्रक्रिया के दौरान intracellular बर्फ क्रिस्टल के गठन के परिहार भ्रूण व्यवहार्यता बनाए रखने के महत्व सर्वोपरि है. Ethylene glycol (जैसे) या (GLYC) ग्लिसरॉल कि सेलुलर निर्जलीकरण की सुविधा के लिए एक आसमाटिक ढाल बनाने जैसे cryoprotective एजेंट (सीपीए) के भ्रूण को एक hypertonic समाधान (1.5 एम 1.4) में रखा जाता है. बाद भ्रूण CPA समाधान में आसमाटिक संतुलन तक पहुँचने, वे व्यक्तिगत रूप से ठंड के लिए 0.25 मिलीलीटर प्लास्टिक तिनके में hypertonic CPA समाधान में लोड कर रहे हैं. भ्रूण -6 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर एक नियंत्रित दर फ्रीजर में रखा जाता है बर्फ के क्रिस्टल गठन सीपीए भ्रूण आसपास के समाधान में प्रेरित है, और crystallization भ्रूण के बाहर सीपीए की एकाग्रता में वृद्धि का कारण बनता है, आगे सेलुलर निर्जलीकरण के कारण है. भ्रूण 0.5 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर पर ठंडा कर रहे हैं, आगे निर्जलीकरण को सक्षम करने, तरल नाइट्रोजन (-196 डिग्री सेल्सियस) में डूब जा रहा है पहले -34 ° सी के एक तापमान करने के लिए. Cryopreserved भ्रूण से पहले thawed प्राप्तकर्ता (सरोगेट) महिला को हस्तांतरण किया जाना चाहिए. तिनके भ्रूण युक्त तरल नाइट्रोजन Dewar, 3 से 5 सेकंड के लिए कमरे तापमान हवा में आयोजित किया है, से हटा रहे हैं और 25 से 30 सेकंड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा जाता है. भ्रूण GLYC में cryopreserved 1 sucrose के एक सीपीए के प्राप्तकर्ता (सरोगेट) महिला के लिए हस्तांतरण से पहले हटाने के लिए 10 मिनट के लिए एम के समाधान में रखा है. भ्रूण ईजी में cryopreserved, तथापि, सीधे एक प्राप्तकर्ता के गर्भाशय में स्थानांतरित किया जा सकता है.

Protocol

1. 1 cryopreservation के लिए भ्रूण की उपयुक्तता का मूल्यांकन

  1. व्यक्तिगत दाता महिलाओं की प्रजनन पथ से काटा नमूने एक stereomicroscope मूल्यांकन का उपयोग करने से पहले 10 मिनट के लिए एक isotonic भ्रूण धारण मध्यम में रखा जाना चाहिए. प्रत्येक दाता एक दूसरे से अलग भ्रूण स्थानांतरण वंश की व्युत्पत्ति की पहचान सक्षम महिला से भ्रूण रखने के लिए कुछ रहो.
  2. कम बढ़ाई (10X ≤) का उपयोग, एक व्यक्ति दाता महिला से नमूनों unfertilized ova से मिलकर अलग समूहों में अलग होना चाहिए, भ्रूण, या हस्तांतरणीय गुणवत्ता भ्रूण पतित. केवल गुणवत्ता 1 ग्रेड या विकास के विस्तार ब्लास्टोसिस्ट चरणों के माध्यम से कॉम्पैक्ट morula पर 2 भ्रूण cryopreservation के लिए उपयुक्त हैं, और सभी दूसरों को (त्याग किया जाना चाहिए जब तक तुल्यकालिक प्राप्तकर्ता महिलाओं गुणवत्ता ग्रेड 3 भ्रूण और हस्तांतरण के बाद गर्भावस्था की दर लगभग 25 के लिए उपलब्ध हैं -30% स्वीकार्य समझा जाता है).
  3. एक ≥ करने के लिए सुनिश्चित करें कि भ्रूण के zona pellucida बरकरार है और है कि वहाँ कोई सामग्री नहीं है (जैसे, कोशिकाओं, बलगम) zona pellucida का पालन 50X बढ़ाई गुणवत्ता ग्रेड 1 और 2 विस्तार ब्लास्टोसिस्ट चरण भ्रूण के माध्यम से कॉम्पैक्ट morula का निरीक्षण किया. एक फटे या लापता zona pellucida के साथ या एक zona पक्षपाती सामग्री होने pellucida के साथ कोई भ्रूण अन्य भ्रूण से अलग किया जाना चाहिए और या तो त्याग या अलग से संसाधित.

2. धुलाई भ्रूण रोग 2 पारेषण की संभावना कम करने के लिए

  1. Isotonic भ्रूण धारण माध्यम की एक न्यूनतम मात्रा में zona pellucida बरकरार भ्रूण भ्रूण धोने माध्यम से अच्छी तरह से पहले में ले जाएँ (जैसे, फॉस्फेट और एंटीबायोटिक दवाओं और गोजातीय सीरम albumin, नवजात बछड़े सीरम, या polyvinyl शराब के साथ खारा संवर्धित buffered). प्रत्येक दाता अलग महिला से भ्रूण रखें, और करने का प्रयास करने के लिए एक समय में 10 से अधिक भ्रूण धो नहीं है. माध्यम की एक न्यूनतम मात्रा में भ्रूण प्रत्येक उत्तरोत्तर धोने में एक सीरियल 1:100 ≥ कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए, और बाँझ भ्रूण से निपटने के सुझाव है कि प्रत्येक लगातार धोने के बीच में बदल रहे हैं का उपयोग कुछ ले जाएँ.
  2. 4 और washes के रूप में 2.1 में वर्णित के माध्यम से भ्रूण ले जाएँ.
  3. यदि वायरल रोगों के संचरण चिंता का विषय है, भ्रूण कुल संयुक्त जोखिम के लिए कोई अधिक से अधिक 90 सेकंड के trypsin समय के लिए एक 0.25% trypsin समाधान में दो बार, धोने.
  4. दो trypsin washes के बाद, 5 बार भ्रूण धोने मध्यम में अधिक भ्रूण के रूप में 2.1 में वर्णित धो लो.
  5. अंतिम भ्रूण, isotonic भ्रूण में धो जगह भ्रूण के बाद मध्यम पकड़े.

3. भ्रूण पहले Dehydrating 3 cryopreservation

  1. भ्रूण जैसे ethylene glycol या ग्लिसरॉल cryoprotective एजेंट (सीपीए) के एक hypertonic समाधान (1.4-1.5 Molar एकाग्रता) में isotonic भ्रूण पकड़े मध्यम की एक न्यूनतम मात्रा में स्थानांतरित किया जाना चाहिए.
  2. भ्रूण ठंड मध्यम (hypertonic सीपीए समाधान) में बैठने के लिए जब तक वे आसमाटिक संतुलन तक पहुँचने की अनुमति दें. क्योंकि ethylene glycol भ्रूण कोशिकाओं को और अधिक तेजी से करता ग्लिसरॉल, संतुलन बार आम तौर पर कर रहे हैं ग्लिसरॉल (10 मिनट) की तुलना में ethylene glycol (5 मिनट) में भ्रूण के लिए कम से permeates. इस संतुलन समय के भाग के दौरान और प्राप्त किया जा सकता है के बाद भ्रूण को तिनके (अगले कदम में वर्णित) में लोड कर रहे हैं.

4. Cryopreservation के लिए एक 0.25 मिलीलीटर प्लास्टिक स्ट्रॉ में भ्रूण लोड हो रहा है

  1. 0.25 मिलीलीटर प्लास्टिक एक भ्रूण लोड डिवाइस के लिए भूसे की (11.5 सेमी लंबाई काम कर) के कपास प्लग अंत संलग्न है, और एक अच्छी तरह से लेबल पुआल में hypertonic CPA समाधान के लगभग 1.3 सेमी aspirate. लेबलिंग प्रक्रियाओं की एक किस्म मुद्रित लेबल या तो एक पुआल सील प्लग करने के लिए या एक और एक भूसे एडाप्टर के साथ जुड़ा भूसे के लिए संलग्न के उपयोग सहित मौजूद है,.
  2. CPA समाधान से पुआल निकालें, और हवा के लगभग 0.15 सेमी aspirate भूसे के भीतर एक छोटे हवाई बुलबुले बनाने के.
  3. भूसे में लगभग hypertonic सीपीए समाधान के 0.8 सेमी में एक एकल भ्रूण Aspirate.
  4. CPA समाधान से पुआल निकालें और एक पुआल के भीतर दूसरा छोटे हवाई बुलबुले (हवा बुलबुले के शारीरिक रूप से भूसे के भीतर भ्रूण अलग सेवा) बनाने के लिए हवा के लगभग 0.15 सेमी aspirate.
  5. CPA समाधान के लगभग 9.1 सेमी Aspirate के लिए पूरी तरह से पुआल भरने, CPA समाधान के लिए पर्याप्त मात्रा में आकर्षित करने के लिए पाउडर (पीवीसी) polyvinylchloride गीला कि भूसे के कपास प्लग अंत भीतर मौजूद कुछ किया जा रहा है. सीपीए समाधान जेल करने के लिए पीवीसी पाउडर का कारण बनता है और भूसे की है कि अंत सील है.
  6. पीवीसी पाउडर, प्लास्टिक भूसे सील प्लग, या एक गर्मी मुहर के साथ पुआल के दूसरे छोर सील.

5. एक नियंत्रित दर भ्रूण बर्फ़ीली मशीन में भ्रूण रखकर

  1. या तो मेथनॉल स्नान या तरल नाइट्रोजन वाष्प ठंड मशीनों preimplantation भ्रूण के cryopreservation के लिए क्रमादेशित किया जा सकता है.
  2. Embry युक्त तिनके लोड एक ठंड मशीन जिसका तापमान -6 परिवेश के तापमान से के लिए ठंडा किया गया है में बहुत डिग्री सेल्सियस लोड कपास प्लग अंत तिनके (जब तक प्लास्टिक भूसे सील प्लग या पुआल एडेप्टर इस्तेमाल किया जा रहा है, जो मामले में कपास प्लग अंत नीचे रखा जाता है).
  3. भ्रूण इस तापमान पर आगे बढ़ने से पहले कम से कम 2 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति दें.

6. बीज बोने की क्रिया

  1. एक बार भ्रूण -6 ठंडा है ° सी, तरल नाइट्रोजन (या एक कपास इत्तला दे दी तरल नाइट्रोजन में डूबे छड़ी) में शीतल पुआल के अंदर चिमटे (या कपास छू द्वारा CPA समाधान में बर्फ क्रिस्टल गठन प्रेरित चिमटे की एक जोड़ी का उपयोग करें या तो ऊपर या नीचे भ्रूण समाधान के स्तंभ को इत्तला दे दी) छड़ी.
  2. सीपीए समाधान में पानी तरल नाइट्रोजन को उजागर क्षेत्र में मणिभ बनाना, और बर्फ क्रिस्टल CPA समाधान के स्तंभ तुरंत भ्रूण आसपास फैल जाएगा.
  3. आगे ठंडा होने से पहले 10 मिनट के लिए तापमान बोने में भ्रूण पकड़ो.

7. भ्रूण की सतत निर्जलीकरण

  1. 0.5 ° ° / सी -34 के तापमान को नीचे मिनट सी. के दर पर कूल भ्रूण यह ठंडा दर भ्रूण के निरंतर निर्जलीकरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  2. -34 में भ्रूण पकड़ो ° 10 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन (-196 डिग्री सेल्सियस) में भ्रूण डूबनेवाला से पहले सी है.
  3. एक उचित लेबल (तरल नाइट्रोजन से भर) जाम एक उचित लेबल गन्ना जुड़ी प्लेस में भ्रूण cryopreserved, गन्ना और कम या लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन देवर की एक कनस्तर में जगह.

8. Cryopreserved भ्रूण विगलन

  1. तरल नाइट्रोजन देवर की गर्दन में कनस्तर खींचो, सुनिश्चित करना है कि कनस्तर Dewar में ठंढ रेखा से नीचे बनी हुई है.
  2. भ्रूण thawed जा युक्त बेंत का पता लगाएँ, और जल्दी से और ध्यान से जाम से भूसे को निकालने के लिए, जाम में अन्य तिनके गर्म नहीं कुछ किया जा रहा है.
  3. 3-5 सेकंड (एक फटे zona pellucida 4 की घटनाओं को कम करने) के लिए हवा में पुआल पकड़ो, और फिर एक अतिरिक्त 25-30 सेकंड के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डूब.
  4. पुआल पानी के स्नान से निकालें, पुआल (पुआल पर भ्रूण पहचान धब्बा नहीं सावधान किया जा रहा) पोंछ, एक भूसे काटने डिवाइस का उपयोग करने के लिए बंद कटाव गैर कपास प्लग भूसे के अंत (अगर सील का उपयोग कर गर्मी या पीवीसी पाउडर ), या ध्यान से प्लास्टिक सील प्लग निकालने के लिए, या तो:
    1. एक भ्रूण स्थानांतरण डिवाइस और हस्तांतरण में पुआल के रूप में संभव के रूप में जल्दी से एक तुल्यकालिक भ्रूण प्राप्तकर्ता को लोड (लेकिन सिर्फ अगर भ्रूण सीपीए के रूप में ethylene glycol का उपयोग cryopreserved था), या
    2. 1.0 sucrose के मोलर एकाग्रता (एक यौगिक गैर permeating) युक्त पकवान पर भूसे के खुले अंत पकड़ है, और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए भूसे के कपास प्लग अंत में कटौती. भूसे के सामग्री sucrose के समाधान में स्वतंत्र रूप से प्रवाह चाहिए, लेकिन पुआल के माध्यम से हवा के एक छोटे से कॉलम धक्का आवश्यक हो सकता है अगर किसी भी अवशिष्ट मध्यम पुआल के अंदर मौजूद हो सकता है. भ्रूण sucrose के समाधान में 10 मिनट के लिए रहने के लिए अनुमति दें, और तब isotonic भ्रूण में 10 मिनट के लिए मध्यम धारण भ्रूण स्थानांतरण. बाद पिघलना भ्रूण मूल्यांकन, एक नया भूसे में लोड, और उपयुक्त प्राप्तकर्ता महिलाओं को हस्तांतरण.

9. प्रतिनिधि परिणाम:

कारकों की एक किस्म गर्भावस्था के प्रभाव और जीने जन्म दरों तुल्यकालिक प्राप्तकर्ता 5 महिलाओं के लिए जमे हुए - thawed preimplantation भ्रूण के हस्तांतरण से उत्पन्न हो सकता है . विकास कम कॉम्पैक्ट morula से उन्नत या विस्तार ब्लास्टोसिस्ट की तुलना में अधिक उन्नत चरणों में भ्रूण अक्सर cryopreservation कॉम्पैक्ट morula पर के रूप में अच्छी तरह के रूप में भ्रूण की प्रक्रिया, जल्दी ब्लास्टोसिस्ट, ब्लास्टोसिस्ट, और भ्रूण विकास के विस्तार ब्लास्टोसिस्ट चरणों के जीवित नहीं है. गुणवत्ता ग्रेड 1 और 2 उपज उच्च पद पिघलना गर्भावस्था दरों की तुलना में गुणवत्ता ग्रेड 3 भ्रूण (जो आम तौर पर कम बाद पिघलना गर्भावस्था दरों की वजह से नहीं cryopreserved हैं) के भ्रूण. भ्रूण भ्रूण ठंड या प्रक्रियाओं विगलन भ्रूण के दौरान mishandled कम गर्भावस्था दरों प्रदर्शन की संभावना हैं. प्राप्तकर्ता महिलाओं जिसका estrous चक्र दाता महिला के साथ सिंक्रनाइज़ नहीं कर रहे हैं करने के लिए हस्तांतरित भ्रूण आम तौर पर कम गर्भावस्था दरों का उत्पादन. इन विट्रो में उत्पादित या कुछ तरीके में हेरफेर (जैसे, biopsied या bisected) भ्रूण आम तौर पर कम गर्भावस्था दरों उपज. इष्टतम स्थितियों के तहत, गर्भावस्था दरों जमी thawed vivo में व्युत्पन्न भ्रूण में आम तौर पर 6,7 मवेशियों में 60-70%, 8,9,10,11 भेड़ में 65-75% और 60-70% में बकरियों के हस्तांतरण के बाद प्राप्त 12,13,14,15. इसी प्रकार, गर्भावस्था दरों के हस्तांतरण के बाद प्राप्त जमी thawed इन विट्रो उत्पादन भ्रूण में आमतौर पर 6,16 मवेशियों में 40-50%, 17 भेड़ों में 25-35%, और 18 बकरियों में 30-40% है.

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तालिका 1. उम्मीद जमी thawed भ्रूण की घरेलू जुगाली करनेवाला पशुधन प्रजातियों से तुल्यकालिक प्राप्तकर्ता महिलाओं के लिए स्थानांतरण के बाद गर्भावस्था दरों .

Discussion

क्योंकि भ्रूण पानी की मुख्य रूप से मिलकर बनता है, यह महत्वपूर्ण है कि preimplantation भ्रूण को पर्याप्त रूप से निर्जलित है और धीरे धीरे प्रोटोकॉल के साथ अनुसार ठंडा हो ल intracellular बर्फ क्रिस्टल के गठन से बचने के है. एक बार ठंडा करने की प्रक्रिया शुरू हो गई है, यह महत्वपूर्ण है यूनिडायरेक्शनल तापमान परिवर्तन को बनाए रखने और तापमान के उतार चढ़ाव से बचने के. बर्फ क्रिस्टल गठन विशिष्ट CPA समाधान के लिए एक उचित तापमान पर ("बोने") की शुरूआत महत्वपूर्ण है.

इस धीमी गति / ठंडा preimplantation भ्रूण cryopreservation के लिए तेजी से विगलन विधि करने के लिए संशोधन के एक कदम विधि (जहां भूसे में लोड मध्यम के अंतिम स्तंभ के बजाय सीपीए समाधान sucrose) 19 और प्रत्यक्ष हस्तांतरण विधि (जहां भ्रूण ethylene glycol में जमे हुए शामिल thawed रहे हैं और पहले) भ्रूण 20 से ethylene glycol को हटाने के बिना एक प्राप्तकर्ता महिला के गर्भाशय को सीधे हस्तांतरित. एक सीधा हस्तांतरण (डीटी) प्राप्तकर्ता महिला के गर्भाशय में ethylene glycol की मात्रा को कम करने के लिए जमा, 6 सेमी से पहले जारी रखने के रूप में पहले वर्णित मध्यम जोत के साथ 0.25 मिलीलीटर पुआल भरने की सलाह दी जाती है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक स्वैच्छिक मानक वाणिज्यिक भ्रूण स्थानांतरण उद्योग है कि preimplantation डीटी के लिए cryopreserved भ्रूण पीले रंग तिनके में जमे हुए किया जाना चाहिए और तरल नाइट्रोजन Dewar में पीले रंग goblets में संग्रहीत के भीतर मौजूद चाहिए. वाणिज्यिक उद्योग भी सभी cryopreserved भ्रूण कि पालन किया जाना चाहिए के लिए विशिष्ट लेबलिंग आवश्यकताओं है.

इस विधि के लिए वैकल्पिक कांच में रूपांतर 21, गैर संतुलन cryopreservation जहां एक और अधिक अत्यधिक ध्यान केंद्रित CPA (6-8 एम) समाधान अल्ट्रा तेजी से सीपीए समाधान तरल से बर्फ के बिना एक "बेजान" राज्य बदलने के लिए पैदा करने के लिए ठंडा है की एक विधि है गठन क्रिस्टल. कांच में रूपांतर भ्रूण कि कम developmentally कॉम्पैक्ट morula उनके बढ़ा तापमान संवेदनशीलता के कारण की तुलना में उन्नत कर रहे हैं cryopreservation के लिए बेहतर संभावना अनुकूल है.

इस तकनीक को अंतरराष्ट्रीय वाणिज्यिक भ्रूण स्थानांतरण उद्योग के लिए अद्वितीय जर्मप्लाज्म 22 संसाधनों के संरक्षण के लिए आवेदन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से है, जहां लगभग 500,000 गोजातीय preimplantation कैलेंडर वर्ष 2008 में हस्तांतरित भ्रूण के 55% से अधिक cryopreserved थे 23.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

USDA अनुसंधान बहु राज्य परियोजना से आंशिक धन डब्ल्यू 2171 "रोगाणु सेल और भ्रूण के विकास पशुधन में सुधार के लिए और हेरफेर" आभार स्वीकार किया है. रयान Callahan, जो इस लेख का वीडियो भाग के लिए तकनीकी चित्र तैयार की कलात्मक प्रतिभा को भी आभार स्वीकार कर रहे हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioLife freeze medium Agtech, Inc. C18, C18A 1.5 M ethylene glycol
Emcare ethylene glycol freeze solution ICPBio Reproduction IC8, IC10 1.5 M ethylene glycol
ViGro ethylene glycol freeze plus Bioniche Animal Health EVM835 1.5 M ethylene glycol
Emcare 10% glycerol freeze solution ICPBio Reproduction IC12 1.34 M glycerol
Emcare 1 M sucrose thaw ICPBio Reproduction IC16 1.0 M sucrose
ViGro one-step thaw Bioniche Animal Health EVM247, EVM847 1.0 M sucrose
ViGrothaw 1-2-3 plus Bioniche Animal Health EVM248, EVM848 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose
Emcare CSU thawing kit ICPBio Reproduction IC20 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose
BioLife holding and transfer medium Agtech, Inc. C15, C15A modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin)
Emcare holding solution ICPBio Reproduction IC2, IC4, IC6 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions)
ViGro holding plus Bioniche Animal Health EVM024, EVM824
SYNGROHolding medium Bioniche Animal Health ESM024, ESM224, ESM828 contains hyaluronan; no products of animal origin
BioLife modified D- PBS Agtech, Inc. C06 modified Dulbecco's phosphate buffered saline
BioLifeBSA Fraction V Agtech, Inc. B09 lyophilized bovine serum albumin, fraction V
BioLifeantibiotic-antimycotic Agtech, Inc. B01 amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate
BioLifetrypsin kit Agtech, Inc. C22A 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS
Biol-Cool controlled rate freezer FTS Systems BC-IV -40 Methanol bath freezer
Freeze Control controlled rate freezer Cryologic CL2200 Liquid nitrogen freezer

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References

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Comments

2 Comments

  1. Congratulations for this video.I hope you can upload a vitrification one.I am very interested in videos related with embryo morphology and quality evaluation, superovulation and embryo transfer.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 26, 2011 - 12:46 PM
  2. Really very helpuful material, it will be nice to get other videos about other techniques like embryo splitting.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2012 - 10:55 AM

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