Quantificação e análise da formação de HO-endonuclease Stimulated translocações cromossômicas por Strand Único Annealing em Saccharomyces cerevisiae

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Summary

O ensaio de translocação HO-estimulado monitores vertente única de recozimento após a criação do DNA dupla fita-breaks em loci múltiplos em diplóides

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Liddell, L., Manthey, G., Pannunzio, N., Bailis, A. Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (55), e3150, doi:10.3791/3150 (2011).

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Abstract

Variação genética é freqüentemente mediada por rearranjos genômicos que surgem através da interação entre elementos repetitivos dispersos presente em cada genoma eucariótico. Este processo é um mecanismo importante para a geração de diversidade entre e dentro dos organismos 1-3. O genoma humano consiste em aproximadamente 40% repetitiva seqüência de origem retrotransposon, incluindo uma variedade de linhas e Sines 4. Eventos de intercâmbio entre esses elementos repetitivos podem levar a rearranjos do genoma, incluindo translocações, que podem perturbar dosagem do gene e expressão que pode resultar em doenças auto-imunes e cardiovasculares 5, bem como o câncer em seres humanos 6-9.

Intercâmbio entre elementos repetitivos ocorre em uma variedade de maneiras. Intercâmbio entre as seqüências que compartilham homologia (ou quase perfeita) perfeito ocorre por um processo chamado recombinação homóloga (HR). Por outro lado, não homólogos final juntar (NHEJ) usa pouco-ou-não homologia de seqüência para a troca de 10,11. O objetivo principal do HR, em células mitóticas, é reparar quebras das fitas duplas (LAP) gerados endogenamente pela replicação do DNA aberrante e lesões oxidativas, ou por exposição à radiação ionizante (IR), e outros agentes nocivos DNA exógeno.

No ensaio aqui descrito, LAP são simultaneamente criado fronteira com substratos de recombinação em dois diferentes loci cromossômicos em células diplóides por uma galactose induzível-HO-endonuclease (Figura 1). A reparação dos cromossomos quebrado gera translocações cromossômicas por único fio de recozimento (SSA), um processo no qual seqüências homólogas adjacentes às extremidades do cromossomo são covalentemente juntou subseqüente ao recozimento. Um dos substratos, his3-Δ3 ', contém uma 3' truncado HIS3 alelo e está localizado em uma cópia do cromossomo XV no locus HIS3 nativa. O segundo substrato, his3-Δ5 ', está localizado no locus LEU2 em uma cópia do cromossomo III, e contém um 5' truncado HIS3 alelo. Ambos os substratos são acompanhadas por um site de reconhecimento endonuclease HO que possam ser alvo de incisão por HO-endonuclease. Sites de endonuclease HO reconhecimento nativo ao locus MAT, em ambas as cópias do cromossomo III, foram suprimidos em todas as cepas. Isso evita que a interação entre os substratos de recombinação e outras extremidades dos cromossomas quebrados de interferir no ensaio. O KAN-MX-galactose marcada induzível HO-cassete de expressão endonuclease é inserida no locus TRP1 na IV cromossomo. A quota de substratos 311 bp e 60 pb da seqüência HIS3 de codificação que pode ser utilizado pela máquina de RH para a reparação por SSA. Células que usam estes substratos para reparar cromossomos quebrados por HR formar um alelo HIS3 intactas e uma TXV:: III translocação cromossômica que podem ser selecionados pela capacidade de crescer em meio sem histidina (Figura 2A). Freqüência de translocação por HR é calculado dividindo o número de colônias prototrophic histidina que surgem em meio seletivo pelo número total de células viáveis ​​que possam surgir após o plaqueamento diluições apropriadas em meio não selectivo (Figura 2B). Uma variedade de mutantes de reparo de DNA têm sido utilizados para estudar o controle genético da formação de translocação de SSA usando este sistema 12-14.

Protocol

1. HO-estimulado freqüências translocação

  1. Inocular 20/10 independentes 1 ml de culturas YPGly / Lac médio (1% extrato de levedura, peptona 2%, glicerol 3% e lactato de 3%) com colônias único do genótipo desejado. Incubar as culturas durante a noite, ou durante o tempo necessário para chegar a uma densidade celular de cerca de 5x10 7-1x10 8 células / ml, a 30 ° C em um rotador, ou com agitação suave.
  2. Adicionar galactose para as culturas para uma concentração final de 2% para induzir HO endonuclease-dirigido LAP no his3-Δ3 '(cromossomo III) e his3-Δ5' (cromossomo XV) substratos de translocação.
  3. Incubar durante 4 h, a 30 ° C em um rotador, ou com agitação suave.
  4. Após 4 h, placa diluições apropriadas das culturas em YPD (1% extrato de levedura, peptona 2%, dextrose 2%) para produzir cerca de 100 a 200 colônias por placa, e um número suficiente de células para histidina médio faltando para produzir um observável número de colônias Sua + recombinante. Incubar as placas a 30 ° C por 2-3 dias.

NOTA: Passo 1,4 descreve a determinação de freqüências de translocação em condições por plaqueamento seletivo para as culturas histidina falta médio. Este ensaio também pode ser realizado sob condições não-seletivo por plaqueamento culturas em YPD, em seguida, replica-plating as colônias que surgem onto-Seus pratos 2-3 dias depois. Esses métodos produzem freqüências semelhantes de translocação (Figura 2C).

  1. Determinar a freqüência de translocação pela divisão do número de colônias prototrophic histidina pelo número total de células viáveis ​​banhado (determinada por meio de diluições em placas YPD). Determinar a freqüência de translocação mediana e intervalo de confiança 95% 15.

2. Eficiências de chapeamento

  1. Retire uma alíquota de células de cada cultura durante a noite, e determinar o número de células por hemocitômetro count (Baxter Healthcare Corporation catolog #:. B3178-1).
  2. Placa de aproximadamente 100 a 200 células utilizando uma diluição adequada em YPD. Incubar por 2-3 dias a 30 ° C (por exemplo, para uma cultura com uma densidade celular de 1x10 8 células / ml, deve-se placa de 100-200 mL de uma diluição 10-5 por placa).
  3. Adicionar galactose 20% para as culturas para uma concentração final de 2%.
  4. Após 4 h, retire uma alíquota de células de cada cultura, determinar o número de células por contagem de hemocitômetro, e placa de aproximadamente 100 a 200 células utilizando uma diluição adequada em YPD. Incubar por 2-3 dias a 30 ° C.
  5. Determinar a eficiência plating pela divisão do número de colônias aparecendo em YPD pelo número de células banhado, e multiplicando este quociente por 100. Determinar a percentagem mediana, com um intervalo de confiança de 95%.

3. Blot genômico do Sul

  1. Selecione uma única colônia Sua + recombinante de cada um julgamento independente e preparar o DNA genômico 16.
  2. Digest aproximadamente 4 mg de DNA com endonuclease de restrição BamHI.
  3. BamHI separados digerida fragmentos em um gel de agarose 0,7%, e transferir para uma membrana de nylon com carga positiva (+ N Hybond, a GE Healthcare Código do Produto:. RPN303B) 17.
  4. Hibridizar com 32 sonda P-rotulados obtidos por priming random (Amersham Biosciences Código do Produto:. RPN1604) com um 1,8 kb clone BamHI / BamHI genômica contendo o gene HIS3.
  5. Visualize fragmentos de DNA por autoradiografia ou phosphorimaging.

4. Análise de cromossomos blot usando cromossomos separados em um contorno-fixada campo elétrico homogêneo (CHEF):

  1. Prepare cromossomos de selecionados recombinantes Sua + em plugs de agarose 18:
    • Crescer uma cultura líquido do seu candidato + TXV:: III cromossomo contendo recombinante em 5 ml de YPD para cerca de 1-2 x 10 8 células / ml.
    • Spin para baixo e lavar as células duas vezes com 50 mM EDTA.
    • Ressuspender as células em cerca de 200 mL de EDTA 50 mM, e aquecer a 50 ° C.
    • Adicionar um volume igual de fundição de 2% (w / v) baixo derreta agarose trouxe a 50 ° C, misturar bem.
    • Dispensar cerca de 80 alíquotas mL em moldes plug, e deixe esfriar por 30 min a 4 ° C.
    • Extrude plugs do molde em um prato de 12 também. Até cinco velas podem ser colocadas em cada poço.
    • Adicionar 3 ml de solução recém-preparada spheroplasting (14 mM 2-β-mercaptoetanol, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M Sorbitol) para cada poço. Incubar a 37 ° C por 4 horas com agitação suave.
    • Remoção da solução spheroplasting e substituir com 3 ml de solução de LDS (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) dodecil sulfato de lítio, regulávelt pH a 8,0). Incubar a 37 ° C por 15 min com agitação suave.
    • Remoção da solução de LDS e substituir com outra alíquota de 3 ml de LDS. Incubar a 37 ° C durante a noite com agitação suave.
    • Remover e substituir LDS com 3 ml de 0,2 X NDS (0,6 g Tris Base, 93 g EDTA dissódico di-hidratado, 5 g N-Lauroyl Sarcosine, ajustar o pH a 8.0, trouxe para 500 ml de dH 2 O). Incubar a temperatura ambiente por 30 min com agitação suave. Remover NDS, e repita duas vezes.
    • Remover e substituir NDS com 3 ml TE. Lavar com agitação suave durante 30 min à temperatura ambiente. Repita 4 vezes.
    • Loja plugs a 4 ° C em 2 ml de TE. Plugs pode manter por até um ano.
  2. Cromossomos separados em um gel 1% agarose usando um Bio-Rad aparelho CHEF-DRII menos 14 ° C (Catalog #: 170-3612).

Parâmetros: 1 º Bloco: 70 tempo switch, 15h às 6V/cm.
2 Bloco nd: interruptor de tempo 120s, 11h às 6V/cm

  1. Visualize os cromossomos através da coloração com brometo de etídio 1μg/ml por 30 min, irradiando com 60 mJ de UV em uma Stratalinker UV (Stratagene), e de coloração por 30 min em dH 2 O. Irradiando cromossomos brometo de etídio nicks manchou o DNA para permitir a transferência eficiente para a membrana.
  2. Transferência de cromossomos de uma membrana com carga positiva (+ N Hybond, a GE Healthcare Código do Produto:. RPN303B) por ação capilar em condições de desnaturação (0.4N NaOH, 1,5 M NaCl).
  3. Hibridizar com 32 sonda P-rotulados obtidos por priming random (Amersham Biosciences Código do Produto:. RPN1604) com um clone genômico 1,8 kb BamHI / BamHI contendo o gene HIS3 17.
  4. Visualize cromossomos por autoradiografia ou phosphorimaging.

5. Resultados representativos:

A representação gráfica do ensaio de translocação é representada no nível cromossômico (Figura 1). Um esquema do procedimento experimental também é exibido (Figura 2A). Pré e pós-indução eficiência revestimento são determinadas pela divisão do número total de células viáveis, formadoras de colónias pelo número total de corpos celulares na cultura determinada por hemocitômetro count (Figura 4B). Pré e pós-indução eficiência revestimento não foram significativamente diferentes para as células do tipo selvagem (p-valor = 0,1400) (Tabela 1).

Tabela 1
Tabela 1. Pré e pós-indução eficiência revestimento em células do tipo selvagem.

um número de corpos celulares por mililitro são determinadas pela contagem de hemocitômetro.
b O número de células viáveis ​​por mililitro são determinados por plaqueamento diluições apropriadas em meio não selectivo para produzir ~ 100-200 colônias.
c O pré e pós-indução eficiência revestimento são determinadas pela divisão do número total de viáveis, formadoras de colônia, as células pelo número total de corpos celulares na cultura, determinado pela contagem de hemocitômetro.

Isto sugere que a presença ou ausência de um cromossomo translocação não afeta a capacidade de sobreviver a formação de DSB. A freqüência de translocações cromossômicas pode ser calculado dividindo o número de colônias prototrophic histidina pelo número total de células viáveis ​​determinadas por plaqueamento em YPD (Figura 2B). Este ensaio pode ser realizado utilizando cepas do genótipo diferentes para identificar como a perda da função da proteína afeta SSA (ie rad51Δ - / -). Freqüências de recombinação determinado em diferentes linhagens podem ser traçadas para comparar as diferenças na capacidade dessas cepas para reparar o LAP HO-endonuclease induzida pela SSA (Figura 2C). Translocação freqüências obtidas com a cepa diplóide tipo selvagem em seletiva (2.2x10 -2) e não-seletiva (2.17x10 -2) condições não foram estatisticamente diferentes entre si (p-valor = 0,9131), enquanto as freqüências obtidas seletivamente translocação (6.0x10 -2) e não-seletiva (11.9x10 -2) com a rad51Δ - / - homozigoto foram semelhantes, mas estatisticamente diferentes (p = 0,0089). As freqüências obtidas tanto seletivamente (p = 0,0001) e não-seletiva (p = 0,0002), com o ° Rad51 - / - homozigoto foram estatisticamente diferentes daqueles obtidos com as respectivas condições com a cepa do tipo selvagem.

Putativa translocação de rolamento clones pode ser examinado por Southern blot e análise genômica blot cromossômicas (Figura 3). Para a análise do Sul, o DNA genômico é digerido com BamHI endonuclease antes de eletroforese em gel de agarose, blotting e hibridação para um 32P-rotulados 1.8kb sonda HIS3 para visualizar o diagnóstico 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb TIII:: XV, 5 kb TXV:: III, e 8 kb his3-Δ5' fragmentos (Figura 3B.1) . Cromossomos intactos podem ser preparados, separados por CHEF (Figura 3B.2), apagados para nylon e hibridizados com os 32 P-rotulados 1,8 kb HIS3 sonda para visualizar a 1,1 Mb intacta cromossomo XV, 0,8 Mb TXV: III cromossomo translocação, 0,6 Mb TIII: XV cromossomo translocação, e 0,3 Mb intacta cromossomo III (Figura 3B.3). Um mapa gráfico representando esperado endonuclease BamHI-digerido fragmentos de DNA genômico, e pai e cromossomos recombinantes, é descrito (Figura 3A).

Figura 1
Figura 1. Formação de cromossomos translocação pela vertente única annealing (SSA). 1) LAP são criados no his3-Δ3 e his3-Δ5 'substratos (cromossomos XV e III, respectivamente) pela endonuclease HO após a adição de galactose para as culturas. 2) LAP são processados ​​para gerar 3 'single-fios nas extremidades dos cromossomos quebrados. 3) SSA anneals 311 máquinas complementares ou 60 nucleotídeos single-stranded HIS3 seqüências formadas em cada um dos substratos de recombinação. Não-homólogos caudas formada a partir de recozimento são removidos por digestão endonuclease. Complementares quatro saliências bp nos fragmentos remanescentes cromossômicas formado por HO-endonuclease digestão também podem anneal. 4) Ligadura conclui a criação de um gene intacto HIS3 e TXV:: III cromossomo translocação pela SSA. Células que carregam esse cromossomo pode ser selecionado por sua capacidade de crescer em histidina falta médio. Ligadura também pode gerar o TIII recíproca:: XV cromossomo translocação por um mecanismo NHEJ-like.

Figura 2
Figura 2. Ensaio para determinar a freqüência de translocação de SSA. A) Um ml YPGly / Lac culturas são inoculadas com colônias única de células de um genótipo selecionar e cresceu para uma densidade adequada de cerca de 5x10 7-1x10 8 células / ml. Galactose é adicionada a uma concentração final de 2% para criar LAP na substratos recombinação nos cromossomos III e XV. Para realizar o ensaio em condições seletivas, diluições apropriadas são feitas de tal forma que aproximadamente 100 a 200 células são banhados em YPD e um número suficiente de células são banhados em histidina falta de rendimento médio e um número de colônias observáveis ​​Sua + recombinante. Para realizar o ensaio, sem seleção, cerca de 100 a 200 células são banhados em YPD, cultivados por dois a três dias para as colônias individuais e, em seguida, replica banhado em histidina meio faltando. B) Translocação freqüência pode ser determinado pela divisão do número de colônias que crescem on-Seus pratos pela fração que crescem em YPD. C) A freqüência de translocação de estirpes do genótipo diferente (ou seja do tipo selvagem e rad51Δ - / -) podem ser representados graficamente para comparar as diferenças na capacidade dessas cepas para reparar o LAP pela SSA.

Figura 3
Figura 3. Determinar a eficiência de galvanização. (A) Uma alíquota de células é retirado da cultura durante a noite antes e após a indução DSB, diluições apropriadas são feitas, seguido por uma contagem hemocitômetro para determinar o número total de corpos celulares por ml de cultura. Diluições apropriadas são semeados em meio não selectivo para determinar o número total de células viáveis ​​por ml, pela contagem de colônias que aparecem em YPD. (B) A eficiência revestimento é então determinado pela divisão do número total de células viáveis ​​pelo número total de corpos celulares, e multiplicando este quociente por 100.

Figura 4
Figura 4. Detecção de eventos de translocação cromossômica por Southern blot e análise genômica blot cromossomo.
A) Representação gráfica de cromossomos relevantes antes (esquerda) e depois (direita) a formação de translocação.
Tamanhos de pai e cromossomos recombinantes estão listados na megabase-pares (Mb). Tamanhos de fragmentos de restrição contendo seqüências relevantes gerados por BamHI digestão de DNA genômico do pai e linhagens recombinantes, e revelou em blots de hibridização com uma BamHI kb 1,8 clone HIS3 genômica, estão listados na kilobase-pares (kb). Cromossomos não estão em escala.
B) a análise física do suposto translocação de suporte de clones.
(1) blot Genomic do Sul - O DNA genômico foi coletado e submetido à digestão com endonuclease de restrição BamHI, fracionados por eletroforese em gel, bloenquadrados de nylon e hibridizados para um 32 kb 1,8 P-rotulados HIS3 sonda para visualizar os fragmentos seguintes: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb TIII:: XV, 5 kb TXV:: III, e 8 kb his3-Δ5 '. Lanes: a) diplóides pai, b) + Sua translocação não-recíprocas recombinantes, c) Sua translocação recíproca + recombinante.
(2) CHEF géis - cromossomos intactos foram preparadas em plugs de agarose, separados por CHEF, corado com brometo de etídio e visualizados sob luz UV. Lanes: Como acima.
(3) blots Cromossômicos - Separado cromossomos foram apagados de nylon e hibridizados com os 32 1,8 kb P-rotulados HIS3 sonda para visualizar os cromossomos seguintes: 1.1 Mb intacta cromossomo XV, 0,8 Mb TXV: III cromossomo translocação, 0,6 Mb TIII: translocação XV cromossomo, e 0,3 Mb intacta cromossomo III. Lanes: Como acima.

Discussion

Altas doses de radiação ionizante apresentam um risco inerente de instabilidade do genoma através da geração de um grande número de LAP 19. Genomas eucarióticos estão repletos de seqüências repetitivas que são substratos excelentes para a geração de translocações e rearranjos genômicos outros 20,21. Translocações cromossômicas por HR são freqüentemente observadas quando LAP são introduzidas entre seqüências repetitivas 12,21,22. Esmagadora evidência sugere que grande parte da instabilidade genômica associada a leucemias e linfomas pode ser atribuído à translocações cromossômicas, destacando a importância de entender como este mecanismo ocorre em eucariotos 22,23. Nós desenvolvemos um sistema em levedura de brotamento para examinar a formação de cromossomos translocação por DSB-induzida FC entre regiões curtas de homologia em cromossomos diferentes que são semelhantes em tamanho para elementos repetitivos dispersos por todo o fermento e genomas humanos.

No ensaio, o substrato his3-Δ3 'translocação está localizado em uma cópia do cromossomo XV. O alelo his3 outros (his3-Δ200) tem uma deleção ~ 1kb do promotor HIS3 e seqüência de codificação que impede que essa seqüência de ser usado como um modelo para conserto 24. O substrato his3-Δ5 'está localizado no locus LEU2 em uma cópia do cromossomo III, com a outra cópia do cromossomo III contendo um alelo LEU2 inalterado (Figura 1). A galactose induzível HO-cassete de expressão endonuclease marcados com KAN-MX foi inserido no lócus do cromossomo TRP1 IV (trp1:: GAL-HO-KAN-MX). Cada substrato translocação é ladeada por uma seqüência de reconhecimento HO-endonuclease que podem ser direcionados para a clivagem por induzir a expressão do gene HO através da adição de galactose para a mídia. Depois de HO-endonuclease clivagem induzidas na his3-Δ3 e his3-Δ5 'substratos, as células podem usar eficientemente o trato compartilhada curto de HIS3 homologia de seqüência (311 bp e 60 bp) para reparar os cromossomos quebrados por HR, gerando um cromossomo translocação com um alelo HIS3 intacta 12-14,25.

Porque as células-mãe falta uma cópia intacta do gene HIS3, eles são incapazes de crescer on-Sua médio. Apenas as células que sofreram o evento de translocação pode ser selecionado para histidina em falta média. Portanto, a freqüência de translocações cromossômicas pode ser calculado dividindo o número de colônias prototrophic histidina pelo número total de células viáveis ​​banhado, determinados por plaqueamento em YPD. DNA genômico e cromossomos intactos pode então ser isolada do representante colônias Sua +, ea presença de um cromossomo translocação verificada por Southern blot e análise genômica do cromossomo.

Análise cuidadosa nos permitiu coletar informações adicionais importantes sobre o teste 12. Southern blot genômico apresentou elementos de prova que não há corte praticamente completo de cromossomos XV e III após 30 minutos de HO-endonuclease de indução, e, portanto, não há nenhum fundo significativo de uncut substratos cromossômicas na população (G. & A. Bailis Manthey, resultados não publicados). Genômica análises de Southern blot e do cromossoma de Sua - indica que as células sobreviventes freqüentemente perdem um, o outro, ou ambos os cromossomos de corte e permanecem viáveis ​​(L. Liddell & A. Bailis, resultados não publicados). Importante, a eficiência de plaqueamento quase equivalente em meio não selectivo, antes e após a indução da expressão da HO-endonuclease indica que nem o insucesso para reparar cromossomos quebrados, nem o fracasso de manter cromossomos translocação afeta a capacidade de sobreviver a formação de DSB. Consistente com isso, o TXV: III cromossomo translocação tem se mostrado instável em células mitóticas na ausência de seleção. Isso foi demonstrado pela crescente TXV:: III recombinantes contendo Sua + noite não-seletivamente, chapeamento de colônias única para não-seletivo placas, chapeamento e réplica em meio seletivo sem histidina. Dez a 70% das colônias resultantes dessas placas tinham perdido a TXV:: III cromossomo translocação (N. & A. Bailis Pannunzio, resultados não publicados).

Translocação cromossomos gerados pela exposição IR em seres humanos apresentam uma instabilidade semelhante 26. Isto sugere que a formação de translocação pode contribuir para eventos iniciais na tumorigênese através da promoção de perda de heterozigose. Segundo, extensas análises genéticas e moleculares sugerem que SSA, um mecanismo eficiente e obrigatoriamente não-conservadora de RH, é o principal mecanismo de formação de translocação de HR após a criação simultânea de LAP em dois cromossomos 12,27,28. Esta é consistent com a constatação de que grandes doses de resultado IR em uma densidade de LAP suficiente para criar quebras adjacente a múltiplas seqüências repetitivas no genoma da levedura, e uma alta freqüência de formação de translocação de RH. Juntas, essas observações sugerem que o efeito oncogênico de exposição IR nos seres humanos podem, em parte, resultam da reparação de LAP por um mecanismo eficiente de RH que gera translocações que, através de sua inerente instabilidade, promover mudanças genéticas que tumorigênese lançamento. Porque a radiação é muitas vezes utilizado para tratar câncer de rearranjos, genoma que resultam da reparação de radiação induzida por LAP pode contribuir para a geração de cânceres secundários que surgem com freqüência nos pacientes. Assim, este modelo pode nos ajudar a obter uma melhor compreensão da base genética e molecular de uma importante resposta clínica ao tratamento IR.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por fundos dos Institutos Nacionais de Saúde e do Instituto de Pesquisas Beckman da Cidade da Esperança. Gostaríamos de agradecer aos revisores por seus comentários construtivos que acrescentou clareza ao manuscrito.

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Comments

1 Comment

  1. Thanks for sharing your knowledge

    Excellent article :)

    Reply
    Posted by: William E.
    September 27, 2011 - 10:30 AM

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