Afslørende Neural kredsløbs topografi i Multi-Color

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi tilbyder en praktisk guide til at levere sporstoffer

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Reeber, S. L., Gebre, S. A., Filatova, N., Sillitoe, R. V. Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color. J. Vis. Exp. (57), e3371, doi:10.3791/3371 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neurale kredsløb er organiseret i funktionelle topografiske kort. For at visualisere komplekse kredsløb arkitektur har vi udviklet en tilgang til pålideligt mærke den globale mønster af flere topografiske fremskrivninger. Lillehjernen er en ideel model for at studere en velordnet arrangement af neurale kredsløb. For eksempel har kompartment organiseringen af ​​spinocerebellar Mossy fibre vist sig at være et uundværligt system for at studere Mossy fiber mønster. Vi har for nylig vist, at hvedekim agglutinin (WGA) konjugeret til Alexa 555 og 488 kan bruges til at spore spinocerebellar Mossy fiber fremskrivninger i at udvikle og voksne mus (Reeber et al. 2011). Vi fandt tre vigtige egenskaber, der gør WGA-Alexa sporstoffer ønskeligt redskaber til mærkning neurale fremskrivninger. Først Alexa fluorophores er intense og deres lysstyrke giver mulighed for wholemount billeddannelse direkte efter sporing. For det andet, WGA-Alexa sporstoffer mærke hele bane for at udvikle og voksne neurale projections. For det tredje, WGA-Alexa sporstoffer hurtigt transporteres i både retrograd og anterograd retninger. Her beskriver vi i detaljer, hvordan man kan forberede de sporstoffer og andre nødvendige værktøjer til, hvordan man udføre kirurgi for spinocerebellar sporing og hvordan man bedst til billede spores fremskrivninger i tre dimensioner. Sammenfattende tilbyder vi en trin-for-trin sporing protokol, som vil være nyttige for at dechifrere tilrettelæggelse og tilslutning af funktionelle kort ikke kun i lillehjernen, men også i hjernebarken, hjernestammen og rygmarven.

Protocol

1. Levering af sporstoffer in vivo ved brug af sterile kirurgi (§ § 1,1 til 1,16)

Hele proceduren anbefaler vi, at standarden sterile kirurgiske teknikker anvendes. Dette omfatter sterile handsker, kjole, og ansigtsværn. Værktøjer bør enten autoklaveres før brug eller rengøres grundigt med vand og derefter ethanol. Under operationen, og især mellem dyr, rene væv fragmenter fra de værktøjer og tørre sterilisere instrumenter med et varmt perle sterilisator (Steri 250 Cat. # 18000-45, Fine Science Tools). Derudover er det vigtigt, at du organisere dit arbejde plads, sådan at du har områder udpeget til dyr forberedelse (barbering osv.), kirurgi, og et opsving område, hvor dyret kan nemt overvåges, varmede, og leveres med analgetika efter behov. Nøglen til succesfuld overlevelse kirurgi er at reducere risikoen for infektion og vedligeholde en aggressiv postoperativ pleje strategi. Der henvises til tabel, hvor du kan find alt det nødvendige udstyr og reagenser til denne protokol.

  1. Bedøver voksne mus med frisklavede Avertin (2,2,2-Tribromoethanol, Sigma, St. Louis MO;. Cat # T48402) via en intraperitoneal (ip) injektion med en dosis på 0.2ml/10grams kropsvægt. Andre bedøvelsesmidler såsom isofluran eller ketamin / xylazin er lige effektive, men sikre, at din laboratoriet har de nødvendige institutionelle og føderale godkendelse før brug. Hvis du bruger hvalpe (P0 - P10) kan du bedøver dem på knust is i 10-15 minutter. Sørg for, at huden på hver enkelt hvalp ikke er i direkte kontakt med is (for eksempel ved at placere dem i fingrene af latex handsker) som det kolde vand hurtigt vil medføre en dødbringende niveau af hypotermi. Bekræft, at dyret er under et acceptabelt almindeligt af anæstesi ved at udføre en tå knivspids med pincet eller fingrene til dyrenes bagpoterne. Hvis der er en pedal refleks, skal du vente, indtil dyret ikke reagerer på denne stimulus som en indikation af en dyberealmindelig af anæstesi.
  2. Når dyret er helt bedøvet lægge den med sine strækkes op på en steril gaze pad med hovedet væk fra dig, og dens hale vender mod dig. Barbere pelsen med hårklippemaskiner med henblik på at give dig selv et klart kirurgiske felt, der er bredt nok til at få adgang til det centrale nervesystem. Tør barberede regionen med to sæt spritservietter, så er 70% alkohol / betadine, og derefter rent en gang mere med spritservietter. Brug en indefra og ud cirkelmønster ved rengøring af kirurgiske område. Du kan vælge at klart afgrænse din kirurgiske område ved at skære et lille hul i en steril gaze og placere åbningen over din barberet og ren operationsstedet. Skønt at opretholde det sterile kirurgiske felt kan være svært, når de opererer på små dyr, at gøre det vil medvirke til at reducere risikoen for infektion.
  3. Løft huden ved hjælp af pincet og foretage et snit med en saks på midterlinjen direkte over den nedre thorax-øvre lumbale region. Den lavere thorax region øverste lænden kan identificeres ved at køre fingeren langs rygsøjlen til at føle for en pukkel i rygsøjlen (fig. 1).
  4. Skær fascie og overfladisk spinal muskler. Hvis det er nødvendigt, stop blødning ved ætsende blodkarrene (Fin Science Tools, Foster City, CA;. Cat # 18000-00). I unger, er at tilføre et let pres omkring snittet med vatpinde tilstrækkeligt til at standse blødningen.
  5. Udfør en dorsal laminektomi ved at fjerne torntappene fra en eller to segmenter af den nedre bryst - øvre lumbal rygmarven efter opskæring af lamina på begge sider af rygsøjlen, midt mellem artikulære proces og den dorsale spinosus processen (fig. 2) . Vær forsigtig med ikke at beskadige rygmarven med din saks og altid fjerne den lille knoglerester, som de kunne lacerate rygmarven. Bemærk, at rygsøjlen i den tidlige postnatale unger ikke er helt forbenet, hvilket betyder, at knoglerne er megetbløde og kan skæres meget nemt. Derfor være forsigtig med ikke at skære for dybt, da du kan beskadige rygmarven.
  6. Hvis du foretrækker ikke at udføre en dorsal laminektomi hos voksne mus, har vi konstateret, at du kan skære det bløde væv mellem vertebrale segmenter til at afsløre en lille region i rygmarven uden at skære nogen knogle. Selv om begge metoder er effektive indgangsveje til rygmarven, kan undgå en dorsal laminektomi sikre, at rygmarven forbliver uskadt.
  7. Fyld en trukket glaselektrode (borsilicatglas kapillærer; Cat # 300056, Harvard Apparatur, Holliston, MA;. Dual etape Glas Mikropipette Puller fra Narishige Model 001-PC-10) med din sporstof ved hjælp af en mikrometer sprøjte (0,2 ml; Gilmont Instruments Cat . # GS-1100) eller en tilsvarende leverance apparat.
  8. Spænd glasset mikroelektrode på plads på et mikromanipulator og sæt elektrode 0,1-0.5mm i den nederste thorax-øvre lænden af ​​rygmarven halvvejs mellem midtenlinje og den laterale kant af rygmarven. Dyret kan holdes i en stereotaxic apparat til præcis identifikation af injektion loci og til stabilisering dyret (Mindre Husdyrs Stereotaxic Instrument Model 940-A og elektrode manipulator Model 960 fra Kopf Instrumentation). Alternativt, hvis din bedøvelse regime kan skræddersys til at opnå en jævn flade uden væsentlige bevægelser på grund af dyb vejrtrækning, forsigtigt tape dyret tilstrækkeligt.
  9. Trykket injicere ind i rygmarven i løbet af 3-5 minutter ca 0.5μl af en 2% opløsning af WGA-Alexa 488 (hvedekim agglutinin, Alexa Fluor 488 konjugat;. Cat # W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 555 (hvedekim agglutinin, Alexa Fluor 555 konjugat;. Cat # W32464, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 350 (hvedekim agglutinin, Alexa Fluor 350 konjugat;. Cat # W11263, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA- HRP (hvedekim agglutinin peberrodperoxidase, Sigma, St. Louis, MO Cat # L7017) eller 0.5μl på 10%BDA (biotinyleret dextran amin;. Cat # D1956, Invitrogen, Carlsbad, CA) i fosfat bufferet saltvand (PBS, Sigma, St. Louis, MO, Cat # P4417). Injektion disse mængder af sporstoffer resulterer i mærkningen et stort antal af fibre. Mindre mængder vil skulle injiceres til målretning mindre kerner (eller sub-regioner i de enkelte kerner), og hver investigator skal empirisk bestemme den ideelle mængde til at levere. Iontophoresis bør overvejes for præcis nanoliter levering til præcis injektioner. Vi typisk supplere alle sporstof løsninger med 0,5% Fast Green (Sigma, St. Louis, MO, Cat # F7252) til at visualisere injektionen stedet under operationen.
  10. Vi tilføjer 1μl af majsolie (Sigma, St. Louis, MO, Cat # C8267) til hver 10μl af BDA løsning før injektion for at forhindre blandingen klistrer til væggene i trak pipetter. Hvis du har problemer med at skubbe tracer ud af pipetten, langsomt trækkes spidsen for at skabe en lille lomme i det væv, så prøv indsprøjte igen.Det er ikke usædvanligt, at mikroelektrode tip til at blokere. I de fleste tilfælde lomme også med til at skabe et reservoir, hvorfra de omkringliggende neuroner kan absorbere sporstof. Husk altid at skubbe tracer langsomt for at undgå massiv vævsskade i nærheden af ​​nålen.
  11. Luk forsigtigt huden med såret klip og væv lim. Alternativt kan du bruge suturer at lukke såret.
  12. Bemærk, at med praksis den kirurgiske procedure, i hvert fald indtil dette tidspunkt, kan være afsluttet på mindre end 20 minutter.
  13. Placer dyret i et opsving kammer (Vetcare kammer model 9.16.0 Cat. # 340508 fra Harvard Apparater) på en varmepude (varmepude Cat. # 341241 fra Harvard Apparater) for at undgå hypotermi og fremskynde inddrivelsen. Alternativt kan du bruge en af ​​mange mærker og modeller af varme kamre. Overvåg vejrtrækning og kontroller for tegn på, at dyret forsøger at flytte. De fleste dyr er normalt reagerer inden for 10-15 minutter efter operation.
  14. WGA-Alexa 555, WGA-Alexa 488, og WGA-HRP hurtigt transporteres i neuroner, og vi har fundet, at i både tidlig postnatal og voksne mus Alexa konjugerede sporstoffer robust label lange fibre skrifter inden for 24 timer (Reeber et al. 2011) . WGA-Alexa 350 er også hurtigt transporteres selv i forhold til de øvrige Alexa farvestoffer dens synlighed er meget afhængig af kvaliteten og filterets følsomhed sæt (data ikke vist;. Reeber et al 2011) BDA kræver typisk længere overlevelse tid til fuldt ud at spore neurale fremskrivninger og dermed for komplet kortlægning af spinocerebellar fremskrivninger dyr bliver nødt til at blive ofret efter ca 11 dage.

2. Påvisning af anterogradely spores Mossy fibre

  1. Efter de respektive overlevelse perioder bedøver de mus med Avertin (eller din foretrukne bedøvelse).
  2. Når der ikke er nogen reflekser blodet skal skylles igennem hjertet af perfusing med 0,1 M PBS (pH7.2). Derefter fastsætter de væv ved perfusing dyret med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Ud over de områder, du vil analysere, er det altid nødvendigt at erhverve væv fra injektionsstedet i en retrospektiv analyse af hvor stor injektionen var en indikation af omfanget af vævsskader forårsaget af elektroden, og for at klarlægge eventuelle mærkning i fibre for passage (Fig. 3, se Mesulam, 1982;. Reeber et al 2011).
  3. Postfix BRains fra perfunderet mus i 24-48 timer i 4% PFA og derefter cryoprotect dem i buffer saccharose løsninger fortyndes i PBS (15% for ~ 2 timer, eller indtil væv synker til bunden af ​​beholderen og derefter 30% natten over eller indtil væv synker). Vævet er derefter fjernet fra saccharose, forsigtigt duppes tørre med køkkenrulle og derefter nedsænket i et væv støbeform indeholder OLT (Optimal Cutting Temperatur; Sakura Finetech USA Inc, CA). Vævet er derefter fryses ved hjælp af et -80 ° C fryser og opbevares ved den samme temperatur, indtil den er klar til at blive skåret.
  4. Den Alexa fluorophores er synlige umiddelbart efter mærkning og ikke kræver yderligere farvning. Derfor efter perfusion WGA-Alexa spores væv kan skæres og monteres for billedbehandling eller direkte afbildes i 4% PFA som en wholemount præparat. Vi fandt, at billeddannelse vævet i 4% PFA gav den bedste brydningsindeks for billeddannelse topografi spores fremskrivninger i wholemounts. For sektioner, skåret serielle 40μm tyk Coronal sektioner på en kryostat og samle dem som frit svævende sektioner i PBS. I betragtning af toksiciteten af ​​PFA, at en passende ansigtsmaske er slidt under perfusion og billedbehandling sikrer, holde området godt ventileret, og når den ikke bruges straks returnere eventuelle PFA eller PFA-fikseret væv til lukkede beholdere. Det er ideelt, hvis dit mikroskop er placeret i en passende stinkskab.
  5. WGA-HRP mærket fibre kan afsløres ved hjælp af tetramethylbenzidin (TMB) som kromogen. Vi vil ikke beskrive den HRP farvningsprotokol her, da det tidligere har været beskrevet i detaljer (Vogel og Prittie 1994;. Sillitoe et al 2010)
  6. For BDA mærket fibre inkuber frit svævende vævssnit i 2 timer i Streptavidin-CY3 (kat. # 434315, Invitrogen, Carlsbad, CA) eller Streptavidin-Alexa Fluor 488 eller 555 (kat. # S11223 for 488 og Cat. # S21381 for 555, Invitrogen, Carlsbad, CA), vask i PBS, og derefter montere med fluor-GEL. For DAB, inkuber vævssnit natten over i ABC Reaktionsbufferen (kat. # PK-4000, VEctor Laboratories, Inc. Burlingame, CA), skylles 3 gange i PBS, og derefter reagere i 5-10 minutter i DAB (0.5mg/ml, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA), suppleret med 10μl på 30% H 2 O 2 for hver 50 ml DAB-løsning.

3. Immunhistokemi

  1. Immunhistokemi blev gennemført som beskrevet tidligere (Sillitoe et al. 2008). Kort fortalt, inkuber vævssnit i 0.1M PBS indeholdende 10% NGS (NGS, Sigma, St. Louis MO), 0,1% Tween-20 og primære antistoffer (se nedenfor) for 16-18 timer ved stuetemperatur. Vask vævssnit tre gange i PBS, og derefter inkuber dem i sekundære antistoffer (se nedenfor) til et maksimum på 2 timer ved stuetemperatur. Skyl vævet igen og afsløre immunoreaktivitet som beskrevet nedenfor.
  2. At bestemme forholdet mellem Purkinje celler og Mossy fibre vi co-mærkede frit flydende vævssnit ved hjælp af konventionelle metoder med dobbelt farvning. Vi brugte WGA-Alexa 555for sporing og Alexa 488 konjugeret æsel anti-mus sekundære antistoffer (Invitrogen / Molecular Probes Inc., Carlsbad, CA) til at registrere ZebrinII (1:250; venlig gave fra Dr. Richard Hawkes, University of Calgary, Calgary, Canada). ZebrinII er et muse monoklonalt antistof og blev brugt direkte fra brugt hybridom dyrkningsmediet. Fluoroforen konjugerede sekundære antistoffer blev brugt ved en fortynding på 1:1500. Efter farvning af vævssnit blev monteret på ladede objektglas og dækglas med fluor-gel i Tris buffer (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) eller med Vectashield hardset Mounting Medium med DAPI (kat. # H-1200, Vector Laboratories, Burlingame , CA) for triple farve fluorescens billedbehandling.
  3. Vi testede specificitet af den sekundære antistoffer ved behandling af vævssnit i mangel af primære antistoffer. Intet signal er fundet i en sådan kontrol eksperimenter, der viser, at farvningen vi observerede ikke skyldtes uspecifikke signaler fra the Alexa-konjugerede antistoffer (data ikke vist).

4. Mikroskopi og dataanalyse

  1. Vi indfange mikrofotografier af vævssnit ved hjælp af Leica DFC360 FX (fluorescens) og DFC490 (DAB og TMB reagerede vævssnit) kameraer monteret på en Leica DM5500 mikroskop.
  2. Vi erhverve og analysere billeder af vævssnit ved hjælp af Leica Application Suite og Leica Application Suite FX softwarepakker.
  3. Mikrofotografier af wholemounts er taget med et Leica DFC3000 FX kamera monteret på en Leica MZ16 FA stereomikroskop kører Leica Application Suite FX software.
  4. Begge vores mikroskoper er udstyret med Leica CY3 (model # 11600231) og FITC (model # 11513880) filtre, og DM5500 med en ekstra A4 DAPI / UV-filter (model # 11504162).
  5. Billederne er erhvervet efter optimering for under / over-eksponering, som bestemt ved hjælp af Leica-software. Vi importere alle rå data til Adobe Photoshop CS4, og hvis det er nødvendigt we korrekt hele feltet af hvert billede for skarphed, lysstyrke, kontrast eller niveauer alene. Andre fotoredigering software kan bruges som foretrækkes.
  6. De diagrammer præsenteres her blev trukket i Adobe Illustrator CS4.
  7. Alexa 555 og CY3 farves neuroner, der opdages som rød ved hjælp af vores filtre, var pseudo-farvet magenta i billederne præsenteres hele manuskriptet.

Dyr

Alle dyrestudier blev udført under en godkendt IACUC dyr protokol i henhold til den institutionelle retningslinjer på Albert Einstein College of Medicine. Mandlige og kvindelige udavl schweiziske Webster (Taconic, Albany, NY) eller indavlede C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME) mus blev opretholdt i vores koloni og brugt til alle undersøgelser. Middag på dagen en vaginal stikket blev opdaget blev anset embryonale dag 0,5.

5. Repræsentative resultater:

Spinocerebellar afferenter opsige ind parasagittal bands i lillehjernen (Fig. 3; Voogd et al 1969;. Grishkat og Eisenman 1995, Vogel og Prittie 1994; Vig et al 2005;. Apps og Hawkes 2009; Sillitoe et al 2010;.. Reeber et al 2011). Vi injiceret WGA-Alexa roebestoffer i den nederste bryst-øvre lumbale rygmarv dokumentere: 1) at disse sporstoffer kan bruges til at konsekvent mærke bestemte delmængder af terminaler i lillehjernen (Fig. 3; Reeber et al 2011), 2). , at WGA-Alexa sporstoffer er intenst lyse og kan bruges til at visualisere den overordnede mønster af Mossy fiber topografi i hele cerebella (Fig. 3;. Reeber et al 2011), 3) at WGA-Alexa 488 og 555 kan anvendes i kombination henblik på at spore flere skrifter i samme dyr (Fig. 4), og 4), at WGA-Alexa sporstoffer er kompatible med immunhistokemisk farvning (Fig. 5). I de senere arbejde, som vi viste, at WGA-Alexa sporstoffer label terminaler i lillehjernen så tidligt som 6 timer efter at levere den sporstof ind i rygmarven og er et glimrende valg for at opspore architecture for at udvikle veje (Reeber et al., 2011).

Figur 1
Figur 1. Opsætning af udstyr til at levere sporstoffer in vivo. A. et billede af vores kirurgiske område. B. Jo lavere thorax-øvre lænden kan identificeres ved at køre fingrene langs rygsøjlen til at føle for en pukkel i rygsøjlen. Den dorsale laminektomi bør udføres omtrent i midten af ​​"pukkel", der er angivet af den gule pil.

Figur 2
Figur 2 Illustration af en lavere thorax... - Øverste lumbale rygsøjle segment før og efter dorsale laminektomi A. Skematisk af en intakt vertebrale segment fra de lavere-thorax-øvre tømmer region med musen rygsøjlen B. A dorsal laminektomi udføres ved at fjerne torntappene fra en eller to vertebrale segmenter, efter opskæring lamina midt mellem artikulære processen og den dorsale spinosus proces.

Figur 3
Figur 3. WGA-Alexa sporstoffer er intenst lyse og kan bruges til at visualisere afferente projektion topografi i høj opløsning. A. skematiske illustrerer oprindelse og opsigelse af WGA-Alexa 555 mærket spinocerebellar neuroner. B. Billede af et injektionssted efter at levere WGA-Alexa 555 i den nederste bryst øverste lænden af den voksne rygmarven. C. Wholemount billede af anterior lobules efter en injektion af WGA-Alexa 555 i den nederste bryst-øvre lumbale region i rygmarven. D. WGA-Alexa 555 anterograd sporing af spinocerebellar tarmkanalen afslører bands af Mossy fibre som set på et samarbejderonal vævssnit. De lobules er defineret med romertal og de numre etiketten Mossy fiber bånd på hver side af midterlinjen (gælder for alle billeder). Skala barer: B, 500 μm C, 500 μm D, 200 μm.

Figur 4
Figur 4. WGA-Alexa sporstoffer er effektive til mærkning flere nervebaner i samme dyr. A. Wholemount skematisk med musen lillehjernen opsummerer de samlede mønster af spinocerebellar Mossy fiber bands. WGA-Alexa 555 blev injiceret i højre side af lumbale rygmarv og WGA-Alexa 488 i samme segment på venstre side. B. Som det ses på en koronale vævssnit skære gennem den bageste lobules, var begge WGA-Alexa sporstoffer transporteres til lillehjernen og med succes mærket adskilte delmængder af terminaler (se også Reeber et al. 2011). Forkortelser: moleCULAR lag (ml); Purkinje cellelag (PCL); granula cellelag (GCL); hvide substans (WM). Skala barer: B, 100 mM.

Figur 5
Figur 5. WGA-Alexa sporstoffer kan bruges i kombination med immunhistokemi og histologi for triple mærkning af neuroner og fremskrivninger. A. WGA-Alexa 555 er deponeret i Mossy fiber terminaler i lille lap III. B. ZebrinII pletter afslører en vifte af Purkinje celle striber i lille lap III. C. DAPI farvning af neuronal og glial kerner. D. Fusioneret billede af paneler A, B , og C viser tredobbelt mærkning af afferente bands, Purkinje celle striber, og generel cytoarchitecture. EH. Høj forstørrelse billeder af boksede regioner er vist i paneler AD. Purkinje celle striber er nummereret som tidligere beskrevet (revidereti (Apps og Hawkes 2009)). Forkortelser: molekylære lag (ml); Purkinje cellelag (PCL); granula cellelag (GCL). Skala barer: D, 500 m (til AC), H, 500 m (for EG).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet de kirurgiske og tekniske oplysninger, der kræves for vellykket aksonal og dendritceller sporing ved hjælp af en roman fluorescerende-baseret tilgang til hurtigt mærkning neurale fremskrivninger i at udvikle og voksne mus. Brug af WGA-Alexa vi vise, hvordan sporstoffer og markører kan bruges til at analysere mønstrede kredsløbs topografi med høj opløsning og i tre dimensioner.

Mange sporstoffer er til rådighed for sporing neuronale kredsløb, herunder Kolera toksin subunit B, Biocytin, Neurobiotin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHAL), fluororuby, fluoremerald og fluorogold. Derudover har de seneste genetiske og virale baseret sporstoffer vist, at molekylemæssigt forskellige neuronale delmængder topografisk er forbundet til deres mål med stor præcision. Bemærk, at selv om nogle neurale sporstoffer overvejende transporteres i enten anterograd og retrograd retning (f.eks BDA 10.000 MW mod 3000 MW), er sporstof molekyler transporteres ofte i båderetninger. I vores studier, introducerer vi WGA-Alexa baseret sporstoffer som pålidelige neuroanatomiske værktøjer til analyser af topografiske projektion mønstre. Vi viser, at WGA-Alexa fluorescerer klart, transporteres hurtigt, og er alsidig nok til at blive parret med immunhistokemiske markører herunder for cerebellare sagittal rum (Fig. 3).

Vi har fundet flere begrænsninger ved brug af WGA-Alexa i forhold til andre tilgængelige neuroanatomiske sporstoffer. I modsætning til BDA (Wu et al. 1999), vi tidligere har vist, at WGA-Alexa (og WGA-HRP) ikke afslører hele morfologi af komplekse terminal endelser (Reeber et al. 2011). Men vi forbedret værdien af ​​de anatomiske oplysninger stammende fra spores terminaler ved parring WGA-Alexa tracing med immunhistokemisk farvning for vesikulær glutamat transportør 2 (VGLUT2) og kokain og amfetamin reguleret udskrift peptid (CART) immunhistokemi (Reeber et al 2011;. Reeber og Sillitoe, 2011). Enanden mangel ved WGA-Alexa er, at det signal, nedbrydes relativt hurtigt på vævssnit, selvom det er monteret i medier, der beskytter det fluorescerende signal. Derfor er vi typisk billede vævet umiddelbart efter opskæring, selv om billedbehandling inden for 2 dage for at skære tillader stadig mærket fibre og terminaler at være vellykket afbildet. Der er en tendens til, at WGA-Alexa signal at miste intensitet under immunfarvning af vævssnit. Brug af færre og kortere vasker under farvningen kan minimere dette problem. En anden anbefaling er altid at montere og image et sæt af de spores vævssnit på dagen for at skære for en henvisning indstillet til at sammenligne med tilstødende sektioner, der vil blive behandlet for immunhistokemi. I vores hænder OLT (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA) indlejret væv blokke opbevares ved -80 ° C efter perfusion og cryoprotection kan opbevares i længere tid uden tab af tracer intensitet.

Vores approalm af sporing fibre som nemt kunne tilpasses til sporing neurale kort i kortikal, hjernestammen, og spinal veje. Vi er i øjeblikket undersøger muligheden for at bruge WGA-Alexa sporstoffer til in vivo billeddannelse af kredsløb dannelse i genetisk modificerede dyr, og til at studere dynamikken i kredsløbet dannes efter selektiv tarmkanalen læsioner og farmakologiske manipulationer. Siden den hurtige transport af WGA-Alexa sporstoffer giver mulighed for kortsigtede analyser vores tilgang har potentiale for at afsløre de dynamiske ændringer, som opstår i løbet af strukturel plasticitet topografiske kredsløb.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af nye investigator startfonde fra Albert Einstein College of Medicine af Yeshiva University til RVS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead sterilizer Fine Science Tools Model Steri 250 Cat. # 18000-45
Cauterizer Fine Science Tools Cat. # 18000-00
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus Cat. # 300056
Dual stage Glass Micropipette Puller Narishige International Model 001-PC-10
Micrometer syringe Gilmont Instruments Cat. # GS-1100
Small Animal Stereotaxic Instrument Kopf Instruments Model 940-A
Electrode Manipulator Kopf Instruments Model 960
Vetcare chamber Harvard Apparatus Cat. # 340508
Heating Pad Harvard Apparatus Cat. # 341241
Leica DFC360 FX camera Leica Microsystems DFC360 FX
Leica DFC490 camera Leica Microsystems DFC490
Leica DM5500 microscope Leica Microsystems DM5500
Leica DFC3000 FX camera Leica Microsystems DFC3000 FX
Leica MZ16 FA microscope Leica Microsystems MZ16 FA
CY3 Filter Leica Microsystems Model # 11600231
FITC Filter Leica Microsystems Model # 11513880
A4 DAPI/UV filter Leica Microsystems Model # 11504162
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Cat. #W11261
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen Cat. #W32464

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
  2. Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
  3. Mesulam, M. Tracing neural connections with horseradish peroxidase. Wiley. New York. (1982).
  4. Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. (2011).
  5. Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. (2011).
  6. Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
  7. Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
  8. Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neuroscience. 130, 735-744 (2005).
  9. Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
  10. Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
  11. Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics