Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa
Chapters
Summary January 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
כאן, אנו מתארים את השלבים החיוניים להקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ זני הסובסטנציה gelatinosa (SG) נוירונים בתוך הפרוסה חוט שדרה במבחנה . שיטה זו מאפשרת את מאפייני קרום פנימי, הסינאפסית ואפיון מורפולוגי של ס ג נוירונים שילמדו.
Transcript
שיטה זו יכולה לעזור להבהיר את מנגנוני עמוד השדרה שבבסיס שידור חושי, ויסות nociceptive וכאב כרוני או התפתחות כאב היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שזה יכול לאפשר שימור עצבי אידיאלי והוא יכול לחקות תנאים in-vivo במידה מסוימת. התחל על ידי משיכת אלקטרודות הקלטה ממיקרו-capillaries זכוכית borosilicate באמצעות מושך נימי. לאחר מכן, למלא תבנית עם אגר מותך להכין 1.2 ס"מ על ידי 1.5 ס"מ על ידי 2.0 ס"מ אגר בלוק.
חתוך את הבלוק לערוץ מרכזי אם אתה מתכנן מקטעים רוחביים. או בשר ערוץ עם קצה הבלוק עבור חלקים parasagittal. לפני שפע transcardial ומיצוי חוט השדרה, להכין 500 מיליליטר של סוכרוז מבוסס ACSF.
קירור הפתרון לקור כקרח ומצייד ב-95%O2 וב-5%CO2. מקררים את כל כלי הניתוח על הקרח. הפוך חתך אורך חמישה סנטימטרים על העור האחורי מן caudal כדי rostral.
לאחר מכן, לחתוך דרך כלוב הצלעות בין עמוד השדרה והצלעות משני הצדדים. השתמש במספריים כדי לחתוך בקצה caudal של עמוד השדרה. ואז לחתוך את הרקמות שמסביב במהירות לבודד את קטע lumbosacral של עמוד השדרה.
מעבירים את קטע הלומבוסקרל לצלחת זכוכית המכילה סוכרוז קר כקרח מבוסס ACSF. כאשר הצד הגחון כלפי מעלה, השתמש במספריים עדין כדי לחתוך את פדיקל החוליות באופן דו-צדדי ולחשוף את חוט השדרה בזהירות. לבודד קטע באורך שני סנטימטרים של חוט השדרה עם הגדלת lumbosacral ולהעביר את קטע עמוד השדרה לתוך צלחת זכוכית אחרת מלא סוכרוז קר ACSF.
עבודה תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי להסיר את קרום הלחם ואת קרום פיא ארכנואיד. חותכים את כל השורשים הגחוני והדורסי מהר ככל האפשר. יש להיזהר מפגיעה בחוט השדרה, במיוחד בקרן הגבית בעת הסרת קרום המוח ושורשי עמוד השדרה.
מניחים את חוט השדרה על גוש אגר שבעבר נחתך. כדי להכין פרוסות רוחביות, חבר את הצד הגחוני של חוט השדרה לאגר עם הצד הגבי לכיוון הלהב. להכנת פרוסות parasagittal, לחבר את הצד הגחון עם דבק סופר אגר בכיוון אנכי.
לאחר מכן, הר את גוש אגר לפלטפורמה של רטט עם דבק-על. והכן 300 עד 500 מיקרון פרוסות רוחביות או parasagittal עם מהירות מתקדמת של 0.025 מילימטרים לשנייה ותדר רטט של 80 הרץ. חוט השדרה צריך להיות פרוס דורסו-ventrally.
לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להכין את הפרוסה תוך 15 עד 20 דקות. עובי פרוסת עמוד השדרה צריך להיות לא יותר מ 600 מיקרון כדי לספק את הראות של התא. השתמש פיפטה קצוצה פלסטיק להעביר את הפרוסות על רשת ניילון בתא אחסון המכיל ACSF מחומצן ברציפות ב 32 מעלות צלזיוס.
כדי לנהל הקלטות מהדק טלאי שלם מתאי ג'לטינוסה או SG, השתמש בפתרונות תאיים מבוססי אשלגן יון להקלטה תוך החלת פתרון מבוסס צסיום רק להקלטה של זרמים פוסט סינפטיים מעכבים. מעבירים בעדינות את פרוסת חוט השדרה לתא ההקלטה. ואז לייצב אותו בחוזקה עם חוט פלטינה בצורת U עם חוטי ניילון ליציבות פרוסה אופטימלית.
יש לנפח בהתמדה את הפרוסה עם ACSF מבעבע בטמפרטורת החדר ולהגדיר את קצב ההתנפחות על שניים עד ארבעה מיליליטר לדקה כדי להשיג חמצון מספיק. לאחר מכן, באמצעות עדשת מיקרוסקופ ברזולוציה נמוכה, לזהות את האזור של נוירונים SG כמו רצועה שקופה. בחר נוירון בריא, המאופיין בצורה תלת מימדית עם קרום בהיר וחלק כתא היעד באמצעות המטרה ברזולוציה גבוהה ולהתאים אותו למרכז מסך צג הווידאו.
מלאו פיפסה זעירה בנפח מתאים של תווי יון אשלגן או פתרון תאי המבוסס על יון צסיום. לאחר מכן הכנס את המיקרו-פיפטה למחזיק האלקטרודה וודא שהתסופה תאית יוצרת קשר עם חוט הכסף בתוך המחזיק. הכניסו את המיקרו פיפטה לפוקוס ולהשתמש במיקרומניפולטור כדי לטבול אותו ב-ACSF.
החל לחץ חיובי קל כדי לכפות משם כל לכלוך ופסולת. הזז בהדרגה את המיקרו פיפטה לכיוון הנוירון הממוקד. ברגע שהפיפטה מתקרבת לנוירון וגומה קטנה מאוד נוצרת על הממברנה העצבית, שחררו את הלחץ החיובי כדי ליצור ג'יגה-זל.
לשנות את פוטנציאל ההחזקה למינוס 70 מילי-וולט, וזה קרוב לפוטנציאל הממברנה הפיזיולוגי של תא. לאחר מכן, יש למרוח יניקה נדונה ועדינה על המיקרו פיפטה כדי לקרוע את הממברנה וליצור תצורה טובה של תא שלם. שיא תכונות ירי על ידי בדיקת דפוס הירי של כל נוירון מהדק הנוכחי עם סדרה של שנייה אחת depolarizing פולסים הנוכחי של 25 כדי 150 picoamps עם 25 מרווחים picoamp במנוחה פוטנציאל קרום.
כדי להקליט זרמי תת-אחיזה סומטיים, החזק את פוטנציאל הממברנה במינוס 50 מילי-וולט במצב מהדק מתח ולאחר מכן החל סדרה של פולסים מתח היפרפולאריזציה של משך שניה אחת ממינוס 60 מילי-וולט למינוס 120 מילי-וולט עם הפחתה של 10 מילי-וולט. הקלט זרמים סינפטיים סינציוניים עם פתרון תאי מבוסס יון אשלגן במצב מהדק מתח בפוטנציאל החזקה של מינוס 70 מילי-וולט. הקלט IPSC של באמצעות פתרון תאי מבוסס יון צסיום לרישום IPSC של.
לאחר החזקת פוטנציאל הממברנה במינוס 70 מילי-וולט למשך כחמש דקות, לשנות בהדרגה את פוטנציאל ההחזקה לאפס מילי-וולט. המתן מספר דקות לייצוב ולאחר מכן התחל לתעד את אירועי IPSC. דפוסי ירי שנקבעו על ידי הזרקת סדרה של שנייה אחת depolarizing פולסים הנוכחי לתוך נוירון SG במנוחה פוטנציאל קרום עשוי להיות מסווג כמו ירי טוניק, עיכוב ירי, פער ירי, פרץ ראשוני, phasic-מתפרץ, חד ספייק וירי מסרב.
תמונה זו מציגה את פרוטוקול מעורר עבור זרמי subthreshold במהדק מתח. עקבות מייצגים אלה מראים את התגובה להזרקה זרם היפרפולאריזציה מסווג IH, IA ו- IT. זהו זכר מייצג של SEPSC של נרשם נוירונים SG במינוס 70 millivolts בהיעדר נוכחות של 50 micromolar APV ו 20 מיקרומולר CNQX. מעקב זה מציג את SEPC של נרשם לפני התוספת של APV ו CNQX על ציר זמן מורחב.
בעקבות הליך זה הן השיטות כמו הקלטות מהדק תיקון מזווג או אופטוגנטיקה ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות כמו אפיון microcircuits עצבי ספציפי בסובסטנציה ג'לטינוסה.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
