प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रात्मक immunofluorescence का उपयोग ट्यूमर में विविधता मानचित्रण

Medicine
 

Summary

यहाँ हम एक मात्रात्मक immunofluorescence, छवि विश्लेषण, और विविधता के एक सांख्यिकीय माप का उपयोग कर ट्यूमर सामग्री के histological वर्गों में आणविक विविधता यों विधि का वर्णन. विधि नैदानिक ​​biomarker विकास और विश्लेषण में उपयोग के लिए इरादा है.

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Faratian, D., Christiansen, J., Gustavson, M., Jones, C., Scott, C., Um, I., Harrison, D. J. Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (56), e3334, doi:10.3791/3334 (2011).

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Abstract

Protocol

1. ऊतक तैयारी

  1. Microtomy
    1. धारा formalin तय आयल 4 सुक्ष्ममापी मोटाई में ट्यूमर ब्लॉक एक रोटरी सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग कर एम्बेडेड.
    2. सकारात्मक आरोप लगाया सूक्ष्म स्लाइड्स पर वर्गों रखें.
    3. एक रातोंरात ° ओवन सी 37 में स्लाइड्स को सेते हैं.
  2. भंडारण
    1. एक स्टोर में -18 वर्गों डिग्री सेल्सियस -25 के लिए डिग्री सेल्सियस फ्रीजर, क्रम में प्रतिजनकता के नुकसान को रोकने के लिए.

2. ऊतक वर्गों के immunofluorescence

  1. Dewaxing और पुनर्जलपूरण
    1. Dewax xylene में दो बार स्लाइड 5 मिनट के लिए.
    2. 99%, 99%, 80%, 50% इथेनॉल के क्रम में 2 मिनट के लिए प्रत्येक के नल का पानी चलाने में स्लाइड्स rehydrate.
  2. एंटीजन रिट्रीवल
    1. गर्मी प्रेरित प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन, एक प्रेशर कुकर में मील में 5 मिनट के लिए 0.15 मिमी सोडियम साइट्रेट, पीएच 6.0 बफर का उपयोगcrowave.
    2. नीचे 20 मिनट के लिए स्लाइड्स कूल.
    3. झूली कुरसी पर 5 मिनट के लिए 0.05% PBST में स्लाइड्स कुल्ला.
  3. प्रक्रिया अवरुद्ध
    1. 10 मिनट के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में वर्गों समझो.
    2. झूली कुरसी पर 5 मिनट के लिए 0.05% PBST में स्लाइड्स कुल्ला.
    3. Sequenza Immunostaining रैक करने के लिए वर्गों जोड़ें.
    4. सीरम मुक्त प्रोटीन ब्लॉक में 10 मिनट के लिए वर्गों समझो.
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
    1. सेते प्राथमिक एंटीबॉडी Dako एंटीबॉडी मंदक में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने के लिए पतला.
    2. PBST 0.05% में 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार कुल्ला.
  5. उपकला मुखौटा ऊष्मायन (Cytokeratin)
    1. सेते माउस विरोधी पैन cytokeratin, Dako एंटीबॉडी मंदक में 1:50 4 पर रातोंरात पतला डिग्री सेल्सियस
  6. उपकला मुखौटा दृश्य
    1. बकरी विरोधी माउस Alexa555 एस 1:25 कमजोर पड़ने तैयारपूर्व पतला में econdary एंटीबॉडी बकरी खरगोश एचआरपी एंटीबॉडी समाधान कल्पना. कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए अंधेरे में स्लाइड्स सेते हैं.
    2. 5min प्रत्येक के लिए तीन बार PBST 0.05% में कुल्ला.
  7. टारगेट दृश्य
    1. Sequenza से आर्द्रता चैम्बर स्लाइड्स स्थानांतरण.
    2. लक्ष्य संकेत प्रवर्धन (HistoRx टब ई) 01:50 एकाग्रता में और Cy5 Tyramide (HistoRx ट्यूब एफ) मंदक का मिश्रण. मिश्रण अच्छी तरह से भंवर. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में स्लाइड्स को सेते हैं.
    3. PBST 0.05% में 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार कुल्ला.
    4. में स्लाइड्स 1 मिनट के लिए 80% इथेनॉल निर्जलीकरण.
    5. अंधेरे में एयर सूखी स्लाइड्स.
  8. Counterstaining और coverslipping
    1. लागू coverslips पर DAPI बढ़ते मध्यम और ऊतक वर्गों से अधिक coverslips जगह है.
    2. अंधेरे में रात भर सूखी स्लाइड्स.
    3. बाद स्लाइड्स सूखे, एन के लिए सुरक्षित नेल पॉलिश के साथयकीन है कि लंबी अवधि के संरक्षण और एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रहते हैं.

3. पूरे अनुभाग स्कैनिंग का उपयोग कर छवि पर कब्जा

  1. Aperio ScanScope FL स्लाइड स्कैनर के स्लाइड कैसेट में पांच स्लाइड्स के लिए लोड.
  2. प्रत्येक स्लाइड के लिए, ScanScope कंसोल में इंटरफ़ेस का उपयोग कर छवि को सामान्य क्षेत्र का चयन करें. स्लाइड पर सभी ऊतक धरना, पैटर्न या नमूने के अन्य नमूदार पहलुओं धुंधला की परवाह किए बिना क्षेत्र का चयन करें.
  3. ScanScope कंसोल चैनल प्रत्येक (DAPI, Cy3 और Cy5) निम्नानुसार एक इष्टतम जोखिम का निर्धारण करने के लिए, का प्रयोग:
    1. पूछताछ ऊतक के एक क्षेत्र का चयन करें - इस क्षेत्र, आदर्श, ट्यूमर ऊतक के क्षेत्र में किया जाना चाहिए करने के लिए सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व प्रदान.
    2. ScanScope कंसोल autoexposure सुविधा का प्रयोग, छवि ध्यान देने के साथ साथ जोखिम प्रत्येक चैनल के लिए सुझाव दिया समय का मूल्यांकन.
    3. खत्म दोहराएँ प्रत्येक नमूने के 3-5 क्षेत्रों करने के लिए सहमूल्य की स्थिरता nfirm.
  4. स्लाइड के coverslipped क्षेत्र के भीतर अभी भी (ScanScope कंसोल छवि पर एक नीले हीरे से दिखाया गया है) एक अतिरिक्त ऊतक से दूर क्षेत्र, अभी तक का चयन करें, के लिए एक पृष्ठभूमि क्षेत्र है जहां फ्लैट मैदान सुधार छवियों प्रत्येक फ़िल्टर के लिए अधिग्रहीत किया जाएगा परिभाषित.
  5. इन छवियों छवि अधिग्रहण से पहले की समीक्षा करें. अगर छवियों के लिए उच्च पृष्ठभूमि या अन्य छवि कलाकृतियों दिखाई देते हैं, छवि क्षेत्र और स्थानांतरित किया जाना चाहिए नए छवियों का अधिग्रहण.
  6. अधिग्रहीत डिजिटल स्लाइड छवियाँ Aperio स्पेक्ट्रम डेटाबेस में स्वचालित रूप से अपलोड कर रहे हैं.

4. एक्वा स्वचालित छवि विश्लेषण

  1. स्पेक्ट्रम डेटाबेस में डिजिटल पूरे स्लाइड छवियाँ देखें और पूरे ऊतक और धुंधला हो जाना पैटर्न (ओं) के संदर्भ में ब्याज की ट्यूमर क्षेत्रों एनोटेट.
  2. स्लाइड का चयन करें को डबल अंगूठे क्लिक करके स्पेक्ट्रम डेटाबेस में डिजिटल स्लाइड सूची में से AQUAnalysis का उपयोग कर विश्लेषणनाखून छवि (वैकल्पिक रूप से, चेक बॉक्स छवि के आगे का चयन करें और तब चयन सूची के शीर्ष पर मेनू से 'छवियाँ देखें'). यह स्वचालित रूप से ImageScope सॉफ्टवेयर और रंग ऊतक का नमूना के मर्ज किए गए छवि को खोलता है.
  3. इस सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए प्रदान की गई उपकरण का उपयोग कर छवि नेविगेट.
  4. साथ एच एंड ई (या तो शारीरिक स्लाइड या एक एनोटेट छवि) का प्रयोग, फ्लोरोसेंट छवि पर ब्याज के क्षेत्र एनोटेट. ब्याज के एकाधिक क्षेत्रों, व्यक्ति क्षेत्रों की परिक्रमा, एक एकल नमूने पर चुना जा सकता है. वहाँ भी एक 'नकारात्मक' उपकरण है जो एक चयनित क्षेत्र के भीतर क्षेत्रों (यानी क्षतिग्रस्त ऊतकों, गरीब ऊतक विज्ञान के क्षेत्रों, गैर ट्यूमर क्षेत्रों, मलबे, आदि) को बाहर करने के लिए प्रयोग किया जाता है है.
  5. छवि पर एनोटेशन परत (ओं) में सहेजें.
  6. स्पेक्ट्रम मुख्य मेनू पर लौटें और छवि है कि सिर्फ एनोटेट था करने के लिए अगले चेक बॉक्स का चयन करें. चयन सूची के शीर्ष भर में मेनू पट्टी से 'विश्लेषण'.
  7. विश्लेषण विंडो में जो आ जाएगा, seleसीटी पुल - डाउन मेनू से "HistoRx एक्वा विश्लेषण".
  8. अगर वहाँ एनोटेशन की कई परतें हैं, चेक बक्सों का उपयोग करने के लिए विश्लेषण के लिए उपयुक्त परत (ओं) का चयन करें.
  9. प्रेस 'विश्लेषण' बटन जब शुरू करने के लिए तैयार है.
  10. इस बिंदु पर, एक कम से कम खिड़की सांत्वना Windows कार्यपट्टी में दिखाई देगा. यह स्पेक्ट्रम डेटाबेस से स्थानीय पीसी ('पुल' आपरेशन) के लिए छवियों के हस्तांतरण की प्रगति को प्रदर्शित करेगा.
  11. एक बार डेटा स्थानांतरित कर रहा है, AQUAnalysis का शुभारंभ करेंगे. उपयोगकर्ता तो सॉफ्टवेयर के आंतरिक कार्यों के सभी का उपयोग करने के लिए देखने के लिए, नेविगेट करने के लिए और छवियों का विश्लेषण कर सकते हैं.
  12. स्पेक्ट्रम डेटाबेस से छवि की एनोटेट क्षेत्र 512x512 पिक्सेल छवि टाइल में टूट गया है - जिनमें से प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से रन हो जाएगा.
  13. इस अध्ययन के लिए, एक unsupervised एक्वा स्कोरिंग एल्गोरिथ्म डेटा क्लस्टरिंग के आधार पर, 8 इस्तेमाल किया गया था . इस एल्गोरिथ्म में, एक्वा स्कोर इस प्रकार उत्पन्न कर रहे हैं:
    1. अखिल cytokeratin छवि सीgnal पृष्ठभूमि के ऊपर thresholded है और उन पिक्सल के लिए एक ट्यूमर 'मुखौटा' जो तो बाद की गणना के लिए प्रयोग किया जाता है परिभाषित किया जाता है. उच्च अभिव्यक्ति अखिल cytokeratin पिक्सल भी ट्यूमर कोशिकाओं के cytoplasmic / गैर - परमाणु क्षेत्रों को परिभाषित.
    2. पिक्सेलस DAPI चैनल में उच्च संकेत के साथ कि ट्यूमर मुखौटा के भीतर कर रहे हैं प्रकृति में परमाणु के रूप में पहचाने जाते हैं.
    3. क्लस्टरिंग एल्गोरिथ्म भी पिक्सल है जो या तो DAPI धुंधला हो जाना या cytokeratin अभिव्यक्ति और प्रयास करने के लिए आंशिक रूप से उन्हें विशेषता के लिए परमाणु या cytoplasmic डिब्बों, या पृष्ठभूमि या तो के लिए कम तीव्रता है की जाँच.
    4. एक बार जब सभी पिक्सल ट्यूमर डिब्बों या पृष्ठभूमि के लक्ष्य प्रोटीन (ईआर या HER2) से संकेत की तीव्रता में से एक को सौंपा जाता है तो प्रत्येक और डिब्बों के डिब्बों के आकार के लिए सामान्यीकृत के भीतर गणना है, इस प्रकार एक्वा स्कोर का निर्माण.
    5. छवियाँ है जो पर्याप्त ट्यूमर प्रतिनिधित्व नहीं किया है (के रूप में ले के साथ उन के द्वारा परिभाषित नहीं बने थेएस एस ट्यूमर का प्रतिनिधित्व पिक्सेल के 5% से अधिक). इन क्षेत्रों को भी एक 'अंतिम नतीजे' मूल्य 'असफल' नामक उत्पादन और बाद में सांख्यिकीय विश्लेषण में इस तरह हटाया जा सकता है.
    6. इसके अतिरिक्त, समीक्षा पर, अगर एक ऑपरेटर जो नमूना या इमेजिंग कलाकृतियों (जैसे मुड़ा हुआ ऊतक मलबे,) की वजह से स्कोरिंग के लिए उपयुक्त नहीं थे क्षेत्रों की पहचान, उन क्षेत्रों स्कोरिंग से redacted थे और एक 'अंतिम नतीजे' असफल 'कहा जाता है का उत्पादन.
  14. एक्वा स्कोरिंग के परिणाम ब्याज की एक पूरी ऊतक अनुभाग नमूना के भीतर क्षेत्र में प्रत्येक 512x512 पिक्सेल टाइल के साथ जुड़े अंकों के तालिकाओं हैं. इन फ़ाइलों. सीऍसवी प्रारूप में है, तो बाद में सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

5. सांख्यिकीय विश्लेषण: सभी सांख्यिकीय विश्लेषण SPSS में प्रदर्शन कर रहे हैं (आईबीएम)

  1. जहां संभव हो, बड़े कार्यों के लिए, SPSS वाक्यविन्यास कोड फ़ाइलों (एसपीएस) उत्पन्न करने के लिए डेटा जोड़तोड़ और विश्लेषण चरणों का प्रदर्शन. उदाहरण वाक्यविन्यास कोड पूरक फ़ाइलों के रूप में प्रदान की जाती है.
  2. कहाँ क्षेत्रों के 'असफल' अंतिम नतीजे '(ऊपर देखें) है, SYSMIS, जो संख्यात्मक विश्लेषण से उन्हें हटाता है के रूप में इन मूल्यों को चिह्नित.
  3. सकल एक एकल मास्टर SPSS स्वरूप में डेटा सेट में प्रत्येक मार्कर (ईआर या HER2) के लिए सभी स्लाइड्स के लिए सभी डेटा. बाद के सभी गणना के लिए इस मास्टर फ़ाइल का उपयोग करें.
  4. ईआर या HER2 (अनुपूरक वाक्यविन्यास फ़ाइलों को देखने के) डेटा आगे और मान्य किया गया था और विविधता के सिम्पसन सूचकांक की गणना निम्न प्रकार: एक SPSS वाक्यविन्यास फ़ाइल (प्रत्येक मार्कर के लिए एक का उपयोग:
    1. एक मास्टर विश्लेषणात्मक फ़ाइल उत्पन्न क्रम में मास्टर सेट पहले से उत्पन्न डेटा के संशोधन को रोकने के लिए.
    2. मास्टर कच्चे डेटा और छवियों को उत्पन्न के खिलाफ सेट डेटा मान्य करें.
    3. प्रत्येक नमूना के लिए एक्वा स्कोर (क्षेत्रों की गिनती के लिए सारांश आँकड़ों निर्माण स्कोर, औसत स्कोर, minimu मतलबमीटर स्कोर, अधिकतम स्कोर, और नमूने के लिए अंकों के मानक विचलन).
    4. मूल कच्चे डेटा आउटपुट फाइल के खिलाफ और कच्चे छवि स्कोर डेटा के खिलाफ परिणामों के एक यादृच्छिक नमूना की जाँच करें.
  5. गर्मी नक्शे छवियों (आंकड़े 2 और 3 में दिखाया गया है) उत्पन्न करने के लिए:
    1. 'बिन आठ अलग - अलग स्तरों में' एक्वा स्कोर डेटा (SPSS में 'दृश्य Binning' समारोह का उपयोग करते हुए). ईआर के लिए, परमाणु स्कोर इस्तेमाल किया गया है, HER2 के लिए, cytoplasmic स्कोर इस्तेमाल किया गया.
    2. ऐसी है कि प्रत्येक बिन संपूर्ण डेटा सेट से उपलब्ध मामलों की एक समान प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है डिब्बे निकालें.
    3. SPSS समारोह 'भाजित फ़ाइल ताकि बाद के सभी एक प्रति स्लाइड / नमूना स्तर पर उत्पादन किया जाएगा का उपयोग करें.
    4. अपने एक्स, y निर्देशांक और एक बिन में आवंटित की गई थी इसी मूल्य के साथ रंग (2 आंकड़े और 3 देखें) द्वारा प्रत्येक क्षेत्र (एक 512x512 टाइल करने के लिए इसी) प्लॉट.
  6. विविधता स्कोर उत्पन्न करने के लिए, कोड के लिए एक सिम्पसन उत्पन्न करने के लिए लिखा थाएक्वा स्कोर का उपयोग विविधता के सूचकांक.
    1. विविधता के सिम्पसन सूचकांक, के रूप में यहां इस्तेमाल किया है, के रूप में परिभाषित किया गया है:
      1 समीकरण
      कहाँ N दिए गए नमूने के लिए प्रयोग किया जाता है और n मानकीकृत स्कोर (उत्पादन के रूप में नीचे वर्णित) का एक भी समूह में / स्कोर क्षेत्रों की संख्या है स्कोर / क्षेत्रों की कुल संख्या है.
  7. का प्रयोग करें मास्टर विश्लेषणात्मक फ़ाइल डेटा स्रोत के लिए ऊपर वर्णित है. दिखाए गए उदाहरण में, सभी ईआर गणना परमाणु एक्वा स्कोर और HER2 गणना cytoplasmic एक्वा स्कोर इस्तेमाल किया करते थे. प्रत्येक नमूना / स्लाइड के लिए नीचे गणना प्रदर्शन.
  8. चूंकि प्रतिदीप्ति डेटा विचरण अस्थिरता के अधीन है, कि ऐसे त्रुटि परिमाण तीव्रता के साथ propagates, सभी एक्वा स्कोर करने के लिए लघुगणकीय सामान्य (2 आधार) लागू होते हैं.
  9. इसके अलावा सामान्यीकृत डेटा (लॉग तब्दील) Z-स्कोर (मानक) में बदलना.
    1. Z-स्कोर परिवर्तन की गणना की जाती हैएस प्रकार है: Z = (स्कोर एक्वा - एक नमूना के लिए सभी स्कोर का औसत) / नमूना के लिए अंकों के मानक विचलन. यह शून्य विचलन के मध्य मूल्य के चारों ओर विचलन का वितरण अंकों के वितरण में तब्दील हो.
  10. बिन इन Z स्कोर छह समूहों (<-2, -2 - -1, -1 - 0 0 - 1, 1 - 2> 2) में मान.
  11. प्रत्येक और प्रत्येक बिन के लिए बिन राशि में आवंटित मानों की संख्या की गणना. इस मान का उपयोग करने के लिए, क्षेत्रों की कुल संख्या के साथ साथ, छह सूचकांक के लिए इस्तेमाल किया डिब्बे के प्रत्येक के लिए एक मूल्य की गणना.
  12. इन मूल्यों का योग और विविधता के सूचकांक का उत्पादन एक से घटाना.
  13. विविधता सूचकांक के लिए एक विशेष नमूना माध्य के आसपास स्कोर के प्रसार का एक संकेतक प्रदान करता है. इस प्रकार, उच्च सूचकांक स्कोर का एक व्यापक प्रसार है, या अभिव्यक्ति की वृद्धि की विविधता का संकेत मिलता है. इसके विपरीत, कम सूचकांक, अभिव्यक्ति माप में कम भिन्नता और नमूने में सजातीय अभिव्यक्ति से संकेत मिलता है. यह Figur में सचित्र हैतों 2 और 3.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

अपेक्षाकृत कम tamoxifen और trastuzumab जैसे विषाक्तता एजेंट, के साथ लक्षित चिकित्सा डिम्बग्रंथि के कैंसर के रोगियों के लिए देखभाल के मानक नहीं हैं. वहाँ अच्छा सबूत है कि प्लैटिनम taxane रसायन चिकित्सा पहली पंक्ति के लिए डिम्बग्रंथि के कैंसर 9-13 अन्य कीमोथेरपी regimens से बेहतर है, और जबकि शुरू में रोगियों के 70-80% जवाब, सबसे पतन होगा और उनकी बीमारी से मर जाता है . बायोमार्कर का मापन है जो वैकल्पिक उपचार के लिए प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी हो सकता है प्रत्येक रोगी के लिए individualized चिकित्सा का चयन करने में उपयोगी हो जाएगा और एक ट्यूमर पर कीमोथेरेपी डालती चयन दबाव के बाद से, ट्यूमर कोशिकाओं को जीवित अलग विशेषताओं के अधिकारी और चिकित्सा से पहले ट्यूमर के subpopulation का प्रतिनिधित्व हो सकता है, यह बढ़ाता परिवर्तन इसलिए उपयोगी हो सकता है. हम ईआर और HER2 अभिव्यक्ति orde में कीमोथेरेपी से पहले और बाद डिम्बग्रंथि के कैंसर के नमूनों में हमारी विविधता मानचित्रण दृष्टिकोण लागू है,r अभिव्यक्ति में मात्रात्मक परिवर्तन को मापने के लिए और पहले और बाद चिकित्सा biomarker अभिव्यक्ति के बीच संबंध का आकलन. दोनों ईआर और HER2 व्यक्तिगत ट्यूमर के भीतर चिह्नित विविधता दिखाना है, और कुछ ट्यूमर में, सिम्पसन उपचार के बाद अपेक्षाकृत उच्च कम विविधता विविधता से सूचकांक में परिवर्तन, सिम्पसन सूचकांक स्कोर (आंकड़े 2 और 3 देखें) के कम से प्रतिनिधित्व. यह धारणा है कि clonal साइटोटोक्सिक कीमोथेरेपी के जवाब में चयन होता है का समर्थन करता है, अधिक महत्वपूर्ण बात, इस अवशिष्ट आबादी के खिलाफ लक्षित चिकित्सा का प्रयोग, क्रम में करने के लिए बेहतर कैंसर रोगियों के लिए चिकित्सा निजीकृत शोषण किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 चर आकारिकी दिखा वही डिम्बग्रंथि के कैंसर के विभिन्न क्षेत्रों के Hematoxylin और लाल भामसान रंग दाग photomicrographs. (ए) X40 सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ आकारिकी बदलती के साथ दो ट्यूमर के आसन्न क्षेत्रों से पता चलता है. उच्च शक्ति (दृश्य x20) 0 cytoplasmic समाशोधन और ट्यूमर के ऊपरी भाग (बी) में विकास की एक ठोस स्वरूप के साथ कोशिकाओं को पता चलता है, जबकि ऊतक के निचले हिस्से (सी) और अधिक सजातीय इओसिनोफिलिक cytoplasm और एक इल्लों से भरा हुआ विकास पैटर्न है. इस ट्यूमर, तथापि, आगे प्रबंधन के प्रयोजनों के लिए रक्तोदकीय इल्लों से भरा हुआ histological subtype है के रूप में वर्गीकृत किया जा.

चित्रा 2
चित्रा 2 ईआर cytokeratin सकारात्मक डिम्बग्रंथि के कैंसर ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की विविधता heatmaps (ऊपरी पैनल) पहले और चिकित्सा (कम पैनल) के बाद. .

चित्रा 3
चित्रा 3 HER2 प्रोटीन अभिव्यक्ति cytokeratin सकारात्मक डिम्बग्रंथि के कैंसर ऊतकों में, इससे पहले (ऊपरी पैनल) और के बाद थेरेपी (कम पैनल) की विविधता heatmaps.

Discussion

विधि इस के साथ साथ मानक formalin-तय, आयल एम्बेडेड ट्यूमर सामग्री के histologic वर्गों में आणविक विविधता के परमिट मात्रा का ठहराव का वर्णन किया. विधि एक मूल्य के लिए एक ऊतक अनुभाग में विविधता की डिग्री के लिए आवंटित किया है, तो है कि इस biomarker विकास और विश्लेषण में एक चर के रूप में तो खाते में लिया जाना परमिट. जबकि सामान्य में यह बेहतर है कि ऊतक biomarkers अभिव्यक्ति के लिए सम्मान के साथ सजातीय हैं, ताकि परख कम नमूना त्रुटि या पूर्वाग्रह के लिए अतिसंवेदनशील है, यह कुछ परिस्थितियों में एक पैरामीटर के रूप में विविधता यों उपयोगी हो सकता है. उदाहरण के लिए, के रूप में ईआर और HER2 के लिए उदाहराणदर्शक उदाहरण में दिखाया गया है, आम biomarkers अभिव्यक्ति की काफी विविधता दिखाने के लिए और यह वर्तमान में अज्ञात है कि क्या इस नैदानिक ​​परिणाम या उपचार के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए सम्मान के साथ एक स्वतंत्र शकुन या भविष्य कहनेवाला कारक, क्रमशः का प्रतिनिधित्व करता है. इसी तरह, के रूप में सचित्र, चिकित्सा ही गतिशील बदल सकता हैकोशिकाओं के घटक आबादी, और इसलिए लक्ष्य संवर्धन के माप इलाज के फैसले मार्गदर्शन में उपयोगी हो सकता है.

हालांकि, इस तकनीक एक ही कारक हैं जो पारंपरिक histopathological या biomarker (जैसे immunohistochemical) विश्लेषण सीमा द्वारा सीमित है. परिणाम प्रकार, आकार, और विश्लेषण किया जा रहा ऊतक की गुणवत्ता, और इसलिए एक एकल ऊतक अनुभाग पर निर्भर करता है पूरे ट्यूमर के प्रतिनिधि नहीं हो सकता. दरअसल, सिम्पसन सूचकांक अनावश्यक रूप से ऊतकों का आकार (कब्जा कर लिया और मापा एक्वा स्कोर तख्ते की संख्या) द्वारा पक्षपाती किया जा सकता है. मापा जा रहा है epitopes के प्रतिरक्षाजनकता बेकाबू पूर्व विश्लेषणात्मक कारक हैं जो artifactually ऊतक अनुभाग (जैसे ठंड ischemia समय, या निर्धारण की लंबाई, और बढ़त विरूपण साक्ष्य के रूप में) भर में उनकी अभिव्यक्ति में परिवर्तन के अधीन किया जा सकता है. यह विशेष रूप से phospho - epitopes है, जो बेहद अस्थिर 14, 15 के लिए एक समस्या है . इसलिए बेहतर अनुकूल तकनीक हो सकता हैलकीर के बजाय नमूनों छोटे बायोप्सी, और सिर्फ एक के बजाय एकाधिक अनुभागों पर प्रदर्शन. अंत में, 3 डी इमेजिंग तकनीक के लिए एक बेहतर इस पैरामीटर यों अवसर की पेशकश कर सकते हैं.

तकनीक के रूप में प्रस्तुत भी cytokeratin मास्किंग मिलान की अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता के रूप में जैविक कारकों द्वारा सीमित किया जा सकता है है. उन के कैंसर में यह विशेष चिंता का विषय हो सकता है, डिम्बग्रंथि और स्तन कैंसर, जो उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT) से गुजरना कर रहे हैं या गैर उपकला घटकों या स्टेम सेल 16 के लिए समृद्ध सहित, के रूप में हाल ही में किया गया है के लिए होते दिखाया कीमोथेरेपी - 17 इन विट्रो में और 18 उपचार के लिए जवाब में स्तन कैंसर के रोगियों में डिम्बग्रंथि के कैंसर का इलाज किया. इस सीमा वैकल्पिक मास्किंग (या एंटीबॉडी के कॉकटेल) cytokeratin प्लस vimentin, जो 16 EMT में upregulated है जैसे एंटीबॉडी, का उपयोग कर दूर किया जा सकता है. इसके अलावा, के बाद से ऊतक के अन्य घटकों (mic) जैसे fibroblasts या संवहनी endothelial कोशिकाओं, roenvironment भी तेजी से जैविक उपचार द्वारा लक्षित कर रहे हैं किया जा रहा है, तकनीक भी करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है इन घटकों का स्कोर PECAM / CD31 के रूप में ब्याज की, डिब्बों के लिए विशेष मास्क का उपयोग करने के लिए संवहनी endothelial कोशिकाओं के लिए दाग .

हालांकि सिम्पसन सूचकांक के अनुकूलन वर्तमान प्रोटोकॉल में अपनी सादगी के कारण विविधता का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया है, केंद्रीय प्रवृत्ति के सरल माप जैसे विविधता के अन्य उपाय हो सकता है, इस्तेमाल किया जा सकता (मतलब, विचरण, मंझला, आदि). इसके अतिरिक्त, सिम्पसन सूचकांक गणना करने के लिए बेहतर एक विशेष परीक्षण आबादी के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है. Z-स्कोर परिवर्तनों का उपयोग स्कोरिंग कई मार्करों के लिए लागू होने के बाद से विविधता किसी डेटा सेट के लिए यह मतलब चारों ओर विचलन पर आधारित है की अनुमति देता है. हालांकि, स्कोरिंग के समग्र श्रृंखला परिवर्तन के इस प्रकार में सीमित किया जा सकता है है. कुछ डिजाइन बेहतर उपयुक्त हो सकता हैबस एक विशेष मार्कर सेट के सभी नमूनों के लिए वास्तविक एक्वा स्कोर बिन. डिब्बे और cutoffs की संख्या का चयन मूल्यों जो परिणाम कर सकते हैं की रेंज में भी एक सीमा है और वैकल्पिक प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

हम ईआर और HER2 उम्मीदवार बायोमार्कर के रूप में वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया है, क्योंकि वे पहले से ही क्लिनिक में इस्तेमाल किया जाता है, लक्षित चिकित्सा की प्रभावकारिता के संबंध के साथ प्रासंगिक नैदानिक ​​सवालों के जवाब में मदद करने के लिए, और कर रहे हैं में काफी विविधता और परिवर्तन प्रदर्शन के लिए जाना जाता प्राथमिक और दूर 19 रोग. हालांकि, विविधता के इष्टतम मार्कर के लिए निर्धारित किया है. अन्य संभावनाओं clonality के पहले अंतराप्रावस्था मछली 20 अध्ययनों में इस्तेमाल किया उन जैसे cytogenetic मार्कर, शामिल हो सकता है . बड़ी, अच्छी तरह से एनोटेट नैदानिक ​​साथियों या नैदानिक ​​परीक्षणों में आगे की मान्यता दृष्टिकोण की आवश्यकता है क्रम में आगे कैंसर जीव विज्ञान में इस पैरामीटर की प्रासंगिकता को स्थापित है.

Disclosures

जे.सी., एमजी, मुख्य न्यायाधीश, और सीएस HistoRx के कर्मचारियों, Inc हैं

Acknowledgments

, इस काम के हिस्से में स्कॉटलैंड के अनुदान परिषद (अनुदान संख्या HR07005 द्वारा समर्थित किया गया http://www.sfc.ac.uk/ , मेडिकल रिसर्च स्कॉटलैंड () http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), कैंसर रिसर्च यूके प्रायोगिक कैंसर चिकित्सा (केन्द्र http://www.cancerresearchuk.org/ ), और निर्णायक स्तन कैंसर ( http://breakthrough.org.uk/ ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ScanScope FL Aperio Technologies ScanScope FL Used as equipped from vendor
Spectrum Aperio Technologies Spectrum Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure.
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment HistoRx V2.3 The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum.
HER2 Dako A0485 1 in 400 dilution
mouse anti-pan cytokeratin Dako M3515 1 in 50 dilution
Antibody diluent Dako S0809
Envision goat-rabbit HRP Dako K4003
Protein block Dako X0909
Goat anti-mouse Alexa555 Invitrogen A21422
DAPI mounting medium Invitrogen P36931
Cy5 Tyramide HistoRx AQ-EMR1-00001
Sequenza Immunostaining Center Thermo Fisher Scientific, Inc. 73300001 Used here for bench-top immunofluorescence staining

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References

  1. Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution. Histopathology. 58, 486-497 (2011).
  2. Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
  3. Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution. Histopathology. 58, 486-497 (2011).
  4. Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
  5. Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots. ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).
  6. Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).
  7. Simpson, E. H. Measurement of biodiversity. Nature. 163, 688-68 (1949).
  8. Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).
  9. Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial. Lancet. 360, 505-515 (2002).
  10. McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer. N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).
  11. Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study. J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).
  12. Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results. J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).
  13. Cannistra, S. A. Cancer of the ovary. N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).
  14. Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).
  15. Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).
  16. Klymkowsky, M. W., Savagner, P. Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe. Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).
  17. Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells. Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).
  18. Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).
  19. Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases. Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).
  20. Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis. J. Pathol. 221, 308-319 (2010).

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