प्रोटीन और सेल बन्दिश के लिए दो आयामी नमूनों Substrates बनाना

Bioengineering

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Summary

स्व इकट्ठे monolayers (SAMs) सोने पर लंबी श्रृंखला alkane thiols गठन से अच्छी तरह से परिभाषित प्रोटीन पैटर्न और सेल कारावास के गठन के लिए substrates प्रदान करते हैं. Hexadecanethiol के microcontact मुद्रण polydimethylsiloxane (PDMS) के साथ backfilling बाद स्टांप का उपयोग कर एक glycol समाप्त alkane thiol monomer के एक पैटर्न का उत्पादन जहां प्रोटीन और कोशिकाओं को केवल मुद्रांकित hexadecanethiol क्षेत्र सोखना.

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Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164, doi:10.3791/3164 (2011).

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Abstract

Protocol

1. नमूनों की तैयारी मास्टर (चित्र 1)

  1. केंद्र स्पिन coater पर सिलिकॉन वफ़र और एसीटोन के साथ तालिका 1 में दो चक्र स्पिन कार्यक्रम के प्रारंभिक चरण के दौरान वफ़र कुल्ला. एसीटोन स्पिन एक साफ, सूखे वफ़र छोड़ने कार्यक्रम के दूसरे चरण के दौरान लुप्त हो जाना जाएगा.
  2. लगभग 1 एमएल लागू AZ9245 / photoresist में वेफर और स्पिन कोट तालिका 1 में वर्णित शर्तों का उपयोग करने के लिए (व्यास में).
  3. शीतल सेंकना 110 पर photoresist लेपित वफ़र ° सी 2 एक hotplate उच्च एकरूपता का उपयोग कर रहा हूँ के लिए.
  4. Photopattern सब्सट्रेट या तो एक प्रत्यक्ष लिखने photolithography प्रणाली या एक मुखौटा aligner प्रणाली और उपयुक्त मुखौटा का उपयोग. मुखौटे वाणिज्यिक स्रोतों के एक नंबर से खरीदा जा सकता है है. इसके अलावा, यूवी शोषक स्याही, एक ऑप्टिकल फ्लैट टेप के साथ मुद्रित transparencies बड़ी सुविधाओं के साथ पैटर्न का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. कोमल आंदोलन के साथ 1 मीटर 45 एस के लिए अर्द्ध कंडक्टर ग्रेड विआयनीकृत जल: 01:02 400K डेवलपर में नमूनों वफ़र का विकास करना. अर्द्ध कंडक्टर ग्रेड विआयनीकृत जल और नाइट्रोजन की धारा (2 एन) गैस के साथ सूखी के साथ अच्छी तरह कुल्ला. पैटर्न विकास एक यूवी फिल्टर के साथ एक खुर्दबीन का उपयोग कर जाँच की जा सकती है. यदि पैटर्न पूरी तरह विकसित नहीं है, वेफर अतिरिक्त समय के लिए विकसित समाधान के लिए लौटा जा सकता है.

नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, photopatterning एक cleanroom वातावरण में बाहर किया जाना चाहिए.

2. PDMS स्टाम्प तैयार (चित्र 2)

  1. वजन राल द्वारा 10:01 की तैयारी: Sylgard 182 (PDMS) के hardener मिश्रण और पूरी तरह से एक डिस्पोजेबल पेट्री डिश में मिश्रण के साथ गुरु (photopatterned वफ़र) को कवर.
  2. De - गैस PDMS कवर एक निर्वात dessicator में मास्टर जब तक कोई बुलबुले दिखाई दे रहे हैं और स्टांप एक ओवन में 65 ° सी में 1.5 एच. के लिए इलाज करने के लिए अनुमति देते हैं इलाज के लिए पहले, यह महत्वपूर्ण है सुनिश्चित करें कि मास्टर पकवान के नीचे के रूप में यह डे - बक कदम के दौरान सतह वृद्धि कर सकते हैं.
  3. PDMS कट गुरु के बाहर टिकट और उपयुक्त आकार करने के लिए ट्रिम. एक कवर कंटेनर (सुविधा पक्ष) के लिए यह धूल और मलबे से बचाने में स्टांप स्टोर.

3. नमूनों गोल्ड सब्सट्रेट की तैयारी (चित्रा 3)

  1. 25 मिमी कोई तैयार करें. धातु बयान के लिए उन्हें ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ 10 मीटर के लिए इलाज के द्वारा एक गोल कांच coverslips 18.2 MΩ विआयनीकृत दो बार इथेनॉल के साथ पीछा किया, हर कदम के बीच एन 2 गैस की एक धारा के साथ सुखाने पानी के साथ दो बार कुल्ला.
  2. एक बहु जेब बयान इलेक्ट्रॉन बीम प्रणाली का प्रयोग, जमा, 50 एक टाइटेनियम 150 एक सोने के द्वारा पीछा किया. टाइटेनियम परत और सोने की परत के बयान के बीच बाष्पीकरण वेंट मत करो. वैकल्पिक रूप से, सोने में लिपटे coverslips आपूर्तिकर्ताओं की एक किस्म से खरीदा जा सकता है है, तथापि, यह महत्वपूर्ण है कि धातु परतों इलेक्ट्रॉन बीम वाष्पीकरण और नहीं थर्मल वाष्पीकरण द्वारा तैयार कर रहे हैं. 11 से पहले का उपयोग करने के लिए: यदि एक बाहर के स्रोत से खरीदा है, सोने substrates प्लाज्मा ऑक्सीकरण या "पिरान्हा" (30% एच 2 2 हे 07:03 सान्द्र एच 2 अतः 4) द्वारा साफ किया जा सकता है .

नोट: "पिरान्हा" समाधान कार्बनिक यौगिकों की उपस्थिति में विस्फोटक है.

  1. मुद्रांकन समाधान, निरपेक्ष इथेनॉल में 10 मिमी hexadecanethiol, और backfilling समाधान, 1 मिमी glycol - निरपेक्ष इथेनॉल में समाप्त thiol तैयार करें.
  2. इथेनॉल के साथ स्टांप कुल्ला और एन 2 गैस के साथ अच्छी तरह से सूखे. PDMS स्टांप dropwise के लिए जब तक पूरी तरह से लेपित समाधान मुद्रांकन लागू करें. स्टांप N 2 गैस के साथ अच्छी तरह से सूखे . PDMS स्टांप की सुविधाओं के आधार पर उचित रूप में 5a या 5b करने के लिए आगे बढ़ें.
    1. धीरे सोने के सब्सट्रेट पर स्टांप प्रेस और monolayer 15 के लिए फार्म करने की अनुमति एस
    2. 18.2 MΩ विआयनीकृत जल युक्त एक पेट्री डिश में सोने सब्सट्रेट प्लेस, यह सुनिश्चित करने सब्सट्रेट जलमग्न है. धीरे सोने के सब्सट्रेट पर स्टांप प्रेस और monolayer 15 के लिए फार्म करने की अनुमति एस
  3. मुद्रांकित सब्सट्रेट इथेनॉल के साथ दो बार कुल्ला N 2 गैस के साथ सुखाने के बाद प्रत्येक कुल्ला और एक पेट्री डिश में सब्सट्रेट जगह.
  4. समाधान backfilling सब्सट्रेट के साथ कवर और parafilm साथ पकवान वाष्पीकरण रोकने के सील.
  5. पृष्ठभूमि monolayer अंधेरे में 12-14 एच. के लिए फार्म की अनुमति दें
  6. Backfilling समाधान के नमूनों coverslip से निकालें और इथेनॉल के साथ दो बार कुल्ला, प्रत्येक कुल्ला के बाद N 2 गैस के साथ सुखाने.

4. नमूनों सब्सट्रेट करने के लिए प्रोटीन और कोशिकाओं लागू

  1. 500 μL 1 Dulbecco फास्फेट के एमएल के साथ एक छोटे से पेट्री डिश या सेल संस्कृति कक्ष और कवर में नमूनों coverslip प्लेस खारा buffered (DPBS). DPBS पूरी तरह से प्रोटीन ऊष्मायन के दौरान सब्सट्रेट को भी प्रोटीन की कवरेज सुनिश्चित करने के कवर होगा.
  2. DPBS करने के लिए प्रोटीन का एक केंद्रित समाधान जोड़ें और पाइप द्वारा समाधान का मिश्रणting कई बार. सब्सट्रेट के साथ 37 में प्रोटीन मिश्रण सेते डिग्री सेल्सियस के लिए एच. 1 Laminin और fibronectin के लिए अंतिम सांद्रता आम तौर पर कर रहे हैं 12 μg / एमएल और 20 μg / एमएल, क्रमशः. प्रोटीन एक amine प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया जा सकता है आसान पैटर्न के दृश्य के लिए अनुमति. हालांकि, लेबल प्रोटीन मिलाया जा 01:01 प्रोटीन लेबलिंग के रूप में unlabeled प्रोटीन के साथ जैविक गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं चाहिए.
  3. ऊष्मायन के बाद, सब्सट्रेट DPBS (4 5x) के साथ अच्छी तरह से अनबाउंड प्रोटीन को दूर कुल्ला, सब्सट्रेट सूखी या नहीं यह इंटरफ़ेस हवा - पानी के माध्यम से लाने ख्याल रख रही. पहले तीन rinses के बाद, पूरा सेल के विकास मीडिया की लगभग 500 μL जोड़ने के लिए एक गीला सब्सट्रेट बनाए रखने के लिए.
  4. विकास मीडिया ताजा मीडिया के साथ सब्सट्रेट कुल्ला करने के लिए इस्तेमाल किया बदलें.
  5. अलग कर देना और सब्सट्रेट चढ़ाना के लिए कोशिकाओं की गिनती. Hippocampal न्यूरॉन्स, या चो-K1 कोशिकाओं के रूप में अमर सेल लाइनों, के रूप में या तो अलग प्राथमिक कोशिकाओं, का उपयोग किया जा सकता है.
  6. सब्सट्रेट प्लेट dissociated कोशिकाओं. आमतौर पर 30 से 200 कोशिकाओं / 2 मिमी किया जाता है.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1
चित्रा 1 नमूनों मास्टर के photolithographic तैयारी के लिए जनरल योजनाबद्ध. इस प्रक्रिया में, एक सिलिकॉन वफ़र एसीटोन साफ ​​है, photoresist, ब्याज के पैटर्न को उजागर के साथ लेपित, और पैटर्न विकसित की है.

चित्रा 2
चित्रा 2 जनरल PDMS स्टांप तैयार करने के लिए योजनाबद्ध. इस प्रक्रिया में, नमूनों मास्टर Sylgard (10:01 राल: hardener) के साथ कवर किया जाता है, एक निर्वात desiccator, 60 में एक ओवन में ठीक ° सी में de-को मार डाला, और आकार में कटौती.

चित्रा 3
चित्रा 3 सब्सट्रेट patterning के लिए जनरल योजनाबद्ध. इस प्रक्रिया में, ग्लास substrates (50A) टाइटेनियम और सोना (150Å) के साथ लेपित हैं एक इलेक्ट्रॉन बीम बाष्पीकरण, microcontact मुद्रण एक PDMS स्टांप का उपयोग hexadecanethiol द्वारा नमूनों, glycol समाप्त alkane thiols के साथ backfilled, और fluorescently लेबल प्रोटीन के साथ लेपित का उपयोग.

चित्रा 4
चित्रा 4. नमूनों गुरु (ए) और PDMS स्टाम्प (बी) वर्णित विधियों का उपयोग कर तैयार है. स्केल सलाखों 100μm हैं.

चित्रा 5
चित्रा 5 नमूनों SAMs AlexaFluor 647 लेबल (A) fibronectin और चो K1 सेल कारावास (बी) के साथ कल्पना . स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी हैं.

चित्रा 6
चित्रा 6 E18 इन विट्रो में 4 दिनों में माउस hippocampal न्यूरॉन्स के साथ नमूनों laminin वरीयता प्राप्त . AlexaFluor 350 संयुग्मित विरोधी laminin एंटीबॉडी पैटर्न दृश्य (एक) के लिए प्रयोग किया जाता है और E18 माउस hippocampal न्यूरॉन्स MitoTracker लाल 580 (बी) के साथ दाग रहे हैं. स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी हैं.

7 चित्रा
7 चित्रा नमूनों सब्सट्रेट तैयारी में संभावित नुकसान के 647 संयुग्मित AlexaFluor fibronectin सोखना द्वारा visualized . (ए) असमान प्रोटीन सोखना करने के लिए अपर्याप्त मिश्रण होता है. (बी) आंशिक खड़ाऊँ हस्तांतरण करने के लिए सुराग मुद्रांकन के दौरान दबाव के असमान आवेदन. (सी) मुद्रांकन के दौरान अत्यधिक दबाव के पतन के लिए स्टांप नेतृत्व कर सकते हैं. (डी) rinsing के दौरान नमूनों हवा, पानी इंटरफेस करने के लिए सतह के एक्सपोजर पृष्ठभूमि प्रोटीन सोखना में परिणाम कर सकते हैं. स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी हैं.

8 चित्रा
8 चित्रा जलमग्न patterning के छोटे सुविधाओं है कि हवा में पारंपरिक microcontact मुद्रण द्वारा मुद्रित करने के लिए मुश्किल हैं के साथ पैटर्न का उत्पादन कर सकते हैं. छवियाँ (ए) और (बी) एक ही पैटर्न के विभिन्न क्षेत्रों, हवा में एक ही PDMS स्टांप (ए) या विआयनीकृत जल (बी) के साथ मुद्रित दिखा. 10μm व्यापक समर्थन लाइनें जो चारों ओर पैटर्न (स्टांप पतन को रोकने में मदद करने के लिए के लिए जोड़ा) (ए), तथापि, छोटे डॉट सुविधाओं के रूप में दिखाया गया है (बी) नहीं देखा जाता है में देखा जाता है. यह दर्शाता है कि हवा में मुद्रण बड़े सुविधाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन पानी में मुद्रण छोटे सुविधाओं के साथ पैटर्न के लिए आवश्यक हो सकता है. स्केल सलाखों 20 सुक्ष्ममापी हैं.

चक्र त्वरण दर (/ rpm) अंतिम स्पीड (rpm) समय ()
1 500 1000 5
2 3800 3800 30

तालिका 1.दो चक्र स्पिन कार्यक्रम के लिए एक सिलिकॉन वफ़र पर एक 4.5 सुक्ष्ममापी AZ9245 की मोटी कोटिंग बनाने के लिए इस्तेमाल किया.

पहले नमूनों substrates, photoresist में एक मास्टर के गठन के लिए PDMS टिकटों तैयार करने के लिए (1 आंकड़े और 4A) गढ़े है. मास्टर स्टांप का प्रतिलोम है और या तो एक प्रत्यक्ष लिखना लिथोग्राफी प्रणाली या एक मुखौटा aligner का उपयोग कर बनाया है. जब AZ9245 के रूप में एक सकारात्मक photoresist, मास्टर उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया है, विरोध में लिपटे वफ़र एक ही पैटर्न है कि अंतिम सब्सट्रेट पर दिखाई देगा के साथ प्रकाश के संपर्क में है. हालांकि यह हमेशा संभव नहीं है, यह बताया गया है कि PDMS स्टांप आकाओं के लिए आदर्श पहलू अनुपात (सुविधा के लिए मोटाई का विरोध आकार) 01:02 है 13. हमने पाया है कि 1:40 के अनुपात पहलू संभव हो रहे हैं, प्रकृति पर निर्भर करता है पैटर्न के. शर्तों के तहत AZ9245 लेपित सिलिकॉन wafers यहाँ वर्णित 4.5 सुक्ष्ममापी के नाममात्र मोटाई के साथ photoresist दे. हमने पाया है कि AZ9245 के इस मोटाई PDMS स्वामी से> 100 सुक्ष्ममापी 2 सुक्ष्ममापी लेकर सुविधाओं के साथ उत्पादन किया जा सकता है.

PDMS टिकटों Sylgard (या Sylgard 184) 182 photoresist (चित्रा 2) से गढ़े मास्टर का उपयोग कर से डाली हैं. Photoresist स्वामी कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है एक ही टिकट के कई प्रतियां बनाने के. सख्त PDMS के बाद, टिकटें एक रेजर ब्लेड और एक खुर्दबीन के नीचे परिणामस्वरूप स्टांप कल्पना स्टांप सुविधा ओर एक गिलास coverslip (4B चित्रा) पर नीचे रखकर किया जा सकता है का उपयोग कर मास्टर से हटा रहे हैं

एक तेज, स्पष्ट प्रोटीन पैटर्न है कि प्रोटीन fluorescently लेबल (आंकड़े 3 और 5) के अनुप्रयोग द्वारा visualized किया जा सकता है में उचित मुद्रांकन परिणाम. वैकल्पिक रूप से, immunohistochemistry सेल निर्धारण के बाद प्रोटीन पैटर्न (चित्रा 6) कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सेल के विकास अच्छी तरह से दोनों अमर सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं (आंकड़े 5 और 6) के लिए प्रोटीन के पैटर्न के लिए ही सीमित है.

हालांकि इस तकनीक को आसानी से महारत हासिल है, कई आम समस्या उत्पन्न हो सकती है. DPBS में केंद्रित प्रोटीन समाधान के लिए पर्याप्त मिश्रण के बिना प्रोटीन असमान प्रोटीन पैटर्न (चित्रा 7A) के आवेदन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. अनुचित मुद्रांकन आंशिक पैटर्न हस्तांतरण या स्टांप पतन (चित्रा 7B - सी) के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, नमूनों सब्सट्रेट हवा करने के लिए adsorbed प्रोटीन युक्त monolayer की पृष्ठभूमि में कम प्रतिरोध (चित्रा 7D) के कारण बाधित कर सकते हैं उजागर. बहुत छोटे (<5 सुक्ष्ममापी) सुविधाओं और उच्च पहलू अनुपात शामिल पैटर्न अक्सर जलमग्न microcontact मुद्रण के उपयोग की आवश्यकता है. इस प्रक्रिया पानी (3.5b) में पैटर्न के बाहर सब्सट्रेट पर जमा (8 चित्रा) से hexadecanethiol को रोकने के लिए एक बाधा के रूप में प्रयोग किया जाता है 14.

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Discussion

PDMS स्टांप निर्माण के लिए इस्तेमाल किया मास्टर के lithographic उत्पादन में मुद्दों का एक नंबर पैदा कर सकते हैं. अपूर्ण फोटो अस्पष्ट और अस्पष्ट पैटर्न और विरोध में लिपटे बढ़े या लापता सुविधाओं में वफ़र परिणामों के overexposure में विरोध - लेपित वफ़र परिणामों के. सामान्य में, बड़ी सुविधा आकार (> 10 सुक्ष्ममापी) के साथ स्वामी पैटर्न के लिए अपेक्षाकृत आसान हैं और विकसित है, जबकि छोटे सुविधाओं के साथ स्वामी photopatterning और विकास मापदंडों का व्यापक अनुकूलन (photoresist निर्माता द्वारा सिफारिश की मापदंडों से परे) की आवश्यकता कर सकते हैं. सबसे मुश्किल स्वामी उत्पादन दोनों बड़े और छोटे सुविधाओं गठबंधन.

एक मास्टर से PDMS स्टांप निर्माण की धारा 2 में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए सरल है. हालांकि, देखभाल के लिए पूरी तरह से Sylgard 182 के दो घटकों का मिश्रण करने के लिए लिया जाना चाहिए. हासिल करने में विफलता के लिए घटकों की पूरी मिश्रण कठोर टिकट और मास्टर की संभावना विनाश के लिए एक असमर्थता में परिणाम देगा. इसके अतिरिक्त, मास्टर जब यह PDMS स्टाम्प से अलग अगर अतिरिक्त बल का इस्तेमाल किया है या घुमा जुदाई के दौरान होता है टूट सकता है. यदि मास्टर स्टांप हटाने की प्रक्रिया में तोड़ करता है, यह अभी भी संभव हो सकता है इथेनॉल के साथ सफाई के बाद स्टांप का उपयोग कर सकते हैं. हालांकि, इस स्टांप दोष साइटों के साथ पैटर्न का उत्पादन हो सकता है.

जबकि एक PDMS स्टांप का उपयोग SAMs के microcontact मुद्रण बहुमुखी है और कई अनुप्रयोगों में उपयोगी हो सकता है है, महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर के सफल प्रोटीन और सेल कारावास प्राप्त करने के लिए पालन किया जाना चाहिए. अच्छा प्रोटीन और सेल कारावास प्राप्त करने के लिए, सोने substrates के इलेक्ट्रॉन बीम बयान से तैयार किया जाना चाहिए, थर्मल वाष्पीकरण के बाद से किसी न किसी सोने की सतहों कि उचित monolayer गठन का समर्थन नहीं करते की ओर जाता है है. इसके अलावा, हमने पाया है कि कैसे गिलास सब्सट्रेट टाइटेनियम और सोने बयान के लिए तैयार है भी सोने की सब्सट्रेट और monolayer स्थिरता की गुणवत्ता को प्रभावित करता है. जबकि ग्लास substrates उबलते मेथनॉल, "पिरान्हा", हमारे हाथ में 11 और "गिद्ध" समाधान, 12 सहित प्लाज्मा ऑक्सीकरण द्वारा तैयार अभी तक अन्य तरीकों का उपयोग कर साफ coverslips बेहतर coverslips कर रहे हैं तकनीक, की एक विस्तृत विविधता का उपयोग कर बयान के लिए साफ किया जा सकता है है. हमने देखा है कि विलायक, एसिड, और आधार - आधारित सफाई तरीकों कम अस्थायी स्थिरता और दोष साइटों की बढ़ती संख्या के साथ monolayers दे.

सटीक मुद्रांकन इष्टतम प्रोटीन और सेलुलर पैटर्न का उत्पादन करने के लिए आवश्यक तकनीक और टिकट लगा जा सुविधाओं और टिकट के पहलू अनुपात के आकार और आकार के आधार पर भिन्न होता है. आमतौर पर, प्रत्येक नए टिकट के लिए सटीक मुद्रांकन तकनीक और अनुकूलित किया जाना चाहिए मुद्रांकन तकनीक कई परीक्षणों के बाद सुधार. मुद्रांकन के दौरान बहुत अधिक दबाव लागू करने के लिए पतन है, जो टिकटों बड़ा पहलू अनुपात (चित्रा 7C) युक्त के साथ होने का खतरा है टिकट का नेतृत्व करेंगे. वैकल्पिक रूप से, बहुत कम आंशिक पैटर्न हस्तांतरण (चित्रा 7B) में दबाव परिणाम को लागू करने. यह भी संभव है मुद्रांकन तकनीक का लाभ लेने के लिए थोड़ा पैटर्न की विशेषताएं बदल. उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि सुविधाओं को थोड़ा समय और दूसरों के लंबी अवधि के लिए मुद्रांकन के द्वारा किया जा सकता है आकार में वृद्धि हुई है बताया कि कुछ सुविधाओं के आयामों जलमग्न microcontact मुद्रण तकनीक का उपयोग कम किया जा सकता है, अक्सर 15 हवा बुलबुले स्टाम्प के नीचे फंस बन जाते हैं जब जलमग्न मुद्रांकन प्रदर्शन, लेकिन इस तकनीक का सबसे अच्छा परिणाम जब बड़े पहलू अनुपात के साथ संयोजन के रूप में छोटे सुविधाओं वांछित हैं दे सकता है.

आत्म इकट्ठे monolayer रसायन विज्ञान के साथ संयोजन के रूप में microcontact मुद्रण का उपयोग करने के लिए कई फायदे हैं. जब सीधे substrates पर मुद्रण प्रोटीन, गठनात्मक परिवर्तन के लिए 16 कदम जहां प्रोटीन मुद्रांकन प्रक्रिया के दौरान सूख रहे हैं करने के लिए attributable होते दिखाया गया है. यह सुखाने कदम प्रोटीन एकत्रीकरण और विकृतीकरण, जो बारी में प्रोटीन समारोह को प्रभावित करता है के लिए नेतृत्व करने के लिए सोचा है. एसएएम प्रणाली में प्रोटीन एक बफर जलीय समाधान, कैसे substrates के आम तौर पर सेल संस्कृति के लिए तैयार हैं समान से सब्सट्रेट करने के लिए सोखना. इसके अलावा, समय की विस्तारित अवधि, प्रोटीन प्रतिरोधी पृष्ठभूमि अणुओं की कमी के कारण के लिए प्रोटीन के microcontact मुद्रण सेल कारावास नहीं हासिल करता है इसके विपरीत. 17, glycol पृष्ठभूमि monolayer का उपयोग मामलों में उत्कृष्ट प्रसूति के लिए प्रदान करता है 5 कहाँ उपयोग या तो संभव अवांछनीय या नहीं, एक सोने की सब्सट्रेट के trichlorosilane monomers बजाय उपयोग कर सकते हैं प्रोटीन और सेल के कारावास के लिए अनुमति देने के लिए 9. जबकि वहाँ प्रोटीन और कोशिकाओं है कि microcontact मुद्रण पर भरोसा नहीं है की प्रसूति के लिए तरीके हैं, और इन तरीकों के लिए हो जाते हैं अधिक श्रम गहन और समान substrates के बड़ी संख्या में उत्पादन के लिए उत्तरदायी नहीं हैं आम तौर पर जैविक अध्ययन के लिए आवश्यक 18,19.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम वाशिंगटन विश्वविद्यालय जिसका सामूहिक ज्ञान के इस प्रोटोकॉल संभव बनाया है में पूरे Maurer समूह स्वीकार करना चाहते हैं. मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (1R01MH085495) द्वारा इस कार्य के लिए अनुदान उपलब्ध कराया जाता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer Wafer Reclaim Services 2 inch
Spin coater/hot plate Brewer Science, Inc. Cee 200CB Spin-Bake System
AZ9245 Photoresist Mays Chemical Company 105880034-1160
Direct-write photolithography system Microtech s.r.l. LW325 LaserWriter System
Mask Aligner HTG 3HR
AZ 400K Developer Mays Chemical Company 105880018-1160
Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
25 mm no. 1 round glass coverslips VWR international 16004-310
Plasma Oxidizer Diener Femto
Titanium piecesKamis Incorporated 99.95% pure
Gold pellets Kamis Incorporated 99.999% pure
Electron-beam evaporator Kurt J. Lesker PVD 75 Thin Film Deposition System with electron-beam accessory
Hexadecanethiol Alfa Aesar A11362
1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) Sigma-Aldrich 674508
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200 200 proof, absolute
Parafilm VWR international 52858-000
DPBS VWR international 4500-434 Without calcium and magnesium
Mouse Laminin I VWR international 95036-762
Human Plasma Fibronectin Invitrogen 33016-015
AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A-20006
MitoTracker Red 580 Invitrogen M22425
AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A-10168
Anti-laminin antibody Fisher Scientific AB2034MI

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References

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