Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

Neuroscience

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Summary

A continuación se describe un protocolo para la preparación de agar-incrustados trozos de retina que son adecuados para la electrofisiología y la Ca2 + imágenes. Este método permite estudiar la cinta del tipo de sinapsis en la retina utilizando microcircuitos directa patch-clamp grabaciones de una sola terminales nerviosas presinápticas.

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Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices. J. Vis. Exp. (59), e3345, doi:10.3791/3345 (2012).

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Abstract

Los estímulos visuales se detectan y se transmite en un amplio rango dinámico de la intensidad de la luz y los cambios de frecuencia por las neuronas especializadas en la retina de los vertebrados. Dos clases de neuronas de la retina, los fotorreceptores y las células bipolares, lograr esto mediante el uso de cinta de las zonas de tipo activo, que permiten la liberación de neurotransmisores sostenido y de alto rendimiento durante largos periodos de tiempo. ON-tipo mixto de células bipolares (Mb) terminales de la retina peces de colores, que despolarizar a los estímulos luminosos y recibir caña mezclado y la entrada del cono fotorreceptores, son adecuados para el estudio de la cinta de tipo sinapsis debido a su gran tamaño (~ 10-12 m de diámetro) y de sus numerosas conexiones sinápticas lateral y recíproca con las dendritas de células amacrinas. Acceso directo a las terminales Mb células bipolares en la retina rebanadas de peces de colores con la técnica de patch-clamp permite la medición de la presináptica Ca 2 + corrientes, cambios de membrana de la capacitancia, y la inhibición recíproca retroalimentación sináptica mediada por GABA <sub> A y los receptores GABA C, expresada en los terminales. Presináptica mediciones de la capacitancia de la membrana de la exocitosis permitir un estudio de la plasticidad a corto plazo de la liberación de neurotransmisores excitatorios 14,15. Además, la plasticidad a corto plazo y largo plazo de la liberación de neurotransmisores inhibitorios de las células amacrinas también pueden ser investigados por las grabaciones de la inhibición por retroalimentación recíproca de llegar a la terminal Mb 21. En períodos cortos de tiempo (por ejemplo, ~ 10 s), la inhibición GABAérgica retroalimentación recíproca de las células amacrinas se somete a dos a dos pulsos a través de la depresión el agotamiento del pool de vesículas del GABA 11. La dinámica sináptica de microcircuitos de la retina en la capa plexiforme interna de la retina por lo tanto puede ser estudiado directamente.

La técnica de corte cerebral se introdujo más de 40 años, pero sigue siendo muy útil para la investigación de las propiedades eléctricas de las neuronas, tanto en el soma celular único, dendrita o axón único, y microcircuit sináptica nivel 19. Los tejidos que son demasiado pequeños para ser pegado directamente en la cámara de corte son a menudo primero incrustado en agar (o coloca en un papel de filtro) y luego en rodajas 20, 23, 18, ​​9. En este video, que emplean la técnica de agar antes de la incorporación de la retina con peces de colores. Algunos de los terminales de células gigantes bipolar en nuestra retina rebanadas de peces de colores son axotomized (axón de corte) durante el procedimiento de corte. Esto nos permite aislar una sola entrada presináptica terminales nerviosas, porque la grabación de las terminales axotomized excluye las señales del compartimiento de la soma-dendríticas. Por otra parte, también se puede grabar desde intacta Mb células bipolares, mediante el registro de los terminales conectados a los axones que no se han reducido durante el procedimiento de corte. En general, el uso de este protocolo experimental que ayuda en los estudios de la fisiología de la retina sináptica, el análisis de microcircuitos funcionales, y la transmisión sináptica en las sinapsis de la cinta.

Protocol

1. Soluciones externas e internas

  1. Prepare una solución de corte (calcio) de la solución madre 10 veces y añadir MgCl2, CaCl2, y D-glucosa al día. La solución final consiste en 1x (en mM): NaCl 119, KCl 2,5, 3,2 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 12 D-glucosa, 0,2 L-ácido ascórbico, 12 HEPES. Ajuste el pH a 7.4 (con NaOH), y ajustar la osmolaridad de 260 mOsm (con H 2 O y la solución stock 10x).
  2. Pesar 3% de baja temperatura de gelificación-agar (agarosa tipo VII-A, A0701, Sigma, Rieke, 2001) y se mezclan con corte solución. Calentar la solución de agar que contiene en el microondas durante 1-2 minutos, o hasta que se disuelva por completo, e incubar el agar en un baño de agua (30-33 ° C) para evitar la solidificación rápida (temperatura de transición gel: 26 ± 2 ° C).
  3. Prepare una solución de grabación (normal de calcio) de la solución madre 10 veces y añadir MgCl2, CaCl2, y D-glucosa al día. La consistencia final de solución 1xct de (en mM): 100 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 0,2 L-ácido ascórbico, 2,5 CaCl 2, 12 D-glucosa. Después de burbujeo de la solución en el 95% de CO O 2 / 5% 2 (carbogen) durante 5-10 minutos, ajustar el pH a 7.4 (con NaOH), y ajustar la osmolaridad de 260 mOsm (con H 2 O y la solución stock 10x).
  4. Alícuotas (1 ml cada una) de las soluciones internas pipeta se preparan con antelación y se almacenan en un congelador (-20 ° C). Dos soluciones pipeta interna se utilizan normalmente para aislar las corrientes de calcio de células bipolares (en mM):
    1. 40 CsCl, 60 Cs-gluconato, 10 de tetraetilamonio (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 Mg-ATP, una Na-GTP, y EGTA 2. Ajustar el pH a 7.2 (con CsOH) y la osmolaridad de 250 mOsm conjunto. Esta solución de cloruro de internos de alta por lo general proporciona una menor resistencia en serie de grabaciones (mejores condiciones de fijación de voltaje) y mayores corrientes postsináptico inhibidor (IPSCs) a un potencial de reposo de la membrana de células bipolares de -60 mV.
    2. 95 C-gluconato, 10 TEA-Cl, HEPES 25, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, y EGTA 0,5. Ajustar el pH a 7.2 (con CsOH), y establecer la osmolaridad de 250 mOsm 22. Esta baja EGTA solución interna normalmente conduce a mayores cambios en la membrana de capacidad provocado por pulsos despolarizantes paso y por lo tanto permite que los estudios del agotamiento de la vesícula de la piscina y la depresión a corto plazo.

2. Patch-clamp electrodos de pipeta

  1. Prepare de paredes gruesas (1,5 mm de diámetro exterior) de vidrio de borosilicato (1B150F-4; Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL) y tire de las pipetas de parches utilizando un extractor vertical (Narishige, PP830, Tokio, Japón). Abrir la punta de la pipeta en el parche de resistencias son soluciones de grabación de 8.7 mW cuando la pipeta se llena con solución de la pipeta interna n º 1.
  2. Cubra el parche pipeta de manera uniforme, desde la punta hasta el nivel del eje que llega a la titular de la pipeta, con cera dental (Cavex, West Chester, PA). Esto reducirá al mínimo la capacidad de pipeta y el ruido eléctrico y permitenmás precisa y de bajo ruido medidas de capacitancia. Una pipeta de baja capacidad también ayuda a la compensación electrónica C-rápido (capacidad rápida) de la EPC-9 (o EPC-10) amplificador de patch clamp.

3. Preparación de Agar-incrustados trozos de retina

  1. Seleccione un pez rojo (Carassius auratus, 8-16 cm) y colóquelo en un recipiente cubierto en un cuarto oscuro durante 30 minutos de adaptación a la oscuridad. Después de la anestesia, la eutanasia de los peces de colores sedado por decapitación rápida y doble descabello de la médula espinal y el tallo cerebral. A continuación, retire los ojos con una tijera curva de punta y unas pinzas de punta curvada. Estos procedimientos han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo (IACUC) en la Oregon Health & Science University.
  2. Hemisect cada ojo mediante la reducción de manera uniforme en todo el frente del ojo con unas tijeras de primavera (15003-08, Herramientas de Bellas Ciencia, iniciar cortadas por la perforación con puntas de las tijeras), y el lugar oculares en una solución de corte refrigerado (niveles bajos de calcio). Si NECEssary, extraer el cristalino con pinzas (el objetivo general se desprenden con la parte frontal del ojo). Retire la retina con epitelio pigmentario de la adjunta usando un par de pinzas de 45 ° ángulo de punta fina (11251-35, Herramientas de Bellas Ciencia) para remover la retina se desprenda de la ojera, avanzando lentamente por el 360 º. Cortar o cortar el nervio óptico, ya sea con pinzas finas o unas tijeras de primavera. Retire la retina con cuidado con una combinación de ángulo pinzas de punta fina y se aplica succión de una pipeta de Pasteur modificados o pipeta de transferencia (propina). Use unas pinzas de punta fina en ángulo para eliminar el resto del epitelio pigmentario de la adjunta a la retina. La superficie de la retina limpia y saludable debe aparecer oscuro, liso y de color rojo. Para la eliminación completa de todas las células del epitelio pigmentario oscuro oscuro adaptar la retina durante 1 hora (8, 1992).
  3. El tratamiento de retina aislada con ~ 0.03% (wt / vol; ~ 0,36 mg / ml en 1X solución de corte) hialuronidasa (3, H6254, Sigma) durante 15-30 minutos a temperatura ambientetemperatura (20-23 º C) para eliminar el humor vítreo. Durante la incubación, se puede preparar helado de solución de corte.
  4. Corte un pedazo rectangular de la retina (~ 2x2 mm, que contiene todo el espesor de la retina) mediante la eliminación de los bordes irregulares con un pequeño segmento de hoja de afeitar (Personna, de doble filo, se limpiaron con etanol al 70% y H 2 O) unido al el cuerpo de una jeringa de plástico de 1 ml, y la transferencia de la pieza de la retina a un pequeño recipiente lleno con una solución de agar (preparado en (1.2)). Trate de minimizar la cantidad de solución en torno a la retina, ya que se coloca en el agar líquido. Sumergirse directamente en una solución de corte helado (preparado en (3.3)) para solidificar el agar 20, 18, ​​9. Nosotros usamos un recipiente pequeño, hecho a mano. En pocas palabras, un pequeño tubo cilíndrico (Fisherbrand, frascos de polietileno de muestras de 2,5 ml, 03-338-1B) se redujo en ambos extremos y sellado con Parafilm (PM-996, Pechiney Plastic Packaging) parches.
  5. Cortar el bloque de agar sólido a unx1x1 cm cubo que contiene la pieza rectangular de retina.
  6. Transferencia del bloque de la cámara de corte y pegue a la superficie de la placa de corte. La cámara de corte es pre-enfriado en el congelador (-20 ° C). Cortar la manzana en rodajas de 200 a 250 micras de espesor con una máquina de cortar Vibratome (VT1000S o 1200S VT, Leica) en helado de solución de corte. Un total de 5 a 10 rebanadas se puede obtener, que son viables durante unos 5 a 6 horas.
  7. Transferencia de una de las rebanadas de la cámara de grabación. Colocar una malla de hilos de nylon pegados a un marco de platino en forma de U 19 en la parte superior de la corte, y perfusión continua (flujo de 1-2 ml por minuto) con una solución de grabación de burbujas con 95% O 2 / 5% CO 2 (carbogen ).

Solución de problemas:

Si la pieza de la retina incrustado en el bloque de agar se separa o se sale de la corte durante el agar, se puede aumentar el grosor de corte de 200 m hasta 300 m en incrementos de 20 m. Además, trate de minimizar la cantidad de solución en torno a la retina, ya que se transfiere y se coloca en el agar líquido absorbiendo solución extra con un laminado de papel punta "Kimwipe". Otra forma de evitar este problema es reducir el tamaño de la pieza de la retina inicialmente en el agar. Porque el humor vítreo de agar prohíbe totalmente vinculados a la pieza de la retina, puede ser necesario para hacer hialuronidasa fresco o ajustar el tiempo de incubación (paso (3.3)).

4. Identificación de la terminal sináptica célula bipolar en un trozo de retina

  1. La posición de la porción de retina bajo el microscopio en posición vertical (por ejemplo, BX51WI, Olympus). Consideramos que la porción de la retina con rayos infrarrojos de interferencia diferencial de contraste (IR-DIC) a través de una óptica de 60x de inmersión en agua objetivo (NA 0.90, Olympus) y cámara CCD (XC-75, Sony). La salida de la cámara CCD se envía a un controlador de la cámara (C2400, Hamamatsu) para la mejora de contraste antes de la visualización en un análogo de Sony de 13 "black y el monitor blanco. El microscopio está montado en una etapa de traducción XY, y la cámara de registro se coloca en un escenario fijo 14.
  2. Encontrar ya sea intacto y axotomized (axón-cut) terminales de células bipolares, que se pueden identificar por su tamaño, forma y posición en el sector (Figura 1). Terminales axotomized e intactos también se pueden distinguir por el examen de sus capacitivo veces transitoria decadencia actual (solo decae exponencial en comparación con doble exponencial, respectivamente) y Ca 2 + corrientes (Figura 2, 12, 14, 15). Terminales Mb se encuentran en la capa más proximal de sublamina b (ON-tipo de capa, adyacente a la capa de células ganglionares) en la capa plexiforme interna de la retina peces de colores. Terminales Mb, con su superficie mate y apariencia plana, pueden distinguirse fácilmente de los ganglionares y amacrinas desplazadas somas, que aparecen de fase brillante y esféricas. Además, el borde de las terminales de Mb está cubierto con una altala densidad de los contactos sinápticos, y aparece rugosa e irregular, en comparación con las superficies lisas, limpias de ganglio y las células amacrinas (Figura 1a-c). Axotomized terminales Mb parecen circular alrededor y cerca (Figura 1c), mientras que los terminales aparecen intactos elíptica y se estiró, a menudo con un final apretado que apunta hacia la capa nuclear interna de la retina (Figura 1a, b).
  3. Terminales dañados o insalubres, a menudo parecen hinchados y mostrar varias pequeñas estructuras granulares en la superficie. Puede ser posible obtener un sello GΩ en estos terminales, pero es probable que poco después de la ruptura de robo. Otras señales de los terminales no saludables son un aspecto hueco, el contraste y / o brillo idéntica a la porción circundante, y, a veces la ubicación en la superficie del corte. Es posible grabar desde las terminales sana profunda en el sector (ventaja: los circuitos sinápticos más intacto) y también cerca de la superficie del corte (advantage: un acceso más rápido a los medicamentos perfusión en la solución externa, más fácil para sellar).

5. Registros electrofisiológicos y Ca 2 + imágenes

  1. Utilizando una jeringa con una punta de 0,2 micras filtro (Nalgene), llenar el parche pipeta de vidrio con una solución interna a un nivel de 2.1 centímetros de la parte posterior de la pipeta. Después de eliminar las burbujas de aire de la punta, seguro de la pipeta en el soporte, aplicar una presión positiva (1.2 a 1.6 psi), y moverlo hacia la terminal que se hayan empleado un micromanipulador (MPC-200, instrumento de Sutter). Mientras se mueve la punta hacia abajo a través del sector, mueva la pipeta en el sentido de barrido lateral para asegurarse de que el sector no se encuentra atada a la punta.
  2. Mueva la punta de la pipeta alrededor de la terminal para limpiar la superficie de la membrana. Empuje la punta hacia abajo en el borde de la terminal para crear un hoyuelo (guión), y la liberación de la presión positiva. Si un sello GΩ no forma inmediata, aplicar una presión ligeramente negativa. Después de un sello GΩ, cambiar al modo de grabación en las células del amplificador de la abrazadera EPC-9 parches y cambiar el potencial de retención de -60 mV o -70. Aplicar el C-rápida (fast-capacitancia) la corrección, esperar a que el sello se estabilice entre GΩ 50-10, y luego la ruptura de la membrana con la succión fuerte, suave aplicado por vía oral para establecer la configuración de la grabación de células enteras. Si la configuración de célula completa se ha establecido correctamente, resistencia a la serie será entre 14 a 30 mW. Resistencia de entrada será de 200 a 500 mW terminales intacto y GΩ 1.3 para los terminales axotomized 14.
  3. Observe el transitorio de corriente capacitiva (Figura 2A y 2C), para distinguir entre los terminales de células intactas y axotomized bipolar. Terminales Mb intacta y axotomized tener una capacitancia de la membrana basal de 16.9 pF pF y 3.8, respectivamente.
  4. Aplique una duración de 200 ms voltaje-clamp paso -70 a 0 mV a una terminal de axotomized Mb. Esto permitirá quela medición directa de las grandes (~ 200 a 600 pA), aislados hacia el interior de Ca 2 + corrientes activadas por la apertura de dependientes de voltaje tipo L de Ca 2 + canales (figura 2b). Al mismo tiempo, uno es capaz de controlar el salto de la capacitancia causados ​​por la exocitosis de las vesículas sinápticas, y la rápida, pH mediada por la inhibición de la Ca 2 + actual que sigue la exocitosis 15, y la inhibición GABAérgica retroalimentación recíproca (Figura 3c, 22). Si uno los parches de una terminal de células intactas Mb bipolar, el resultado será como se muestra en la Figura 2c y 2d. No discernible Ca 2 + corrientes se observan debido a la gran "fuga" corrientes debido al acoplamiento espacio de unión en las dendritas de las células Mb bipolar 1.
  5. Cambios en la capacitancia de membrana puede ser evocado por una despolarización paso del potencial de reposo de -70 mV a 0 mV a través del "sine + DC" método de resolución temporal mediciones de capacitancia de la membrana 6. Salta la membrana capacitancia indicar la fusión de las vesículas sinápticas con la membrana plasmática. A 2 kHz sinusoidal de voltaje-clamp comando (30 mV pico a pico) se añadió al potencial de mantenimiento de -70 mV. La grabación actual fue analizada en dos ángulos de fase ortogonales por el EPC-9 patch-clamp software de emulación de amplificadores de una amplificador lock-in (HEKA, Lambrecht, Alemania). En la terminal intacta la figura 2d, una alta frecuencia (2 kHz) confines sinusoidal estímulo de la capacitancia de la membrana que se analiza a las terminaciones del axón terminal y que tienen una capacidad de base Cm ~ 6,8 pF. La membrana del cuerpo celular y las dendritas de las células bipolares son así filtradas por la alta frecuencia de voltaje-clamp onda 13.
  6. De Ca 2 +-imagen experimentos, mezcle la solución de parche pipeta interna con una Ca 2 + sensibles tinte fluorescente (por ejemplo, Oregon Green 488 BAPTA-1 (100-200 M, O-6806, Invitrogen)) y repita el protocolo de 50,1 a 5,5. Esto permitirá que una de combinar imágenes de fluorescencia y de registro electrofisiológico. Por ejemplo, es posible que la imagen de la Ca 2 + transitorios asociados a un paso de 200 ms -70 a 0 mV en los pequeños apéndices telodendria de la terminal Mb (Figura 3a, b). Hemos integrado nuestro derecho microscopio Olympus con un sistema de discos láser giratorio microscopio confocal (CSU-X1, Yokogawa). El microscopio confocal emplea 488 nm y 561 nm láser de líneas que son moduladas por un filtro sintonizable acústico-óptica. Los datos se adquieren con Slidebook software (3i; inteligente instrumentos de imagen). Para más detalles sobre las técnicas de imagen de calcio con peces de colores neuronas retinianas ver 24, 17, 3.

Solución de problemas:

Si una falla con frecuencia para establecer una configuración de célula completa, incluso después de la formación de un sello estable GΩ, puede ser útil para reducir la presión negativa utilizado para perforar el terminal membrane. También puede ser el caso de que la presión de succión óptima para el establecimiento de células enteras de configuración varía en función de la curvatura de la membrana (soma> terminal). También es posible utilizar un protocolo de Zap (Amplitud: 400 mV, Duración: 100 ms) para entrar en la configuración de célula completa, ya sea solos o en combinación con un fuerte pulso de presión negativa. Hemos encontrado el protocolo zap a ser especialmente útil para romper en cuando se utiliza una punta de la pipeta con un baño de la resistencia de más de 12 mW.

6. Resultados representante

Figura 1
Figura 1. Identificación de los terminales Mb células bipolares en rodajas de peces de colores la retina. (Ac) IR-DIC imágenes de los terminales Mb célula bipolar. Podemos identificar terminales probable axotomized (axón de corte) e intacto en la imagen IR-DIC. Una terminal de axotomized parece redondo y circular, como se muestra en cmientras que un terminal intacta es más probable que aparezca elíptica, como se muestra en a y b. Esta clasificación puede ser confirmado por medición de la capacidad transitoria (ver Figura 2) o por el método de tintura de llenado (d - f). Las flechas rojas indican la ubicación de la intersección entre el axón y la terminal del axón de las terminales intacto en a y b. Línea roja punteada indica el contorno de los terminales Mb célula bipolar. (Df). Imágenes de fluorescencia de los terminales Mb células bipolares con un axón intacta (d), un axón cortado parcialmente (e), o un ser removido del axón (f). Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) tinte fluorescente se llena con una solución interna previa a la grabación. Inmediatamente después de la grabación de patch-clamp, la porción de retina fue trasladado a un 4% (wt / vol) de paraformaldehído (P6148, Sigma) en solución amortiguadora de fosfato (70.013, GIBCO) y se incubó durante 30min. Rebanadas fueron montados en portaobjetos Superfrost (Fisher Scientific) en medio de montaje acuoso con anti-fading agentes (Biomeda corp). Alexa 555 Mb que contiene terminales de células bipolares eran vistas con una línea de 555 nm láser (rojo) con un 40x de inmersión en agua en un objetivo láser confocal de barrido microscopio (LSM 710, Carl Zeiss). Tenga en cuenta la presencia de pequeños apéndices telodendria que sobresale de la terminales de los axones (flechas azules). Barra de escala indica 10 micras (a - f). INL: la capa nuclear interna, IPL: la capa interna plexiforme, GCL: capa de células ganglionares.

Figura 2
Figura 2. Propiedades eléctricas de los terminales Mb axotomized e intacta la célula bipolar. (A, c) La respuesta transitoria de corriente activada por una hiperpolarización paso de voltaje-clamp del potencial de reposo de -60 mV a -70 mV. La respuesta corta corriente a un voltaje de -10 mV-clamp pasopuede dar lugar a: 1) un solo rápido decaimiento exponencial actual con alta impedancia de entrada a -70 mV (indicativo de una terminal de axotomized, panel a), o 2) un decaimiento exponencial doble con baja resistencia de entrada a -70 mV (indicativo de una terminal intacta, panel c, ver también 12, 14, 15). (B, d) Ca 2 + corrientes y saltos de membrana capacitancia fueron evocados por la despolarización paso -70 a 0 mV. Resolver las mediciones de tiempo de capacitancia de la membrana utilizar un estímulo senoidal de 2 kHz superpuesta a la posibilidad de mantener en reposo de -70 mV 6. El trazo rojo es el valor promedio de los datos de capacidad puntos. Tenga en cuenta que el salto de capacidad en la Figura 2B y 2D son iguales a unos 200 ss.

Figura 3
Figura 3. Mediciones directas de la Ca 2 + imágenes las señales, exocitosis, y la retroalimentación inhibitoria en un Mb bipolar de terminales celulares. (A) Un aumento transitorio en la concentración de Ca2 + en el telodendria de una terminal de Mb fue activado por una despolarización paso de voltaje-clamp -70 a 0 mV por 200 ms (flecha). Oregon Green 488 BAPTA-1 (100 M), un indicador de Ca 2 + colorante, fue incluido en el parche pipeta. (B) la imagen de la fluorescencia correspondiente telodendria Mb (región de interés indicado por la línea punteada de color rojo). (C) a corto plazo la depresión sináptica de la liberación de neurotransmisores (exocitosis). Capacidad de Ca 2 + corrientes (en el centro de seguimiento) y de la membrana (traza inferior) que evoca un par de 20 despolarizaciones ms a 0 mV (superior rastro; 200 ms entre pulsos de intervalo). La flecha indica el efecto de los protones exocytosed en el Ca 2 + actual y también la inhibición GABAérgica retroalimentación recíproca de la vecina amacrinas 15, 21. Tenga en cuenta que la inhibición de protones mediadas de la Ca 2 + actual y también el AGPInhibición Aergic retroalimentación recíproca están presentes sólo en la primera respuesta de despolarización, que también tiene un salto de capacidad debido a la exocitosis de las vesículas sinápticas.

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Discussion

Un paso crítico y difícil en nuestro protocolo es la transferencia de la pieza de la retina en la solución de agar (protocolo 3.4). Es necesario retirar cuidadosamente el humor vítreo y la solución de parte residual de la pieza de la retina y la transferencia sin la distorsión o curvatura. Para lograr esto, utilizamos una pequeña espátula (21-401-25B, Fisherbrand) con una punta doblada para formar un ángulo de 90 °, junto con unas pinzas punta angulada (11251-35, Herramientas de Ciencias Artes), a la posición de la retina pieza en todo el proceso de transferencia en la solución de corte. Solución de corte residual en el segmento de retina y la espátula se puede quitar por cuidado frotando la superficie con la punta de un Kimwipes doblados o enrollados (Kimberly-Clark).

Otra forma común de preparar cortes transversales de retina es el filtro de protocolos basados ​​en papel 23. En pocas palabras, una pieza de la retina invertida todo está conectado a una pieza rectangular de Millipore disco de filtro (células ganglionares de laicoser contra el papel de filtro, capa de fotorreceptores hacia arriba) y se cortan en rodajas gruesas 250 micras con un manual vertical "pulgar" máquina de cortar (por ejemplo, Narishige ST-20). Nos encontramos con que las ventajas del papel de filtro basado en el protocolo son saludables fotorreceptores y una relación de aumento de axotomized a los terminales Mb intacta. De este modo, utilizar este método el papel de filtro para obtener respuestas evocadas por la luz de las terminales Mb único incrustado en rodajas de la retina.

Las ventajas de nuestro agar basado en el protocolo sobre el papel de filtro basado en el protocolo son: 1) el segmento de la retina producida es plana, uniforme y relativamente sin daño y con una clara separación entre las capas de la retina, lo que permite a los parches en cualquier capa nuclear interna o capa plexiforme retina célula que se desea, y 2) técnicas de inmunohistoquímica siguiente registro electrofisiológico se realiza con mayor facilidad debido a la geometría íntegra y extendida del sector y los factores mencionados en el punto (1) anterior. Un protocolo para el registro de respuesta a la luzs de las neuronas de la retina en una preparación de agar-base se publicó anteriormente en JoVe 2. Una rebanada de preparación horizontal de retina que se utiliza una combinación de agar y las técnicas de filtro de papel también fue publicado previamente en JoVe 5. Le recomendamos ver estos videos en combinación con nuestra propia para comparar las diferentes técnicas.

Acceso directo a la cinta de tipo terminales presinápticos en la retina de vertebrados rebanadas nos permite investigar la transmisión sináptica en la cinta las zonas de tipo activo. También nos permite estudiar directamente la fisiología sináptica en los microcircuitos de retina. Esta técnica es particularmente útil para las grabaciones de pares de señales de pre-y post-sináptica, con socios como postsináptico inhibitorio amacrinas y clavar una células ganglionares, 16, 10. Grabaciones en cinta de pares de tipo sinapsis entre las ratas coclear células ciliadas internas y las dendritas aferentes son posibles y han sido descritos por 7. Calcio imaginaciónng de los terminales celulares Mb bipolar se ha realizado en forma aguda las células disociadas 8 y 17 en rodajas la retina, así como peces de colores en las células amacrinas 3. Estudios recientes han mostrado grandes mejoras en vivo e in vitro en los enfoques optogenetic retina de pez cebra transgénico 4. Las direcciones futuras que probablemente incluirá estas técnicas transgénicas, así como los métodos electrofisiológicos, que nos permitirá cerrar la brecha entre las grabaciones de corte in vitro e in vivo de imágenes, lo que lleva finalmente a los estudios de comportamiento.

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Disclosures

Nosotros no tenemos intereses opuestos a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Fred Rieke por su explicación del tipo de agar-integrado rebanada preparación retina cuando empezamos a usar el protocolo en nuestro laboratorio. También queremos agradecer a Lori Vaskalis de la ilustración esquemática de la visión y los Dres. Veeramuthu Balakrishnan y Cho Soyoun por sus valiosos comentarios sobre el texto y vídeo. Este trabajo fue apoyado por una beca de NEI-NIH RO1, y también fue parcialmente financiado por una beca de la Fundación de Investigación Corea financiado por el Gobierno de Corea [KRF-2008-357-E00032].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low gelling-temperature agar Sigma-Aldrich A0701 Agarose type VII-A
Patch pipette World Precision Instruments, Inc. 1B150F-4 Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass
Vertical puller Narishige International PP830
Dental wax Cavex
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
45° angled fine tip forceps Fine Science Tools 11251-35
Razor blade Personna Medical Care Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O
Cylindrical tube Fisher Scientific 03-338-1B Polyethylene sample vials 2.5 ml
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H6254
Vibratome slicer Leica Microsystems VT1000S or VT1200S
Upright microscope Olympus Corporation BX51WI
60x water-immersion objective Olympus Corporation LUMPlanFl NA 0.90
CCD camera Sony Corporation XC-75
Camera controller Hamamatsu Corp. C2400
Monitor Sony Corporation 13” black and white monitor
Syringe filter Nalge Nunc international 0.2 μm
Micromanipulator Sutter Instrument Co. MPC-200
Lock-in amplifier HEKA Instruments EPC-9/10 amplifiers have software emulation
Spinning disk laser confocal microscope Yokogawa CSU-X1 Live cell imaging after patch clamp whole cell recording
Slidebook software Intelligent Imaging Instruments (3i) Imaging data acquisition and analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffer solution GIBCO, by Life Technologies 70013
Superfrost slide Fisher Scientific Slide glass
Anti-fading agents Biomeda corp.
Confocal laser-scanning microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710 Imaging of fixed tissue
Spatula Fisher Scientific 21-401-25B
Manuel vertical slicer Narishige International ST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1 Invitrogen O-6806 Ca2+ sensitive fluorescent dye
Alexa Fluor 555 Hydrazide Invitrogen A-20501MP Fluorescent dye

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References

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