Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices. J. Vis. Exp. (59), e3345, doi:10.3791/3345 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

גירויים חזותיים מזוהים והועברה על פני טווח דינמי רחב של עוצמות אור ושינויים תדירות על ידי נוירונים מתמחים הרשתית החולייתנים. שתי כיתות של נוירונים, קולטני האור ברשתית תאים דו קוטבית, לעשות זאת באמצעות סרט מסוג אזורים פעילים, המאפשרים שחרור הנוירוטרנסמיטר מתמשכת תפוקה גבוהה על פני תקופות זמן ארוכות. על סוג המעורבות דו קוטבית (MB) תא מסופי ברשתית דגי זהב, אשר depolarize לגירויים אור ולקבל מוט מעורבת קלט חרוט photoreceptor, מתאימים ללימוד סרט מסוג סינפסות הן בשל גודל גדול שלהם (~ 10-12 מיקרומטר קוטר) וכן קשרים סינפטיים רבים שלהם לרוחב והדדית עם דנדריטים תא amacrine. גישה ישירה מסופי Mb דו קוטבית תא פרוסות דג זהב רשתית עם טכניקה טלאי-clamp מאפשר מדידת Ca presynaptic 2 + זרמים, קיבול שינויים קרום, משוב הדדי עיכוב סינפטי בתיווכו של GABA <תת> A ו-C קולטני GABA הביע על המסופים. Presynaptic קיבול הממברנה מדידות של exocytosis לאפשר אחד כדי ללמוד את הפלסטיות לטווח קצר של שחרור הנוירוטרנסמיטר מעוררים 14,15. בנוסף, גמישות לטווח הקצר ולטווח הארוך של שחרור נוירוטרנסמיטר מדכא מתאי amacrine יכול להיות גם נחקר על ידי הקלטות של עיכוב משוב הדדי להגיע למסוף Mb 21. במהלך פרקי זמן קצרים (למשל 10 ~ ים), משוב GABAergic עיכוב הדדי מתאי amacrine עובר לזווג הדופק דיכאון דרך דלדול בריכה GABA שלפוחית ​​11. הדינמיקה הסינפטי של הרשתית microcircuits בשכבת plexiform הפנימי של הרשתית כך ניתן ללמוד באופן ישיר.

הטכניקה המוח פרוסה הוצג למעלה מ 40 שנה אבל הוא עדיין מאוד שימושי עבור חקירת התכונות החשמליות של נוירונים, הן סומה תא בודד, יחיד או דנדריט האקסון, ואת מ 'icrocircuit ברמה הסינפטית 19. רקמות כי הם קטנים מדי כדי להיות מודבק ישירות על גבי התא חיתוך לעיתים קרובות מוטבעים הראשון אגר (או להציב על גבי נייר פילטר) ופרוסים אז 20, 23, 18, ​​9. בסרטון הזה, אנו מעסיקים את הטכניקה מראש הטבעה אגר באמצעות הרשתית דגי זהב. חלק מסופי ענק דו קוטבית תא פרוסות שלנו הרשתית דגי זהב הם axotomized (האקסון לחתוך) במהלך ההליך חיתוך. זה מאפשר לנו לבודד אחד presynaptic מסוף תשומות עצב, כי הקלטה של ​​מסופי axotomized כולל את האותות מתא סומה, דנדריטים. לחלופין, אפשר גם להקליט מתאי Mb שלמים דו קוטבית, על ידי הקלטה של ​​מסופים המחוברים אקסונים שלא נותקו במהלך ההליך חיתוך. באופן כללי, השימוש בפרוטוקול זה הניסוי יסייעו לימודים של פיסיולוגית הסינפטי ברשתית, ניתוח Microcircuit פונקציונלי, שידור הסינפטי ב סינפסות סרט.

Protocol

1. פתרונות חיצוניים ופנימיים

  1. הכן פתרון חיתוך (סידן נמוכה) מפתרון מניות 10x ולהוסיף MgCl 2, CaCl 2, ו-D-גלוקוז יומי. הפתרון הסופי מורכב 1x (מ"מ): 119 NaCl, KCl 2.5, 3.2 MgCl 2, 0.25 CaCl 2, 12 D-גלוקוז, 0.2 L-חומצה אסקורבית, 12 HEPES. הגדר את ה-pH עד 7.4 (עם NaOH), ולהתאים את osmolarity mOsm 260 (באמצעות H 2 O פתרון מניות 10x).
  2. לשקול את 3% אגר gelling בטמפרטורה נמוכה (agarose סוג ז', A0701, Sigma, Rieke, 2001) ומערבבים עם פתרון חותך. מחממים את הפתרון אגר המכיל במיקרוגל במשך 1-2 דקות, או עד שהוא נמס לגמרי, דגירה אגר באמבט מים (30-33 ° C) כדי למנוע את מיצוק מהיר (המעבר ג'ל טמפרטורה: 26 ± 2 ° ג).
  3. הכן פתרון הקלטה (סידן נורמלי) מפתרון מניות 10x ולהוסיף MgCl 2, CaCl 2, ו-D-גלוקוז יומי. הפתרון הסופי 1x consists של (מ"מ): 100 NaCl, KCl 2.5, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 0.2 L-חומצה אסקורבית, 2.5 CaCl 2, 12 D-גלוקוז. לאחר מבעבע הפתרון 95% O CO 2 / 5% 2 (carbogen) למשך 5-10 דקות, כדי להגדיר את ה-pH 7.4 (עם NaOH), ולהתאים את osmolarity mOsm 260 (באמצעות H 2 O פתרון מניות 10x).
  4. Aliquots (1 מ"ל כל אחד) של פתרונות פנימיים פיפטה מוכנים מראש ולאחסן במקפיא (-20 ° C). שני פתרונות פיפטה פנימיים משמשים בדרך כלל כדי לבודד סידן דו קוטבית תא זרמים (מ"מ):
    1. 40 CsCl, 60 Cs-gluconate, 10 tetraethylammonium (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 Mg-ATP, GTP Na-1, ו -2 EGTA. התאם את ה-pH 7.2 (עם CsOH) ו osmolarity מוגדר mOsm 250. זה פתרון כלוריד גבוה פנימי בדרך כלל מספק התנגדות נמוכה סדרת הקלטות (תנאים טובים יותר מהדק מתח) ומעלה זרמים postsynaptic מעכבות (IPSCs) בשעה פוטנציאל המנוחה קרום תא דו קוטבית של mV -60.
    2. 95 Cs-gluconate, 10 TEA-Cl, 25 HEPES, 3 Mg-ATP, 0.5 Na-GTP, ו 0.5 EGTA. התאם את ה-pH 7.2 (עם CsOH), ולהגדיר osmolarity ל 250 mOsm 22. פתרון זה נמוך EGTA פנימי בדרך כלל מוביל קיבול גבוה שינויים קרום שהושרו על ידי depolarizing פולסים צעד ובכך מאפשר מחקרים של דלדול שלפוחית ​​בריכה לטווח קצר דיכאון.

2. Patch-clamp פיפטה אלקטרודות

  1. הכן חומה עבה (1.5 מ"מ קוטר חיצוני) בורוסיליקט זכוכית (1B150F-4; מכשירים Precision העולם, סרסוטה, פלורידה) ולמשוך את pipettes התיקון בעזרת חולץ אנכי (Narishige, PP830, טוקיו, יפן). התנגדויות פיפטה פתוח קצה תיקון בפתרונות הקלטה הם 7-8 MΩ כאשר פיפטה מתמלא פתרון פיפטה פנימי מס '1.
  2. סמל התיקון, פיפטה שווה, מקצה לרמה של הפיר המגיע למחזיק פיפטה, בשעווה שיניים (Cavex, במערב צ'סטר, פנסילבניה). זה יהיה למזער את קיבול פיפטה ורעש חשמלי ולאפשרמדויק יותר נמוך קיבול מדידות רעש. קיבול פיפטה נמוך גם עוזר הפיצוי C-מהירה (קיבול מהיר) אלקטרוניים של EPC-9 (או EPC-10) מהדק מגבר התיקון.

3. הכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית

  1. בחר דג זהב (Carassius auratus: 8-16 ס"מ) ומניחים בתוך דלי מכוסה בחדר חשוך למשך 30 דקות של הסתגלות כהה. לאחר הרדמה, להרדים את דג הזהב מסומם על ידי עריפת ראש מהירה פעמיים pithing של חוט השדרה ובגזע המוח. לאחר מכן להסיר את העיניים עם קצה מעוגל, מספריים קצה מעוקל-פינצטה. נהלים אלה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) בבית אורגון לבריאות ומדע באוניברסיטת.
  2. Hemisect כל עין ידי קיצוץ שווה סביב החלק הקדמי של העין עם מספריים באביב (15003-08, כלי המדע פיין; ליזום לחתוך על ידי ניקוב עם טיפים מספריים), והמקום eyecups בפתרון פרוסה מצונן (סידן נמוכה). אם necessary, להסיר את העדשה עם פינצטה (העדשה בדרך כלל לנתק את החלק הקדמי של העין). הסר את הרשתית עם אפיתל הפיגמנט מחובר באמצעות זוג מלקחיים 45 ° קצה זוויתי קנס (11251-35, כלי המדע פיין) לקלף הרשתית הרחק עיינית, מתקדם לאט סביב · ככל 360 מלא. סבר או לחתוך את עצב הראייה עם מלקחיים או קנס או מספריים האביב. הסר את הרשתית בעדינות עם שילוב של זווית מלקחיים טיפ נאה יניקה שימושית פסטר שונה פיפטה או להעביר פיפטה (טיפ גדול). שימוש בזווית מלקחיים טיפ מצוין כדי להסיר את שארית אפיתל הפיגמנט מחובר הרשתית. פני הרשתית ניקה בריא אמור להופיע כהה, חלקה בצבע אדום. עבור הסרה מלאה של כל התאים אפיתל הפיגמנט הכהה כהה להתאים את הרשתית במשך שעה 1 (8, 1992).
  3. פנקו את הרשתית מבודד עם ~ 0.03% (wt / כרך; ~ 0.36 מ"ג / מ"ל ב 1x פתרון פרוסה) hyaluronidase (3; H6254, Sigma) 15-30 דקות בחדרטמפרטורה (20-23 ° C) כדי להסיר הומור מהשירותים. במהלך הדגירה זה, אתה יכול להכין קר כקרח פתרון פרוסה.
  4. חותכים חתיכה מלבנית של הרשתית (~ 2x2 מ"מ, המכיל את עובי מלא של הרשתית) על ידי הסרת קצוות מעוגלים עם קטע קטן של סכין גילוח (Personna, פיפיות, לנקות עם 70% אתנול ו - H 2 O) המחובר את גופתו של מזרק פלסטיק 1 מ"ל, ולהעביר את היצירה רשתית למיכל קטן מלא פתרון אגר (שהוכנו (1.2)). נסו לצמצם את כמות הפתרון סביב הרשתית כפי שהוא אגר להציב לתוך הנוזל. לטבול בתמיסה ישירות קר כקרח פרוסה (שהוכנו (3.3)) כדי לחזק את אגר 20, 18, ​​9. אנו משתמשים במיכל קטן, בעבודת יד. בקצרה, שפופרת קטנה, גלילי (Fisherbrand, מדגם פוליאתילן בקבוקונים 2.5 מ"ל, 03-338-1B) נחתך בשני קצותיו וחתום עם Parafilm (PM-996, אריזות פלסטיק Pechiney) טלאים.
  5. חותכים את גוש אגר מוצק לתוך 1x1x1 ס"מ קובייה המכילה את נתח מלבני של הרשתית.
  6. מעבירים את גוש לתא פרוסה ודבק בו על פני השטח של צלחת חיתוך. החדר פרוסה מראש מקורר במקפיא (-20 ° C). חותכים את גוש לתוך פרוסות עבות 200-250 מיקרומטר באמצעות מבצעה Vibratome (VT1000S או VT 1200S, לייקה) בתמיסה קרים כקרח פרוסה. סך של 5 to10 פרוסות ניתן להשיג, שהם קיימא כ -5 עד 6 שעות.
  7. העברה אחת הפרוסות לתא הקלטה. מניחים רשת של חוטי ניילון דבוק מסגרת בצורת פרסה פלטינה 19 על גבי פרוסה, ואת perfuse ברציפות (קצב של 1-2 מ"ל לדקה) עם פתרון הקלטה מבעבע עם 95% O 2 / 5% CO 2 (carbogen ).

צרות הירי:

אם חתיכת הרשתית מוטבע לחסום את אגר מנותק או יוצא אגר במהלך חיתוך, ניתן להגדיל את עובי פרוסת מ 200 מיקרומטר עד 300 מיקרומטר במרווחים של 20 מיקרומטר. גם לנסות לצמצם את כמות הפתרון סביב הרשתית כפי שהוא מועבר והניח לתוך אגר את הנוזל על ידי מתחנף פתרון נוסף עם טיפ מגולגל בנייר "Kimwipe". דרך נוספת להימנע מבעיה זו היא להקטין את גודל פיסת רשתית להציב תחילה אגר. בגלל ההומור זגוגי אוסר אגר מן מלא הצמדת היצירה ברשתית, יתכן שיהיה צורך לבצע hyaluronidase טריים או להתאים את זמן הדגירה (שלב (3.3)).

4. זיהוי של המסוף הסינפטי תא דו קוטבית ב פרוסת רשתית

  1. מקם את פרוסת הרשתית מתחת למיקרוסקופ זקוף (למשל BX51WI, אולימפוס). אנו רואים את הפרוסה הרשתית עם הפרעה אינפרא אדום ההפרש לעומת זאת (IR-DIC) אופטיקה דרך מטרה מים טבילה 60x (NA 0.90, אולימפוס) ו - מצלמת CCD (XC-75, Sony). הפלט של המצלמה CCD נשלח בקר המצלמה (C2400, Hamamatsu) עבור שיפור לעומת לפני להדמיה על סוני אנלוגי 13 "black לבן לפקח. המיקרוסקופ הוא רכוב על הבמה תרגום XY, ואת חדר הקלטה מושם על 14 במה קבועה.
  2. מצא או שלם axotomized (האקסון לחתוך) מסופי דו קוטבי התא, אשר ניתן לזהות על ידי גודלם, הצורה, ואת המיקום של הפרוסה (איור 1). מסופי Axotomized שלמים יכולים גם להיות מכובדת על ידי בחינה של capacitative שלהם פעמים חולף ריקבון הנוכחי (דועך מעריכית לעומת פעמיים מעריכי בודד, בהתאמה) Ca 2 + זרמים (איור 2: 12, 14, 15). מסופי Mb ממוקמות בשכבת הפרוקסימלי ביותר sublamina ב (ON מסוג שכבה, הסמוך שכבה תא גנגליון) בשכבת plexiform הפנימי של הרשתית דגי זהב. מסופי Mb, עם משטח משעמם שלהם מראה שטוח, ניתן להבחין בקלות בין הגנגליון ו somas amacrine העקורים, אשר מופיעים שלב בהיר כדורית. יתר על כן, שפת מסופי Mb מכוסה גבוההצפיפות של קשרים סינפטיים, ונראה מחוספס סדיר בהשוואה, משטחים חלקים נקי של הגנגליון והתאים amacrine (איור 1a-c). Axotomized מסופי Mb להופיע עגול עגול סמוך (איור 1 ג'), בעוד מסופי שלם להופיע אליפטי ומתח, לעיתים קרובות עם סוף צבט ומצביע לעבר שכבת הגרעין הפנימי של הרשתית (איור 1 א, ב).
  3. מסופי פגומים או לא בריא בדרך כלל נראים נפוחים להציג מספר מבנים גרעיניים קטנים על פני השטח. אפשר אולי לקבל חותמת GΩ על מסופים אלה, אך הם עלולים להיקרע זמן קצר לאחר הפריצה. סימנים אחרים של מסופי בריא כוללים חלול, לעומת המראה ו / או בהירות זהה הפרוסה מסביב, ולפעמים המיקום על פני השטח של הפרוסה. ניתן להקליט הן מסופי בריא עמוק הפרוסה (יתרון: המעגלים הסינפטי שלמים יותר) וגם סמוך לפני השטח של הפרוסה (עו"דantage: גישה מהירה יותר לתרופות perfused בפתרון חיצוניים; קל לאטום).

5. הקלטות אלקטרו ו - Ca 2 + הדמיה

  1. באמצעות מזרק עם קצה מסנן 0.2 מיקרומטר (Nalgene), למלא את פיפטה תיקון זכוכית עם פתרון פנימי לרמה 1-2 ס"מ מהחלק האחורי של פיפטה. לאחר הסרת בועות אוויר מהקצה, לאבטח את פיפטה של ​​המחזיק, להפעיל לחץ חיובי (1.2-1.6 psi), והניעו אותו לכיוון הטרמינל ממוקד באמצעות micromanipulator (MPC-200, מכשיר סאטר). תוך כדי תנועה את קצה מטה דרך פרוסה, הזז את פיפטה בכיוון גורף לרוחב כדי להבטיח את הפרוסה לא נמשך יחד עם הטיפ.
  2. הזיזו את קצה פיפטה סביב הטרמינל כדי לנקות את משטח הממברנה. דחפו את קצה מטה על הקצה של המסוף כדי ליצור גומה (הכניסה), וכן לשחרר את הלחץ החיובי. אם חותם GΩ לא צורה באופן מיידי, להפעיל לחץ שלילי קל. לאחר חותם GΩ, לעבור למצב על תאים ההקלטה של ​​המגבר מהדק EPC-9 תיקון ולשנות את הפוטנציאל האחזקות -60 או -70 mV. החלת ה-C-מהירה (קיבול מהיר) תיקון, לחכות החותם לייצב GΩ בין 5-10 ולאחר מכן קרע את הממברנה עם יניקה, חד ועדין מיושם על ידי הפה כדי לקבוע את התצורה של כל תא ההקלטה. אם התצורה כל תא כבר נקבעה כראוי, ההתנגדות סדרת יהיה בין 14-30 MΩ. התנגדות קלט יהיה 200-500 MΩ עבור מסופי שלם GΩ 1-3 עבור מסופי axotomized 14.
  3. שים לב חולף זרם קיבולי (איור 2a ו-2c), להבחין בין מסופי תא שלם axotomized דו קוטבית. מסופי Mb פגוע axotomized יש קרום הבסיס קיבול של pF 9-16 ו 3-8 pF, בהתאמה.
  4. החלת 200 ms-clamp מתח משך צעד מ -70 ל mV 0 למסוף Mb axotomized. זה יאפשרמדידה ישירה של גדול (~ 200-600 רש"פ), מבודד פנימה Ca 2 + זרמים מופעל על ידי פתיחת מתח תלויי סוג L-Ca 2 + תעלות (איור 2b). במקביל, אחד מסוגל לפקח על קפיצה קיבול שנגרמו exocytosis של שלפוחית ​​סינפטית, ואת מהירה, pH בתיווך עיכוב של Ca 2 + הנוכחי העוקב exocytosis 15, ומשוב GABAergic עיכוב הדדי (איור 3c, 22). אם אחד התיקונים מסוף שלם Mb דו קוטבית תא התוצאה תהיה כפי שמוצג באיור 2 ג ו - 2. אין Ca 2 + זרמים להבחין הם נצפו בגלל זרמים גדולים "דליפה" בשל הפער צימוד לצומת של דנדריטים של תאים דו קוטבית Mb 1.
  5. קיבול שינויים ממברנה ניתן על ידי שלילת קוטביות עורר צעד מן הפוטנציאל החזקת mV -70 עד 0 mV באמצעות "סינוס + DC" השיטה של זמן לפתור מדידות קיבול הממברנה 6. קיבול קופץ ממברנה מצביעים על שילוב של שלפוחית ​​סינפטית עם קרום הפלזמה. פקודה 2 קילוהרץ מתח סינוסי-clamp (30 mV שיא אל שיא) נוספה פוטנציאל החזקת mV -70. הנוכחי ההקלטה נותח בשתי זוויות שלב אורתוגונליים ידי אמולציה-9-EPC תיקון מהדק מגבר תוכנה של נעילה ב מגבר (HEKA, Lambrecht, גרמניה). בכל הטרמינל שלם של איור 2, בתדירות גבוהה (2 קילוהרץ) גבולות גירוי סינוסי הקיבול קרום כי הוא ניתח את קצות מסוף האקסון, אשר יש קיבול ס"מ הבסיס ~ 6.8 pF. הממברנה של גוף התא, דנדריטים של תא דו קוטבית מסוננים ולכן על ידי תדירות גבוהה מתח-clamp sinewave 13.
  6. עבור Ca 2 + הדמיה ניסויים, לערבב היטב את הפתרון פנימי פיפטה תיקון עם Ca 2 + רגיש צבע פלואורסצנטי (למשל אורגון גרין 488 BAPTA-1 (100-200 מיקרומטר, O-6806, Invitrogen)) וחזור על פרוטוקול מ 50.1-5.5. זה יאפשר אחד לשלב דימות פלואורסצנטי הקלטה אלקטרו. לדוגמה, ניתן התמונה Ca 2 + חולף הקשורים צעד ms 200 מ -70 עד 0 mV את הנספחים קטן telodendria של הטרמינל Mb (איור 3 א, ב). שילבנו מיקרוסקופ זקוף שלנו אולימפוס עם לייזר דיסק מערכת ספינינג מיקרוסקופ confocal (CSU-X1, Yokogawa). מיקרוסקופ confocal משתמש 488 nm ו 561 nm לייזר קווי כי הם מווסתת על ידי מסנן acousto אופטיים מתכונן. נתונים נרכשים באמצעות Slidebook תוכנה (3i; Intelligent מכשירי הדמיה). לפרטים נוספים על טכניקות הדמיה סידן באמצעות נוירונים ברשתית לראות דגי זהב 24, 17, 3.

צרות הירי:

אם אחד נכשל לעתים קרובות להקים תצורה כל תא, גם לאחר היווצרות חותם GΩ יציב, זה עשוי להיות מועיל כדי להפחית את הלחץ השלילי משמש לנקב את מסוף אותיmbrane. זה יכול להיות גם במקרה זה הלחץ יניקה אופטימלי להקמת תצורה כל תא משתנה כפונקציה של עקמומיות קרום (סומה> מסוף). אפשר גם להשתמש בפרוטוקול zap (Amplitude: 400 mV, משך: 100 μs) כדי להזין את תצורת כל תא, לבד או בשילוב עם הדופק חדה של לחץ שלילי. מצאנו את פרוטוקול zap להיות שימושי במיוחד עבור פריצה בעת שימוש קצה פיפטה עם התנגדות אמבטיה העולה על 12 MΩ.

6. נציג תוצאות

איור 1
באיור 1. זיהוי מסופי Mb דו קוטבית תא פרוסות דג זהב הרשתית. (AC) IR-DIC תמונות של מסופי Mb דו קוטבי התא. אנחנו יכולים לזהות מסופי axotomized סביר (האקסון לחתוך) ושלמה בתמונה IR-DIC. מסוף axotomized נראה עגול עגול, כפי שמוצג גבעוד מסוף שלם סביר יותר להופיע אליפטי, כפי שמוצג ב ו. סיווג זה יכול להיות מאושרת על ידי מדידת קיבול זמני (ראה איור 2) או לפי שיטת מילוי צבע - ו). חצים אדומים ציינו את המיקום של הצומת בין האקסון ואת מסוף האקסון עבור מסופי שלמים ב ו. קו מקווקו אדום הצביע על קווי המתאר של מסופי Mb דו קוטבית התא. (Df). תמונות פלואורסצנטי של מסופי Mb דו קוטבית תא עם האקסון שלם (ד), האקסון לחתוך חלקית (ה), או האקסון יוסר לחלוטין (ו). אלקסה 555 (A20501MP, Invitrogen) צבע פלואורסצנטי התמלא פתרון פנימי לפני ההקלטה. מיד לאחר ההקלטה תיקון-clamp, הפרוסה רשתית הועבר לתוך% 4 (wt / כרך) paraformaldehyde (P6148, Sigma) בתמיסה חיץ פוספט (70,013, GIBCO) ו מודגרות עבור 30דקות. פרוסות היו רכובים על גבי שקופיות Superfrost (פישר סיינטיפיק) במדיום הרכבה מימית עם אנטי דהייה סוכנים (Biomeda קורפ). אלקסה המכיל 555 Mb מסופי דו קוטבית תא נתפסו עם קו לייזר 555 ננומטר (אדום) באמצעות אובייקטיבי 40X מים טבילה על מיקרוסקופ לייזר סורק confocal (LSM 710, Carl Zeiss). הערה נוכחותו של קטן הנספחים telodendria בולטות מן מסופי האקסון (חיצים כחולים). בר סולם עולה 10 מיקרומטר - ו). INL: שכבת הגרעין הפנימי, IPL: פנימי plexiform, שכבת GCL: גנגליון שכבת התאים.

איור 2
באיור 2. התכונות החשמליות של מסופי Mb axotomized שלמים דו קוטבית התא. (א, ג) בתגובה הנוכחית חלוף hyperpolarization מופעל על ידי מתח-clamp צעד מן הפוטנציאל החזקת mV -60 ל -70 mV. התגובה הנוכחית קצרה צעד -10 מתח-clamp mVיכול לגרום: 1) ריקבון אחד מהיר הנוכחית מעריכי עם עמידות גבוהה קלט -70 mV (מעיד על מסוף axotomized; פאנל), או 2) ריקבון פעמיים מעריכי בהתנגדות קלט נמוך ב -70 mV (מעיד על מסוף שלם; לוח ג: ראה גם 12, 14, 15). (ב, ד) Ca 2 + זרמים קיבול קופץ קרום היו מעוררים על ידי שלילת קוטביות צעד מ -70 עד 0 mV. זמן נפתרה מדידות קיבול הממברנה להשתמש גירוי 2-kHz sinewave על גבי הפוטנציאל מחזיק מנוחה של -70 mV 6. זכר אדום הוא הערך הממוצע של נקודות הנתונים קיבול. שימו לב לקפוץ קיבול באיור 2b ו 2d הן שוות כ 200 ואילך.

איור 3
באיור 3. מדידה ישירה של Ca 2 + הדמיה אותות, exocytosis, ומשוב מעכבות ב Mב דו קוטבית מסוף התא. (א) עלייה חולפות Ca 2 + ריכוז telodendria של מסוף Mb הופעל על ידי שלילת קוטביות מתח-clamp צעד מ -70 עד 0 mV עבור 200 ms (חץ). אורגון גרין 488 BAPTA-1 (100 מיקרומטר), 2 Ca + אינדיקטור צבע, נכלל פיפטה את התיקון. (ב) תמונה הקרינה מקבילים של telodendria Mb (אזור של אינטרס מסומן על ידי קו מקווקו אדום). (ג) לטווח קצר דיכאון הסינפטי של שחרור הנוירוטרנסמיטר (exocytosis). קיבול Ca 2 + זרמים (באמצע זכר) וכן קרום (זכר התחתון) עורר על ידי זוג 20 depolarizations ms ל 0 mV (זכר העליון; 200 מילישניות בין הדופק אינטרוולים). החץ מצביע על השפעה של פרוטונים exocytosed על Ca 2 + שוטפים גם עיכוב GABAergic משוב הדדי בין תאים שכנים amacrine 15, 21. ראוי לציין, כי עיכוב פרוטון בתיווך של Ca 2 + הנוכחי וגם במודלים של GABמשוב Aergic עיכוב הדדי נוכחים רק בתגובה depolarizing הראשון, יש גם לקפוץ קיבול עקב exocytosis של שלפוחית ​​סינפטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלב קריטי וקשה בפרוטוקול שלנו היא העברת היצירה של הרשתית לתוך הפתרון אגר (פרוטוקול 3.4). יש צורך להסיר בזהירות את ההומור זגוגי פתרון פרוסה שיורית מן היצירה רשתית ולהעביר אותו ללא עיוות או כיפוף. כדי להשיג זאת, אנו משתמשים מרית קטנה (21-401-25B, Fisherbrand) עם קצה כפוף לטופס 90 ° זווית, יחד עם מלקחיים קצה זוויתי (11251-35, כלי המדע פיין), כדי למקם את הרשתית חתיכת לאורך כל תהליך ההעברה פתרון פרוסה. פתרון שיורית פרוסה על פרוסת את המרית הרשתית ניתן להסיר על ידי להיזהר מספיגה של פני השטח עם פינת Kimwipes מקופל או מגולגל (קימברלי קלארק).

דרך נוספת נפוצה להכין פרוסות רשתית רוחבי הוא מסנן נייר מבוססי פרוטוקול 23. בקיצור, חתיכת הפוכה של הרשתית כולה מחוברת חתיכת מלבן של הדיסק לסנן Millipore (תא גנגליון נחאה נגד העיתון לסנן, שכבת photoreceptor פונה כלפי מעלה) וחותכים 250 מיקרומטר פרוסות עבות עם "אצבע" ידני אנכי מבצעה (למשל Narishige ST-20). אנו מוצאים כי את היתרונות של פרוטוקול מבוססי נייר סינון כוללים photoreceptors בריא יחס גידול של axotomized אל מסופי Mb ללא פגע. כך אנו משתמשים בשיטה זו הנייר לסנן לעורר תגובות אור עורר מן מסופי Mb בודד מוטבע פרוסות הרשתית.

היתרונות של פרוטוקול שלנו אגר מבוסס על פרוטוקול מבוססי נייר סינון הן כי 1) את הפרוסה רשתית המיוצר שטוח, אפילו, ניזוק יחסית עם הפרדה ברורה בין שכבות הרשתית, המאפשר תיקון בשכבה כל הגרעין הפנימי או שכבת plexiform רשתית תא זה הוא הרצוי, ו 2) הקלטה אימונוהיסטוכימיה אלקטרו הבא מתבצע בקלות רבה יותר בגלל הגיאומטריה שלם שטוח של הפרוסה ואת הגורמים שהוזכרו בסעיף (1) לעיל. פרוטוקול להקלטה תגובה אורים של נוירונים ברשתית כהכנה אגר מבוססי פורסמה בעבר יופיטר 2. הכנה אופקי פרוסה הרשתית אשר השתמשו בשילוב של אגר וטכניקות נייר פילטר גם שפורסם בעבר יופיטר 5. אנו ממליצים לצפות את סרטי הווידאו האלה בשילוב עם שלנו להשוות את הטכניקות השונות.

גישה ישירה סרט סוג ב מסופי presynaptic פרוסות רשתית חוליות מאפשר לנו לחקור את ההולכה הסינפטית סרט מסוג אזורי פעיל. זה גם מאפשר לנו ישירות במחקר הפיזיולוגיה הסינפטי ב microcircuits הרשתית. טכניקה זו תהיה שימושית במיוחד עבור הקלטות לזווג של אותות טרום ופוסט סינפטיים, עם שותפים postsynaptic כולל תאים amacrine מעכבות spiking בתאי הגנגליון 1, 16, 10. הקלטות מותאמים על סרט מסוג סינפסות בין שבלול עכברוש לתאי השיער הפנימיים דנדריטים מביא אפשריים ואת תוארו על ידי 7. סידן Imagiננוגרם של המסופים דו קוטבית Mb תא שבוצעה ב בחריפות תאים ניתק 8 ו 17 פרוסות רשתית, כמו גם בתאי דג זהב amacrine 3. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שיפור גדול in vivo ו בגישות חוץ גופית optogenetic ברשתית דג הזברה מהונדס 4. כיוונים לעתיד סביר להניח לערב טכניקות אלה מהונדס, יחד עם שיטות אלקטרו, אשר תאפשר לנו לגשר על הפער בין בהקלטות חוץ גופית פרוסה in vivo הדמיה, מובילה בסופו של דבר, מחקרים התנהגותיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו מתחרים אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר פרד Rieke הסבר מינו של הכנת אגר מוטבע-פרוסה רשתית כשהתחלנו באמצעות פרוטוקול במעבדה שלנו. אנו מודים גם לורי Vaskalis להמחשה של סכמטית סקירה בני הזוג. Veeramuthu Balakrishnan ו Soyoun צ'ו עבור הערות מועילות על טקסט ווידאו. עבודה זו נתמכה על ידי ניי-NIH RO1 מענק, והוא גם נתמך בחלקו על ידי קרן המחקר קוריאה גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה [KRF-2008-357-E00032].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low gelling-temperature agar Sigma-Aldrich A0701 Agarose type VII-A
Patch pipette World Precision Instruments, Inc. 1B150F-4 Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass
Vertical puller Narishige International PP830
Dental wax Cavex
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
45° angled fine tip forceps Fine Science Tools 11251-35
Razor blade Personna Medical Care Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O
Cylindrical tube Fisher Scientific 03-338-1B Polyethylene sample vials 2.5 ml
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H6254
Vibratome slicer Leica Microsystems VT1000S or VT1200S
Upright microscope Olympus Corporation BX51WI
60x water-immersion objective Olympus Corporation LUMPlanFl NA 0.90
CCD camera Sony Corporation XC-75
Camera controller Hamamatsu Corp. C2400
Monitor Sony Corporation 13” black and white monitor
Syringe filter Nalge Nunc international 0.2 μm
Micromanipulator Sutter Instrument Co. MPC-200
Lock-in amplifier HEKA Instruments EPC-9/10 amplifiers have software emulation
Spinning disk laser confocal microscope Yokogawa CSU-X1 Live cell imaging after patch clamp whole cell recording
Slidebook software Intelligent Imaging Instruments (3i) Imaging data acquisition and analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffer solution GIBCO, by Life Technologies 70013
Superfrost slide Fisher Scientific Slide glass
Anti-fading agents Biomeda corp.
Confocal laser-scanning microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710 Imaging of fixed tissue
Spatula Fisher Scientific 21-401-25B
Manuel vertical slicer Narishige International ST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1 Invitrogen O-6806 Ca2+ sensitive fluorescent dye
Alexa Fluor 555 Hydrazide Invitrogen A-20501MP Fluorescent dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
  2. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  3. Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
  4. WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. (2002).
  5. Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
  6. Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
  7. Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
  8. Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
  9. Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. (2011).
  10. Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
  11. Ljungdahl, Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
  12. Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
  13. Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
  14. Deininger, S. -O. Imaging Mass Spectrometry. Setou, M. Springer. Japan. 199-208 (2010).
  15. Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
  16. Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
  17. Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. Mass Spectrometry Binning Software GAB. (2012).
  18. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  19. Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
  20. Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
  21. Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics