البيوفيزيائية فحوصات للتحقيق في الخواص الميكانيكية للنواة الخلية الطور البيني : الركيزة التطبيق الانفعال والتلاعب Microneedle

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقدم دولتين مستقلتين ، المجهر الأدوات المعتمدة لقياس التشوهات الناجمة عن الأسلحة النووية وهيكل الخلية في الخلايا واحد ، ملتصقة يعيشون في استجابة لطلب سلالة عالمية أو محلية. وتستخدم هذه التقنيات لتحديد صلابة النووية (أي قابلية تغيير الشكل) وبين الخلايا لبحث انتقال القوة بين النواة والهيكل الخلوي لل.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lombardi, M. L., Zwerger, M., Lammerding, J. Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation. J. Vis. Exp. (55), e3087, doi:10.3791/3087 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في معظم الخلايا حقيقية النواة ، النواة هي أكبر عضية وعادة 2 إلى 10 مرات أكثر صلابة الهيكل الخلوي المحيطة ، وبالتالي ، فإن الخصائص الفيزيائية للنواة تسهم إسهاما كبيرا في سلوك النشاط الحيوي لخلايا الكلية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. على سبيل المثال ، في هجرة العدلات وغزو خلايا السرطان ، وتصلب النووية يمكن أن تشكل عقبة رئيسية خلال تسرب أو المرور عبر المساحات الضيقة داخل الأنسجة. 1 ومن ناحية أخرى ، فإن نواة الخلايا في الأنسجة النشطة مثل العضلات ميكانيكيا يتطلب دعما كافيا لالهيكلية تحمل الضغوط الميكانيكية المتكررة. الأهم ، هو نواة تتكامل في العمارة الخلوية ؛ يرتبط فعليا إلى الهيكل الخلوي المحيطة بها ، وهو شرط حاسم لحركة الخلايا وتحديد المواقع للنواة ، على سبيل المثال ، في خلايا الاستقطاب ، نوى متشابك عند التقاطعات العصبية والعضلية ، أو في الخلايا المهاجرة. 2 وليس من المستغرب ، وقد تبين أن الطفرات في البروتينات المغلف النووية مثل lamins nesprins والتي تلعب دورا حاسما في تحديد صلابة النووية واقتران نكليوتيد ، هيكل الخلية ، في الآونة الأخيرة إلى نتيجة في عدد من الأمراض التي تصيب الإنسان ، بما في ذلك الحجر ، دريفوس ضمور العضلات ، الأطراف الاصطناعية الزنار ضمور العضلات وتمدد عضلة القلب. 3 لتحقيق وظيفة من مختلف البروتينات البيوفيزيائية المغلف النووية وتأثير الطفرات محددة ، قمنا بتطوير الطرق التجريبية لدراسة الخصائص الفيزيائية للنواة في الخلايا ، واحدة تعيش تعرض لاضطراب الميكانيكية عالمية أو محلية. قياس التشوهات الناجمة النووية ردا على تطبيقها بدقة الركيزة تطبيق سلالة يعطي معلومات هامة عن قابلية تغيير الشكل من نواة ، ويسمح بالمقارنة بين كمية طفرات مختلفة أو ناقصة عن خطوط الخلايا المحددة البروتينات المغلف النووية. يستخدم التطبيق المترجمة سلالة هيكل الخلية مع microneedle لتكملة هذا الاختبار ، ويمكن أن تعطي معلومات إضافية بشأن انتقال قوة الخلايا بين النواة والهيكل الخلوي لل. دراسة الميكانيكا النووي في الخلايا الحية سليمة تحافظ على بنية الخلايا العادية والابتعاد عن القطع الأثرية المحتملة التي يمكن أن تنشأ عند العمل مع نواة معزولة. علاوة على ذلك ، الركيزة تطبيق سلالة يقدم نموذجا جيدا للإجهاد الفسيولوجية التي تعيشها الخلايا في العضلات أو الأنسجة الأخرى (، وعائي مثل خلايا العضلات الملساء المعرضة للإجهاد السفينة). أخيرا ، في حين وضعت هذه الأدوات بشكل أساسي لدراسة الميكانيكا النووية ، ويمكن أيضا أن تطبق على التحقيق وظيفة من البروتينات ويشير هيكل الخلية mechanotransduction.

Protocol

1. الركيزة سلالة التطبيق

قياس الضغط النووية تطبيع يتضمن إعداد أطباق السلالة مع شفافة ، أغشية السيليكون المرنة والثقافة سطح الخلية ، والطلاء الخلايا على الأطباق ، والحصول على الصور من الخلايا قبل وأثناء وبعد تطبيق سلالة (أحادي المحور أو ثنائي المحور).

إعداد أطباق غشاء السيليكون والالتزام من الخلايا

  1. السلالة كل طبق يتكون من صحن مخصص صنع البلاستيك قعر التي يبلغ قطرها 3 "والبلاستيك يا الدائري لعقد غشاء السيليكون ، والتي هي بمثابة الخلية ركيزة الثقافة. لإعداد أطباق السلالة ، المشبك 4" س 4 "قطعة من الغشاء بين سيليكون يا الدائري والطبق. قطع بعناية بعيدا الغشاء الزائدة ، وشطف مع الماء منزوع الأيونات ، وتعقيم الأطباق السلالة.
  2. علامة نقطة مرجعية في وسط الجزء السفلي من الغشاء (في الخارج) قبل طلاء الأغشية مع جزيئات السيليكون المصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال ، فبرونيكتين). وسوف تساعد في تحديد هذه المعالم الخلايا نفسها خلال التجارب السلالة. (اختياري : للحصول على سلالة تطبيق أحادي المحور ، يتم تطبيق two متوازية من الشريط سكوتش حول نقطة مرجعية لتقييد تشوه الغشاء في بعد واحد).
  3. الأمثل لتوفير مرفق الخلية ، ومعطف الأغشية السيليكون مع فبرونيكتين ميكروغرام / مل 3 مخففة في برنامج تلفزيوني مل 10 أو أي مناسبة من البروتينات المصفوفة خارج الخلية. تغطية صحن مع سلالة طبق 10cm البوليسترين المقلوب ، واحتضان الأطباق طوال الليل في 4 درجات مئوية.
  4. في اليوم التالي ، وشطف الأغشية مرة واحدة مع الفوسفات التخزين المؤقت المالحة (PBS) لإزالة البروتين الزائد. ملء الطبق مع 10ML متوسطة النمو (في التعديل Dulbecco النسور متوسطة (الجلوكوز عالية) تستكمل مع مصل بقري جنيني 10 ٪ و 1 ٪ البنسلين الستربتوميسين /) وتوضع جانبا.
  5. وtrypsinized الليفية الماوس الجنينية مع التربسين 0.05 ٪ ، والمصنف في النمو في المتوسط ​​حوالي 30 ٪ التقاء على طبق من السيليكون الغشاء المغلفة واحتضان لمدة 24 -- 48 ساعة في ظل ظروف طبيعية الثقافة.

الركيزة التجارب السلالة

  1. انشاء المجهر لإجراء التجارب. وتجرى التجارب على مجهر مقلوب مع كاميرا رقمية مناسبة للفحص المجهري مضان ، على النقيض من المرحلة أو مدينة دبي للإنترنت ، وذلك باستخدام الهدف 60x البرمجيات المناسبة والحصول على الصور (على سبيل المثال ، أو IPLab Metamorph). مجهر تستقيم غير مناسب لهذا التطبيق. الجهاز يتكون من سلالة طبق القاعدة التي تناسبها على خشبة المسرح المجهر ويحمل قرص الطابعة المركزية اسطوانية الذي يخدم لتطبيق الضغط على القسم المركزي للغشاء السيليكون ، لوحة المنقولة التي يحمل الطبق سلالة والتي يمكن أن الانزلاق صعودا ونزولا على دبابيس التوجيه الأربعة ، فضلا عن لوحة الوزن 5 باوند لتطبيق الحمولة.
  2. من أجل تصور النوى ، احتضان الخلايا في الطبق مع سلالة 1 ميكروغرام / مل من هويشت 33342 لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. نضح قبالة المتوسطة واستبدالها مع 15 مل من الفينول الحمراء المتوسطة النمو الحر (متوسطة الفينول الحمراء مجانا Dulbecco النسور في التعديل (الجلوكوز عالية) مع Hepes 25 مم ، على أن تستكمل مع مصل بقري جنيني 10 ٪ و 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين). المسمار الطبق السلالة في صحن لوحة الحامل. تطبق بعناية الشحوم (Braycote الشحوم فراغ 804) إلى محيط الجزء السفلي للغشاء السيليكون لضمان مزلق للغشاء على قرص الطابعة المركزية. تأكد للحفاظ على القسم المركزي للغشاء واضحة.
  3. وضع لوحة على خشبة المسرح قاعدة المجهر. جبل لوحة حامل الطبق بعناية على اللوحة الأساسية. أؤكد أن يستريح في موقف الأولية ، وغشاء السيليكون من سلالة طبق فضفاضة تقع على قرص الطابعة المركزية.
  4. أولا ، التركيز على الجزء السفلي للغشاء السيليكون والعثور على نقطة مرجعية مركزية سوداء. النقطة سوف تكون بمثابة نقطة انطلاق لجميع الصور والمقتنيات يساعد في تحديد موقع الخلايا نفسها أثناء وبعد تمدد الجلد. نستخدم عادة مكتوبة بخط برنامج التصوير الآلي لتخزين وظائف الخلايا ونقل هذه الخلايا خلال التجربة ، ولكن يمكن أيضا أن يتحقق هذا يدويا.
  5. بدءا من النقطة ، وضبط التركيز على تصور الخلايا والجزء العلوي من غشاء السيليكون. موقع جيد مع انتشار الخلايا نوى موقعا مركزيا والحصول على النقيض من مرحلة وصورة مضان من هويشت النووية وصمة عار. ينبغي صورة النقيض مرحلة التركيز على مخطط الخلية وغشاء السيليكون ، في حين أن الصور مضان ينبغي أن تركز على متن الطائرة المركزية للنواة.
  6. بعد الحصول على الصور من 5 إلى 15 الخلايا ، والعودة إلى النقطة المركزية. تطبق ببطء وزنا لسلالة الطبق ، مما أدى في التطبيق سلالة موحدة في وسط الطبق. يقتصر القصوى سلالة الركيزة التي تطبقها الفواصل النايلون وضعت على دبابيس المحاذاة العمودية (دبابيس التوجيه).
  7. التركيز على الجزء السفلي للغشاء السيليكون وتحديد النقطة المرجعية مرة أخرى. ابتداء مننقطة ، نقل الخلايا نفسها مرة أخرى والحصول على النقيض من مرحلة وصورة مضان للخلايا ونوى تحت ضغط كامل ، في محاولة لمواكبة عن كثب لطائرات التنسيق من الصور الأولية. ينبغي لهذه العملية لا تتجاوز 10 دقيقة لتجنب إعادة عرض نشطة وتكييف الخلية إلى الركيزة متوترة.
  8. بعد أن تم الحصول على جميع الصور المقابلة ، نقل مجهر مرحلة العودة إلى نقطة البداية. إزالة بعناية الوزن من صحن حامل لوحة ، والسماح للغشاء السيليكون للاسترخاء. إذا لزم الأمر ، ودفع برفق الطبق سلالة حتى في الموضع الأولي. ثم الحصول على النقيض من مرحلة والصور مضان من الخلايا بعد الضغط على النحو الموصوف أعلاه للصور التوتر.

تحليل

  1. ويتم تحليل الصور من الخلايا والنواة fluorescently المسمى قبل وأثناء وبعد تطبيق الضغط لحساب سلالة تطبيع النووية. في المختبر لدينا ، ونحن نستخدم برنامج نصي مخصص MATLAB مكتوب للتحليل ، ولكن العديد من الخيارات البديلة المتاحة. يتم إجراء التحليل في ثلاث خطوات.
  2. أولا ، لحساب سلالة الركيزة التطبيقية ، وتتم مطابقة يدويا مواقع نقاط المراقبة 3-6 تقع على غشاء بين المقابلة قبل ، كامل ، وصور ما بعد الإجهاد و. برنامج MATLAB يحسب ثم سلالة غشاء تطبيق بمقارنة مواقف مطابقة نقاط مراقبة بين الصور قبل سلالة والكامل ، وأيضا سلالة من السلالة المتبقية بين سلالة قبل وبعد الصور السلالة. في الوقت نفسه ، يتم استخدام نقاط مراقبة لتسجيل صورة أزواج ، والتي سوف تساعد على الكشف عن خلية التالفة أو فصل (انظر الشكل 1).
  3. في خطوة ثانية ، ويتم اختيار النواة يدويا باستخدام برنامج MATLAB منفصلة يحسب سلالة النووية لكل نواة الفردية إما مطابقة حجم النووية أو علامات المطابقة بين intranuclear قبل ، كامل ، وصور ما بعد الإجهاد والفلورسنت. لمراعاة الاختلافات الصغيرة في الغشاء سلالة تطبيقها بين التجارب المختلفة ، ونحن نعرب عن النتائج على النحو سلالة تطبيع النووية ، الذي يعرف بأنه نسبة من سلالة النووية المستحثة لسلالة غشاء التطبيقية التي يتم حسابها لكل نواة. MATLAB النصوص المتوفرة من المختبرات Lammerding بناء على طلبها.
  4. أخيرا ، يتم التحقق من صحة كل نواة ، باستثناء قياسات من الخلايا التي تصبح فصل أو تضررت خلال تطبيق سلالة (الشكل 1).

2. Microneedle التلاعب مقايسة

إعداد الأطباق ، والخلايا الملتصقة ، وmicroneedles

  1. احتضان 35 مم أسفل الزجاج أطباق زراعة الخلايا مع تركيز منخفض من فبرونيكتين (0.5ug/ml) في المؤسسة العامة لتحلية هانك في سولت التخزين المؤقت (HBSS) أو أي مناسبة من البروتينات المصفوفة خارج الخلية لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. غسل الأطباق مرتين مع HBSS وإضافة 2 مل من المتوسط ​​لنمو طبق قبل الانتقال الى الخطوة التالية.
  2. وtrypsinized الليفية الماوس الجنينية مع التربسين 0.05 ٪ ، والمصنف في 2 مل متوسطة النمو المصنف في الخلايا × 7.5 4 10 / مل على الأطباق الزجاجية أسفل فبرونيكتين المغلفة. مرة أخرى في مكان الخلايا الحاضنة بين عشية وضحاها. مرة أخرى في مكان الخلايا الحاضنة بين عشية وضحاها. ينبغي للمرء أن تحسين عدد من الخلايا للحصول ، ملتصق واحد ، غير متلاقية الخلايا لأنواع الخلايا الأخرى.
  3. سحب microneedles ، مصنوعة من شعيرات البورسليكات ، وغيض من أقطار حوالي 1-3 ميكرون مع مجتذب ماصة التجاري (على سبيل المثال ، شركة سوتر الصك).

Microneedle التلاعب التجربة

  1. في اليوم التالي ، مع احتضان خلايا الميتوكوندريا MitoTracker صمة عار (600 ميكرومتر ؛ Invitrogen) وصمة عار هويشت 33342 النووية (1 ميكروغرام / مل) إضافة إلى النمو المتوسط ​​لمدة 30 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  2. غسل الخلايا في وقت واحد HBSS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم تضيف الفينول الحمراء المتوسطة النمو الحر إلى خلايا للتصوير.
  3. الحصول على صورة واحدة من خلية واحدة دون microneedle إدراجها في الهيكل الخلوي في مرحلة المقابل ، صورة واحدة للصورة الفلورسنت هويشت 33342 الفلورسنت وصمة عار واحدة من الميتوكوندريا وصمة عار ، مع هدف 60x (0.70 NA ، بخطة أعمى الألوان) على المقلوب المجهر مع الكاميرا الرقمية الجهاز المسؤول عن جانب.
  4. باستخدام micromanipulator (على سبيل المثال ، InjectMan NI 2 ، إيبندورف) ، تدرج بعناية microneedle في السيتوبلازم من خلية مسافة محددة (عادة 5 ميكرون) بعيدا عن محيط النووية واتخاذ صورة واحدة على النقيض المرحلة ، صورة واحدة من الفلورسنت هويشت 33342 وصمة عار وصورة واحدة من الفلورسنت وصمة الميتوكوندريا. لهذا التطبيق ، فإنه يساعد على السيطرة على micromanipulator من خلال جهاز كمبيوتر ، على سبيل المثال ، ويندوز برنامج Hyperterminal ، لتحقيق المجهرية إجراءات متسقة.
  5. نقل microneedle ، على مسافة محددة (عادة 10 أو 20 ميكرون) باتجاه محيط الخلية حتى 1 ميكرون / ثانية في حين جمع في وقت واحد على النقيض من الصور ومضان كل مرحلة 10ثواني. كما microneedle يتحرك إلى مسافة محددة نحو هامش الخلية. مع المعلمات المختارة ، كما microneedle يتحرك لمسافة محددة تجاه محيط الخلية ، وهذا يتوافق مع الأطر 2-3 خلال عملية التلاعب.
  6. اخيرا الحصول على صور إضافية بعد إزالة microneedle من الهيكل الخلوي.

تحليل

  1. يتم حسابها باستخدام خرائط والتشريد النصي MATLAB مخصصة مكتوبة على أساس تتبع ملامح fluorescently المسمى من النواة والسيتوبلازم. (السيناريو MATLAB يتوفر من المختبر Lammerding عند الطلب). البرنامج يستخدم تطبيع عبر الارتباط بين المناطق الخوارزمية صورة صغيرة (حوالي 10 ميكرومتر × 10 ميكرون في الحجم ومتباعدة 5 ميكرون وبصرف النظر) في إطارات الصور اللاحقة. لكل مركز المنطقة ، والتشرد في وحسابها س ص والاتجاهات حيث أن التحول بين الموقع الأصلي والموقف التي تم تشخيصها حديثا وعرضها كناقل التشريد وتخزينها أيضا القيم العددية. من خرائط والتشريد ، ويمكن حسابها متوسط ​​نزوح داخل المناطق المحددة مسبقا. علما بأن تقوم تشريد هيكل الخلية على قناة مضان للعلامات هيكل الخلية (على سبيل المثال ، MitoTracker الميتوكوندريا وصمة عار) ، في حين يتم احتساب التشريد النووية من قناة مضان المقابلة للإشارة هويشت 33342. للتطبيق لدينا ، ونحن فحص روتيني في المناطق التالية : (ط) في هيكل الخلية السلالة سلالة موقع التطبيق ، أي في موقع الإدراج microneedle ، (ب) سلالة النووية في منطقة داخل نواة نحو سلالة موقع التطبيق ؛ (ج) النووية توتر في منطقة النووية بعيدا عن موقع التطبيق ؛ و (رابعا) سلالة هيكل الخلية في المنطقة عبر هيولي النواة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء أيضا قياس استطالة مباشرة على النقيض من المرحلة النووية أو هويشت صورة متواليات مضان 33342. في هذه الحالة ، تطبق يحسب سلالة النووية بقسمة الاستطالة النووي (ΔL = L -- L 0) بواسطة طول الأولي ، L 0 ، حيث L هو الطول النهائي للنواة في نهاية تطبيق سلالة ولام 0 هو الأولي طول النواة. للخلايا مع اقتران نكليوتيد ، هيكل الخلية سليمة ، فإن نواة استطال نحو سلالة موقع التطبيق. في المقابل ، في الخلايا التي تعطل نكليوتيد - اقتران هيكل الخلية ، أي تنتقل قوات أقل كفاءة بين الهيكل الخلوي والنواة ، فمن المتوقع أن نواة لإطالة أقل بشكل ملحوظ في اتجاه الضغط موقع التطبيق. وبالتالي ، انخفضت التشوهات النووية ردا على تطبيق هيكل الخلية سلالة تنطوي على uncoupling (الجزئي) بين النواة والهيكل الخلوي.

3. ممثل النتائج :

الركيزة سلالة التطبيق

حصلنا على الصور قبل وأثناء وبعد التطبيق لسلالة الخلايا الليفية الماوس الجنينية من امين متخالف ومتماثل A / C - ناقص (Lmna + / -- وLmna -- / --) ، والبرية من نوع (Lmna + / +) والفئران في وقت لاحق حسابها سلالة تطبيع النووية لكل خلية. بعد التحليل ، ويتم التحقق من صحة ونوى الخلايا التي يتم استبعاد تلف أو التراجع خلال تطبيق سلالة من التحليل. يصور الشكل 1A نوى ثلاث خلايا صالحة ، في حين يصور الشكل 1B الخلايا التي ينبغي استبعادها من التحليل. ويتم تجميع البيانات تطبيع النووية من سلالة لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة (يتضمن كل القياسات من نوى ~ 5-10) ، وبالمقارنة مع خلية أخرى أو مجموعات العلاج عن طريق التحليل الإحصائي. زيادة التوتر النووي تطبيع يشير انخفاض صلابة النووية ، كما رأينا في الخلايا مع خفض التعبير من البروتينات المغلف النووية لامين A / C (الشكل 2).

Microneedle التلاعب مقايسة

لمقايسة التلاعب microneedle ، التقط نحن النووية وتشريد هيكل الخلية خلال تطبيق سلالة محلية هيكل الخلية. يتم استبعاد الخلايا التالفة أو التي تصبح بعيدة عن التحليل. للتحليل ، نقيس حجم الحركات النووية وهيكل الخلية نحو التطبيق في موقع قوة الخلايا ، واحدة ملتصقة. على سبيل المثال ، في الشكل 3 ، ونحن المسار الميتوكوندريا (علامة للحصول على الهيكل الخلوي) قبل وبعد التهجير سلالة هيكل الخلية ثم مؤامرة التهجير والنواقل. كل متجه يمثل النزوح حسابها حيث أن التحول بين الموقع الأصلي والموقف التي تم تشخيصها حديثا. يتم استبعاد المناطق ذات الكثافة المنخفضة صورة أو مادة غير كافية (على سبيل المثال ، مناطق خارج الخلية) من التحليل. وكميا ثم تشريد هيكل الخلية والطاقة النووية في مجالات منتقاة على مسافات متزايدة من سلالة موقع التطبيق (الشكل رقم 4 ، والمناطق المقابلة لبو الملونةxes في الشكل). في الخلايا الليفية الماوس الجنينية مع اقتران نكليوتيد ، هيكل الخلية سليمة ، وتنتقل عبر الخلايا القوات بأكملها ، مما يتسبب في تشوهات النووية وهيكل الخلية التي تبدد ببطء بعيدا عن سلالة موقع التطبيق (الشكل 4). في المقابل ، مع اقتران الليفية نكليوتيد - بالانزعاج هيكل الخلية (أو المنظمة غيرت هيكل الخلية) عرض التشريد المترجمة بالقرب من موقع التطبيق ، كما هو مبين في الشكل (4) والتشوهات الناجمة عن القليل فقط بعيدا. ويلاحظ مقارنة تطبيق سلالة هيكل الخلية في موقع الإدراج microneedle (البرتقال مربع) لكل من الخلايا الليفية التحكم (mCherry حدها) ، والخلايا الليفية مع اقتران نكليوتيد ، هيكل الخلية تعطلت (DN كاش). ومع ذلك ، كانت بفعل النزوح النووية وهيكل الخلية (أزرق ، أصفر ، أحمر ومربعات) في مناطق أخرى أصغر بكثير في الخلايا الليفية مع اقتران نكليوتيد - الهيكل الخلوي تتعطل (DN كاش) من التحكم في الخلايا (mCherry وحدها) (الشكل 4). وبالتالي ، انخفاض في هيكل الخلية وتشريد النووية بعيدا عن التوتر موقع التطبيق ، تشير إلى أنه تم نقل بالانزعاج القوة بين الهيكل الخلوي والنواة.

الأهم من ذلك ، ونحن ايضا التحقق من ان هيكل الخلية الميتوكوندريا هي علامة مناسبة ، عن طريق إجراء microneedle التلاعب في الخلايا الليفية الماوس الجنينية transfected مع GFP أو أكتين mCherry وGFP vimentin وfluorescently المسمى مع الأخضر أو ​​الأحمر Mitotracker. حسبت خرائط والتشريد بشكل مستقل عن هيكل الخلية إشارة الفلورسنت من الميتوكوندريا والهيكل الخلوي الأكتين أو vimentin. تم حساب متوسط ​​تشريد المطلق لأربع مناطق متميزة في هيكل الخلية زيادة المسافات بعيدا عن سلالة موقع التطبيق. حسبت القيم المنحدر وR - المربعة من الانحدار الخطي بين القياسات التي تم الحصول عليها من والميتوكوندريا من الأكتين أو vimentin ، على التوالي. لأكتين ، والمنحدر 0.99 وكانت قيمة 2 R 0.986 ؛ لvimentin ، المنحدر كان 1.04 وقيمة R2 كان 0،971 ، مؤكدا أن النزوح الميتوكوندريا بمثابة مؤشرات موثوقة لتشوهات هيكل الخلية.

الشكل 1
الشكل 1. وقد التقط الركيزة تطبيق الضغط على الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs). الليفية الماوس الجنينية موزعة على منطقتين منفصلتين على النقيض من غشاء السليكون مع المرحلة ومضان المجهري قبل وأثناء وبعد تطبيق الضغط أحادي المحور 20 ٪. (أ) مثال لتجربة ناجحة مع نواة صالحة من الخلايا التي نجت من سلالة دون تطبيق أي ضرر أو انفصال و (ب) مثال على الخلايا التي تسحب / فصل جزئيا خلال تطبيق سلالة ؛ النتائج من الخلايا صورت في (ب) تستثنى من التحليل. في (B) ، الخلية على الجانب الأيسر يظهر علامات للتلف وانهيار هيكل الخلية النووية (السهم) ، في حين أن الخلية على الجانب الأيمن يفصل جزئيا وتتراجع خلال تطبيق السلالة. وهذا يمكن أن يكون مؤشرا لتطبيق إجهاد مفرط. من أجل تحسين المقارنة ، في (أ) و (B) ويرد على الحدود واحد من غير المتمدد في أغشية الخلايا الحمراء وفرضه على نفس الخلية أثناء وبعد تطبيق السلالة. في الفقرة (أ) هي الخطوط العريضة لحدود نواة غير المتمدد في الخضراء وفرضه على نفسه النواة أثناء وبعد تطبيق السلالة.

الشكل 2
الشكل 2. تحليل سلالة النووية في لوحة طبيعية من مختلف خطوط الخلايا MEF MEFs من Lmna -- / -- وLmna + / -- التعبير عن الخلفية الوراثية ectopically إما فارغة أو ناقل لامين من النوع البري وقد تم تحليل. مقارنة MEFs من البرية من نوع تتزاحم (Lmna + / +) ، وفقدان لامين تعبير C / النتائج في تصلب النووية انخفض أنه يمكن استعادة كامل من انبعاث ألف لامين من النوع البري على وجه الخصوص ، وانخفاض تصلب النووية التي تعكسها زيادة قيم الضغط تطبيع النووية. أشرطة الخطأ تمثل أخطاء القياسية.

الشكل 3
الشكل 3. Microneedle التلاعب مقايسة لقياس الخلايا انتقال القوة. النقيض من المرحلة (أ ، ب) ومضان (C ، D) لوحات من الخلايا الليفية المسمى مع النووية (الأزرق) وصمة عار وصمة عار MitoTracker الميتوكوندريا (الخضراء). أدرجت في الهيكل الخلوي microneedle على مسافة محددة من النواة (A و C) ، وانتقلت لاحقا في اتجاه المحيط الخلية (B ، D). وتم قياس كمية تشريد هيكل الخلية والنووية من خلال تتبع النواة والميتوكوندريا fluorescently المسمى به العرف مكتوب عبر الارتباط الخوارزمية. (E) خريطة المهجرين من هيكل الخلية النهائي (الأخضر) التشوهات حسابها من سلسلة صورة مضان ، ويضاعف طول السهم 2X لتحسين visibility. أشرطة النطاق ، 10 ميكرومتر.

الشكل 4
الشكل 4. تحليل انتقال قوة الخلايا خلال التلاعب microneedle. المستحثة تشريد هيكل الخلية والنووية خلال التلاعب microneedle ، وتقاس في المناطق المقابلة لمربعات ملونة (أقحم في A). المربع البرتقالي هو موقع التطبيق السلالة. على الرغم من تطبيق سلالة مماثلة في الهيكل الخلوي (البرتقال مربع) ، وبفعل التهجير النووية وهيكل الخلية (أزرق ، أصفر ، أحمر ومربعات) أصغر بكثير في الخلايا الليفية الماوس الجنينية التي تعطلت مع هيكل الخلية نكليوتيد - اقتران (DN كاش) مقابل السيطرة ( mCherry وحدها) الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الركيزة سلالة مقايسة

وقد تم تطبيق سلالة استخدمت بنجاح من قبلنا وجماعات أخرى لدراسة التشوهات الناجمة النووي في الخلايا تتعرض لإجهاد ميكانيكي والتحقيق مساهمة محددة البروتينات المغلف النووية لتصلب النووية. 4-8 الاستفادة من هذه التقنية هو أنه تحقيقات الخواص الميكانيكية العيش في بيئة طبيعية نوى بهم الخلوية وهيكل الخلية ، وبأن تطبيق سلالة تمثل الركيزة الفسيولوجية تحميل التطبيق كما هو موجود في العديد من الأنسجة مثل العضلات المتعاقدة أو جدران الأوعية الدموية. 9 وعلاوة على ذلك ، فإنه يمكن تطبيق الضغط على العديد من الخلايا في موازاة ذلك ، زيادة عدد من الخلايا التي يمكن تحليلها في تجربة واحدة. واحد الحد من الركيزة مقايسة سلالة هو أنه لا يسمح قياسات مباشرة لتصلب النووية. بدلا من ذلك ، هذا الأسلوب يحدد صلابة النسبي للنواة مقارنة مع الهيكل الخلوي المحيطة بها. تحليل مفصل لليسببها سلالة النووية وهيكل الخلية في الخلايا تتعرض لأحادي المحور الركيزة تظهر السلالة التي في البرية من نوع الخلايا ، سلالة هيكل الخلية هي مماثلة لسلالة الركيزة تطبيقها ، في حين أن صلابة النواة بتشوهات أقل بشكل ملحوظ. 4 ومع ذلك ، فإن فحوصات إضافية ، مثل في مقايسة التلاعب microneedle ، قد يكون من الضروري أن نؤكد أن الاختلافات التي لوحظت في تشوه النووية بين خطوط مختلفة من الخلايا ليست هي نتائج اقتران نكليوتيد هيكل الخلية ، أو تغيير هيكل هيكل الخلية. على الرغم من هذه القيود ، وقياس ميكانيكا النووي في خلايا سليمة بدلا من عزل نواة يقلل من خطر الآثار الناجمة عن آثار ناضح ، والضرر أثناء إجراء العزل ، أو التغييرات الأخرى المرتبطة العزلة النووية. ومع ذلك ، واحدة المتطلبات الصارمة للمقايسة الركيزة سلالة هو أن الخلايا تتمسك بشدة الركيزة. لتحسين الالتصاق الخلوية ، يمكن أن تكون مغلفة الأطباق مع مختلف البروتينات المصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين ، أو فبرونيكتين laminin بتركيزات متغير ، ونحن نوصي تحديد شروط طلاء الأمثل لكل نوع من الخلايا الجديدة المستخدمة في التجارب.

علاوة على ذلك ، من أجل تحقيق النتائج المثلى ، يجب أن تطبق سلالة الركيزة تكون كبيرة بما يكفي للكشف عن التشوهات النووية مع التقليل من الأضرار التي لحقت الخلايا. عن الماوس والخلايا الليفية الإنسان ، ونحن نطبق عادة سلالة ذو محورين 5 ٪ أو 20 ٪ سلالة أحادي المحور دون تلف الخلايا علني. بصفة عامة ، نجد أن الخلايا تحمل أحادي المحور تطبيق سلالة أفضل من سلالة تطبيق ذو محورين ، كما هو مطلوب أصغر التغيرات في منطقة الغشاء. أما بالنسبة لطلاء المصفوفة خارج الخلية ، ينبغي تحديد الشروط المثلى لتطبيق سلالة لكل خط الخلية الجديدة التي سيتم اختبارها.

بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن تجارب حساسة لكثافة الخلية. وينبغي أن يكون مثاليا التجارب التي أجريت على خلايا متكدسة الفرعي لتقليل التفاعلات خلية خلية ، ولكن كثافة الخلايا التي تكون منخفضة جدا في كثير من الأحيان نتيجة بقاء الفقراء من الخلايا استجابة لضغط شديد ، والعائد المنخفض في الخلايا في التجارب. من ناحية أخرى ، كثافة الخلية التي هي مرتفعة جدا يجعل من الصعب التعرف على الخلايا نفسها قبل وأثناء وبعد تطبيق السلالة. نوصي الأمثل لاختبار كثافة الخلايا لأنواع الخلايا الفردية.

آخر نصيحة هامة للتجارب هو أنه ينبغي أن يقتصر تطبيق السلالة إلى 10 دقيقة أو أقل لتجنب التكيف الخلوية ، مثل إعادة تشكيل هيكل الخلية من العناصر. تحقيقا لهذه الغاية ، واستخدام برامج التصوير الآلي ، على سبيل المثال IPlab ، بالاشتراك مع مرحلة بمحركات تمكن التلقائي إعادة توطين الخلايا على الطبق سلالة وأسرع الحصول على الصور. وعلاوة على ذلك ، ونحن نستخدم برامج مخصصة الخطية تحليل الصور (مثل MATLAB) لتحليل البيانات. ويتطلب البرنامج نقطة علامة معينة على غشاء لحساب سلالة الركيزة التطبيقية ، مثل دوت التطبيقية ، الخرز الفلورسنت الصغيرة أو مخالفات واضحة على غشاء السيليكون. أخيرا ، مطلوب التحقق من صحة كل نواة لاستبعاد تلك الخلايا التالفة أو التراجع ، كما التشوهات النووية تقاس في هذه الخلايا ليست تمثيلية. والتكيف الممكنة من سلالة الركيزة التقنية هو تطبيق الركيزة لسلالة الخلايا المستزرعة في المواد الهلامية الكولاجين ثلاثي الأبعاد ، والذي يسمح تحليل الخصائص الميكانيكية نووية تحت ظروف أكثر الفسيولوجية ، وكذلك لتطبيق أسلوب ضعيف لمزيد من الخلايا الملتصقة. اختلاف آخر هو استخدام ركائز micropatterned ، والبقع على سبيل المثال ، مستديرة أو مستطيلة من فبرونيكتين على غشاء السيليكون ، لتحقيق انتشار الخلايا متناسقة والمحاذاة خلال تطبيق السلالة. أخيرا ، من أجل فهم أفضل الميكانيكا النووي على مستوى أكثر الفسيولوجية ، يمكن تطبيقها على الأنسجة الخلوية سلالة بأكملها بدلا من خلايا منعزلة. نحن حاليا بنجاح باستخدام هذه التقنية لقياس صلابة النووية في نموذج ORGAnisms مثل melanogaster ذبابة الفاكهة أو ايليجانس انواع معينة.

Microneedle التلاعب مقايسة

في مقايسة microneedle التلاعب هو واحد الخلية المستندة إلى طريقة لتحقيق انتقال الخلايا عن طريق قياس قوة بفعل النزوح النووية وهيكل الخلية بعد تطبيق سلالة محلية هيكل الخلية ، وبالتالي المضي قدما في وقت سابق من هذا النهج رائدها Maniotis وزملاؤه 10 هذه التقنية توفر العديد من المزايا الأخرى على القوة المترجمة أساليب تطبيق مثل ملاقط المغناطيسي أو الفخاخ البصرية. على سبيل المثال ، يمكن تطبيق سلالة مباشرة إلى الهيكل الخلوي ويمكن تعديل متفاوتة المسافة من microneedle. يمكن أيضا أن يكون microneedle المتمركزة في زنزانة مع دقة عالية ، مما يجعل تجربة استنساخ للغاية ، ويمكن أن يكون معدل الطلب القوة ، التي ترتبط مباشرة إلى سرعة microneedle ، التي تسيطر عليها بدقة من قبل micromanipulator المبرمجة. في المقابل ، غالبا ما تكون حبات المغناطيسية المستخدمة في منتاش المغناطيسي والفخاخ البصرية المترجمة بشكل عشوائي على سطح الخلايا القمي ، وملاقط سواء البصرية والمغناطيسية قوات كافية لتوليد نتيجة التشوهات في هيكل الخلية الكبيرة الحجم في العديد من أنواع الخلايا. على الرغم من أن الفحص التلاعب microneedle هو أسلوب الغازية ، وهناك سيطرة محدودة على الهياكل التي تتمسك هيكل الخلية microneedle ل، يمكننا تأكيد النتائج مع نهج أقل الغازية (مثل سلالة الركيزة). وهكذا ، والتلاعب والضغط microneedle هما الركيزة المقايسات التكميلية التي تعطي معلومات حول ميكانيكا النووي في الخلايا الحية سليمة مع المحافظة على بنية طبيعية النووية والحفاظ على هيكل الخلية والتركيب الكيميائي الصحيح للnucleoplasm والسيتوبلازم.

في ما يلي ، نقترح التعديلات أو التحسينات الممكنة. إذا كنت جيدا انتشار الخلايا ، قد غيض microneedle كسر زجاج ضد الطبق السفلي عند محاولة وضعه ضمن الهيكل الخلوي (~ 1-2 ميكرومتر) رقيقة. لتجنب هذه المشاكل ، ونحن ننصح باختبار مجموعة من تركيزات الجزيئات خارج الخلية (ECM) مصفوفة مثل فبرونيكتين ، والكولاجين ، أو laminin ، لتحديد الشروط التي تحقق ما يكفي من خلية التصاق الخلايا دون السماح لانتشار رقيقة جدا. يمكن أن يكون آخر تعديل لوحة الخلايا على الأسطح المطلية ECM - micropatterned موحدة لضمان انتشار الخلايا وتوجيهها. ويمكن اتباع نهج إضافية أو تكميلية لتكون الخلايا لوحة على المواد الهلامية بولي أكريلاميد ECM المغلفة وإدراج microneedle من خلال الهيكل الخلوي في هلام لتوفير الزي السلالة عبر تطبيق الهيكل الخلوي. استخدام لmicroneedle سليمة والغرامة ، يميل ضروري للغاية لنجاح التجارب. نحن سحب روتيني microneedles منطقتنا ، ويمكن للمرء أن التجربة مع مختلف الأشكال والأحجام. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أيضا شراء microneedles معبأة بشكل فردي مع هندسة متناسقة (على سبيل المثال ، إيبندورف Femtotips). في أي حال ، من المهم أن أؤكد أن يبقى microneedle التالفة خلال التجارب ، كبقشيش microneedle مكسورة ، على سبيل المثال بعد إجراء اتصالات مع الركيزة الزجاج ، وتلف الخلايا. أثناء الإجراء التلاعب microneedle نفسها ، فمن المهم تطبيق سرعة ثابتة ومجموعة من حركة microneedle ، باعتبارها النواة والهيكل الخلوي هي المواد اللزجة مع الوقت التي تعتمد على السلوك. نوصي باستخدام micromanipulator الكمبيوتر التي تسيطر عليها ، والتي سوف تساعد أيضا في تنسيق حركة microneedle والحصول على الصور. من تجربتنا ، يمكن Mitotracker بواسطة السامة للخلايا ، وبالتالي الحد من التجارب لمدة 30 دقيقة أو استخدام علامات الفلورسنت الأخرى ، مثل GFP - الأكتين أو GFP vimentin. واحد من تعديل النهج وصفها هنا ، وخاصة عندما يدرسون نكليوتيد - اقتران هيكل الخلية ، هو إدراج microneedle في النواة بدلا من الهيكل الخلوي وتحريكه باتجاه محيط الخلية.

لجميع الدراسات ، وذلك بسبب تقلب الخلية الى خلية كبيرة عادة ، ينبغي إجراء تجارب على الأقل ثلاث مرات للحصول على قياسات مستقلة من حد أدنى من مجموع خلايا صالحة 15-25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 R01 HL082792 وNS059348) وبريغهام ومستشفى النساء في مجموعة القيادة جائزة القلب والأوعية الدموية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin EMD Millipore FC010
MitoTracker Red FM and Green FM Invitrogen M22425 and M-7514
H–chst 33342 Invitrogen H3570
Hank’s Buffered Salt Saline Invitrogen 14185
Phenol free, DMEM Invitrogen 21063
Fetal bovine serum Aleken Biologicals FBSS500
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100ML
Borosilicate Glass with filament Sutter Instrument Co. BF100-78-10
Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005" Specialty Manufacturing Inc.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200
35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Braycote 804 Vacuum Grease SPI Supplies 05133A-AB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
  2. Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
  3. Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy. J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).
  4. Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate. Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).
  5. Lammerding, J. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).
  6. Lammerding, J. Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells. J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).
  7. Lammerding, J. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
  8. Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors. Aging Cell. 7, 383-393 (2008).
  9. Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488, 459-469 (1995).
  10. Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics