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Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

Neuroscience

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Summary

La photolyse de composés en cage permet la production d'une augmentation rapide et localisé dans la concentration de divers composés physiologiquement actifs. Ici, nous montrons comment obtenir des enregistrements de patch-clamp combinée avec la photolyse de l'AMPc en cage ou en cage Ca pour l'étude de la transduction olfactive chez la souris dissocié neurones sensoriels olfactifs.

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Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

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Abstract

La photolyse de composés en cage permet la production d'une augmentation rapide et localisé dans la concentration de divers composés physiologiquement actifs 1. Caged composés sont des molécules composées physiologiquement inactive par une cage chimique qui peut être rompu par un éclair de lumière ultraviolette. Ici, nous montrons comment obtenir des enregistrements de patch-clamp combinée avec la photolyse de composés en cage pour l'étude de la transduction olfactive chez la souris dissocié neurones sensoriels olfactifs. Le processus de transduction olfactive (Figure 1) se déroule dans les cils olfactifs des neurones sensoriels, où se liant aux récepteurs odorants conduit à l'augmentation de l'AMPc qui ouvre des nucléotides cycliques-dépendants (CNG) des canaux 2. D'entrée de Ca par les canaux CNG active les canaux Cl Ca-activé. Nous montrons comment dissocier les neurones de l'épithélium olfactif de souris 3 et comment activer les canaux CNG ou Ca-Cl activé les canaux par photolyse de l'AMPc en cage en cage 4 ou 5 Ca </ Sup>. Nous utilisons une lampe flash 6,7 à appliquer clignote ultraviolets pour la région ciliaire à uncage AMPc ou Ca alors de patch-clamp enregistrements sont prises pour mesurer le courant dans la cellule entière voltage-clamp de configuration 8-11.

Discussion

Photolyse de composés en cage combiné avec des enregistrements de patch-clamp est une technique utile pour obtenir des sauts rapides et locales de la concentration de molécules actives physiologiquement à l'intérieur et l'extérieur des cellules. Plusieurs types de composés1 cage ont été synthétisés, et cette technique peut être appliquée à divers types de cellules, y compris les cellules en culture exprimant les canaux ioniques qui peuvent être activées ou modulée par photolyse de certains des composés disponibles en cage 11.

La photolyse de composés en cage nécessite des impulsions à haute intensité de la lumière UV proche uncage une quantité suffisante de molécules dans un court laps de temps. Diverses sources de lumière peuvent être utilisés: une lampe à arc fonctionnant en continu du mercure ou au xénon contrôlée par un obturateur et couplé au port du microscope à épifluorescence, un flash au xénon lampe, un laser UV, et le récemment développé UV de haute puissance de diodes électroluminescentes (DEL ). Chaque type de source lumineuse a des avantages et inconvénientstages en fonction de l'application spécifique et le coût de l'appareil. Par rapport à une lampe flash, les lampes fonctionnant en continu ont une plus faible intensité de la lumière et donc la durée des impulsions de lumière contrôlé par un obturateur doit être augmenté jusqu'à plusieurs centaines de ms pour obtenir une quantité suffisante de molécules Uncaged. Lasers UV sont très coûteux. Haute puissance UV LED 14 pour la photolyse flash sont disponibles sur le marché récemment et pourrait offrir une bonne alternative à d'autres méthodes. Cependant, un avantage de lampes flash, c'est qu'ils ont un spectre plus large d'émissions que les DEL UV, permettant l'utilisation de plusieurs types de composés en cage avec des caractéristiques spectrales différentes Les principaux avantages d'utiliser une lampe flash au xénon pour les uncaging dans notre application sont: une bonne résolution en temps, en effet la durée de l'impulsion lumineuse est d'environ 1 ms; un spectre UV large qui est approprié pour la photolyse des molécules avec des propriétés photochimiques, la possibilité de choisir le centimension de la tache de lumière pour illuminer la région ciliaire, la possibilité de sélectionner facilement des intensités lumineuses différentes 6. En outre, la lampe flash au xénon-a un coût raisonnable, il est facilement mis en œuvre dans une électrophysiologiques set-up, et ne nécessite pas une maintenance particulière.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70
Air table TMC MICRO-g 63-534
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8
Data Analysis Software WaveMetrics Igor
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U
Faraday’s cage Custom Made
Filter cube Olympus Corporation U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments, Inc. 14099
Glass capillaries World Precision Instruments, Inc. PG10165-4
Glass bottom dish World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Illuminator Olympus Corporation Highlight 3100
Inverted microscope Olympus Corporation IX70
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I
Micropipette Puller Narishige International PP-830
Monitor HesaVision MTB-01
Neutral density filters Omega Optical varies
Objective 100X Carl Zeiss, Inc. Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus Corporation UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments, Inc. AGT1025
Silver ground pellet Warner Instruments 64-1309
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML
Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma-Aldrich C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma-Aldrich C7275
CsCl Sigma-Aldrich C4036
DMSO Sigma-Aldrich D8418
DNAse I Sigma-Aldrich D4527
EDTA Sigma-Aldrich E9884
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P3911
KOH Sigma-Aldrich P1767
Leupeptin Sigma-Aldrich L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma-Aldrich P3125
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1274
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Sigma-Aldrich S5881
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256

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References

  1. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
  2. Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
  3. Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
  4. Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
  5. Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
  6. Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
  7. Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
  8. Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
  9. Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
  10. Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
  11. Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
  12. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
  13. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
  14. Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).

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