Tissue Preparering og farging av Mouse Sensoriske nervefibre Innervating Hud og Limb Bones

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Immunocytochemical identifisering av perifere sensoriske nerve fiber undergrupper (og påvisning av protein uttrykk der) er nøkkelen til forståelsen av molekylære mekanismene bak perifere sensasjon. Her vil vi beskrive metoder for utarbeidelse av perifere / visceral vevsprøver, for eksempel hud og lemmer bein, for spesifikke farging av perifere sensoriske nervefibre.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Detection og primær behandling av fysiske, kjemiske og termiske sensoriske stimuli av perifere sensoriske nervefibre er nøkkelen til sensorisk persepsjon hos dyr og mennesker. Disse perifere sensoriske nervefibre uttrykker en mengde reseptorer og ion-kanalen proteiner som oppdager og initiere konkrete sensoriske stimuli. Metoder er tilgjengelige for å karakterisere de elektriske egenskapene av perifere sensoriske nervefibre innervating huden, som også kan benyttes til å identifisere funksjonelle uttrykket av spesifikke ionekanal proteiner i disse fibrene. Men lignende elektrofysiologiske metoder ikke er tilgjengelig (og er også vanskelig å utvikle) for påvisning av funksjonelle uttrykk av reseptorer og ion-kanalen proteiner i perifere sensoriske nervefibre innervating andre viscerale organer, inkludert de mest utfordrende vev som bein. Dessuten kan slike elektrofysiologiske metoder ikke kan benyttes til å bestemme uttrykket av ikke-hissige proteinS i perifere sensoriske nervefibre. Derfor gir farging av perifer / visceral vevsprøver for sensorisk nerve fivers best mulig måte å bestemme uttrykket av spesifikke proteiner av interesse i disse nervefibrene. Så langt har det meste av proteinet uttrykket studier i sensoriske nevroner benyttet farging prosedyrer i sensoriske ganglier, hvor informasjonen er begrenset til uttrykket av spesifikke proteiner i cellen kroppen av bestemte typer eller undergrupper av sensoriske nevroner. Her rapporterer vi detaljerte metoder / protokoller for utarbeidelse av perifere / visceral vevsprøver for farging av perifere sensoriske nervefibre. Vi spesielt detalj metoder for utarbeidelse av hud eller plantar punch biopsi og bein (femur) seksjoner fra mus for farging av perifere sensoriske nervefibre. Disse metodene er ikke bare nøkkelen til kvalitativ måling av protein uttrykk i perifere sensoriske nevroner, men også gi en kvantitativ analyse metode forbestemme endringer i protein uttrykk nivåer i bestemte typer eller undergrupper av sensoriske fibre, samt for å bestemme morfologiske og / eller anatomiske endringer i antall og tetthet av sensoriske fibre under ulike patologiske tilstander. Videre er disse metodene ikke begrenset til farging av bare sensoriske nervefibre, men kan også brukes til farging noen typer nervefibre i hud, bein og andre visceral vev.

Protocol

1. Animal Perfusjons

Alle dyr prosedyrer utført i denne studien er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Iowa, og følg NIH retningslinjer for bruk av dyr i forskning.

  1. På dagen før perfusjon, forberede en L av fosfat buffer (0,2 M PB i dobbelt destillert H 2 O, 7,4 pH), og oppbevar ved 4 ° C. Dette vil bli brukt for perfusjon og post-fiksering prosesser.
  2. På dagen for perfusjon, forberede 500 ml 4,0% Paraformaldehyde i 0.1m PB (PFA, 7,4 pH) fiksativ løsning, et volum tilstrekkelig for perfusjon av 2 mus: mikrobølgeovn 200 ml DDH 2 O i et glass begerglass for 30 sek eller til den nærmer seg kokepunktet. Tilsett 20 g av granulært Paraformaldehyde (PFA) til begerglasset med konstant omrøring under et avtrekksskap. Tilsett 5 ml av 5 N NaOH drop-klok og rør til løsningen forsvinner. Når PFA er helt oppløst, kjøle løsningen til romtemperatur (RT). Slowly tilsett 250 ml 0,2 M PB mens du rører kontinuerlig. Bruk gradvis svakere HCl-løsninger (6 N til 1 N til 0,1 N), juster pH til 7,4. Juster den endelige volumet til 500 ml og chill på is. Også forberede 400 ml 0,1 M PB fra 0,2 M lager ved å fortynne 1:1 i DDH 2 O og chill på is.
  3. Anesthetize musen ved intraperitonial injeksjon av en overdose bedøvelse (sodium pentobarbital, 80 mg / kg, administrert med en 27g nål).
  4. Under perfusjon, vil 50 ml 0,1 M PB (fortynne 0,2 M PB lager 1:1 med DDH 2 O) og 150 ml av PFA sendes sekvensielt inn musen sirkulasjon. Sett opp den peristaltiske pumpen ved å fylle slangen med PB og fikse en 23 1 / 2 G sommerfugl nål i den ene enden. Dypp den andre enden av slangen inn i begerglasset som inneholder 0,1 M PB. Sett hastigheten på den peristaltiske pumpen til 10 ml / min, og pumpe gjennom en tilstrekkelig mengde av løsningen for å sikre at det ikke er luftbobler i slangen.
  5. Vent til ennesthetized musen ikke lenger viser noen refleks aktivitet, for eksempel tå / halen klype og blunkerefleksen. Legg dyret på en disseksjon brett ventral siden opp inne i et avtrekksskap og sikre potene med tape. Spray pelsen med 70% etanol. Lag et snitt gjennom huden langs midtlinjen å avsløre brystkasse og den øverste fjerdedel av bukveggen. Deretter skjærer gjennom bukveggen ved foten av brystkasse. Etter at dette snittet, bør mellomgulvet og nedre enden av brystbeinet være synlig. Forsiktig kuttet fra venstre til høyre gjennom margin i mellomgulvet, og langs hele lengden av sternum, ta vare så du ikke skader lungene. Noen mindre blødninger fra sternum på dette stadiet er normalt og vil ikke kompromiss perfusjon. Når snitt langs brystbenet har blitt gjort og mellomgulvet kutt, bør det være mulig å løfte hver halvdel av brystkasse oppover og utover, slik at hjertet er utsatt. Flytt til side lungene hvis nødvendig. Begge halvdelene av brystkasse kanholdes i denne posisjonen med bruk av hemostatic klemmer. Sett butterfly nål (23 1 / 2 G) festet til peristaltiske pumpe 3-4 mm inn i venstre hjertekammer, parallelt med den lange aksen av dyret. Denne plasseringen minimerer risikoen for nålen bli forskyves. Lag et lite snitt i høyre atrium slik at avkastningen sirkulasjonen å strømme ut av hjertet.
  6. Begynn perfusjon med 0,1 M PB på 10 ml / min i 4-5 min. Hvis det er fortsatt en betydelig mengde blod som kommer fra høyre atrium på dette punktet, fortsetter inntil flyten er klart.
  7. Stopp strømmen av PB og slå innløpet på den peristaltiske pumpen til 4% PFA løsning. Reduser strømningshastigheten til 5 ml / min og gjenoppta pumping PFA løsning for 20-25 min. Som PFA entrer sirkulasjon, musklene gå inn i krampe, og etter noen minutter, bør dyret være bokstavelig "faste" i posisjon. Denne stivheten kan testes ved å forsiktig dytte mot hindpaws, ta vare ikke å flytte dyret ennd dislodge kanylen. God perfusjon vil hindre lem fra bøyer i respons. Når perfusjon med PFA er fullført, kan kanylen og hemostatic klemmer kobles fra og kadaveret forberedt på vev disseksjon. Den disseksjon tilnærmingen brukes, avhenger av spesifikke vev.
  8. Forbered 4% PFA / 5% (v / v) picric syre (PA, for innsamling og post-fiksering av plantar punsj only) ved å legge mettet pikrinsyreløsning til 4% PFA. Inkludering av PA forbedrer antigen detectability i perifert nevronale vev 1
  9. Forbered bein / brusk vev decalcifying / cryoprotectant løsning - 10% EDTA i 0,1 M PB med 0,07% glyserol og 15% sukrose. EDTA-baserte løsninger avkalke vev samtidig bevare epitoper 2.
  10. Klargjør cryoprotectant løsningen - 30% sukrose i 0,1 M PB.

2. Tissue Dissection / fjerning, Post-fiksering og seksjonering

  1. Plantar Punch
    Plasser perfused dyr ventral side ned på en klippe matte eller annen solid overflate. Holding foten plantar overflate-up, trykk godt ned med punsj biopsi verktøyet (3 mm diameter; Harris mikro-punch, Ted Pella Inc.) i midten av foten. Vri biopsi redskap frem og tilbake gjennom 180 grader for å bekrefte biopsien verktøyet har skjære gjennom helheten av hind labben. Fjern forsiktig biopsi verktøyet fra foten og ta ut vevet inn i sterile 2 ml rør med lokk, inneholder 1 ml 4% PFA / 5% PA løsning.
  2. Limb Bone (ex. Femur)
    Lag en lateral snitt langs ryggen på dyret på nivå med bekkenet, fortsetter ned langs begge baklemmene. Skåret i bekkenet og omkringliggende muskler for å skille femur fra bekkenet mens forlater proksimale hodet av femur intakt. Skjær inn i tibia / fibula å forlate den distale hodet intakt, fjerne de omkringliggende muskel / periosteum fra beinet akselen. Plasser femur i en 2 ml tube inneholder 1 ml 4% PFA /5% PA løsning.
  3. Post-feste vevsprøver i 4% PFA / 5% PA løsning, med milde miksing på en rocker for 16-18 t ved 4 ° C
  4. Avkalke vevet som følger: For plantar slag (til avkalke de små beina i foten) sted vevet punsj i en steril 2 ml rør med lokk, inneholder 1,5 ml av 10% EDTA-løsning på 0,1 M PB med 0,07% glyserol og 15 % sukrose. Plasser røret på en rocker med mild miksing for 16-18 t ved 4 ° C. For lem knokler plass vevet i en steril 2 ml rør med lokk, inneholder 1,5 ml av 10% EDTA-løsning på 0,1 M PB med 0,07% glyserol og 15% sukrose. Plasser røret på en rocker med mild blanding for 6-7 dager ved 4 ° C. Den avkalking Løsningen bør byttes hver 24. time og vevet overvåkes for tap av stivhet med en pinsett.
  5. Overfør vevet inn i en steril 2 ml rør med cap med 1,5 ml cryoprotectant løsning (30% sukrose i 0,1 M PB), og plasser røret på en rocker wed mild miksing for 16-18 t ved 4 ° C.
  6. Forbered vev for seksjonering: plassere en seng volum av optimal skjæring temperatur (OCT) compound (Sakura Finetek USA Inc.) på en cryostat vev montering blokk og la det fryse i cryostat kammeret (typisk opprettholdt ved -20 ° C). En kryogene aerosol (CYTO-fryse, Control Co USA) kan også sprøytes på OCT å akselerere frysing. Plasser vev eksemplar på denne seng av oktober og dekk med et ekstra tynt lag av oktober Forsiktig spray denne oktober med kryogen aerosol før det har herdet og vevet innenfor har frosset. Plasser prøven på kutte hodet i cryostat kammer og la vevet prøveblokken til stabilisering til å kutte temperatur - minst 1 time. Prøver å avsnitt når innebygging forbindelsen er fortsatt for kaldt resulterer i sprø seksjoner og vevsskade.
  7. Når vevet har nådd optimal kutting temperatur, begynne å skjære prøven og generere 40 mikrometer seksjoner.
  8. For plantar punsj samle cryosections inn i 12-brønn vev kultur plater som inneholder 0,1 M PB med 10 mM natriumazid. Pass på at delene forblir nedsenket i denne løsningen ved 4 ° C. Seksjoner kan lagres på denne måten i inntil 4-6 måneder for farging formål. Alternativt kan frittflytende seksjoner bli lagret på ubestemt tid i cryoprotectant løsning ved -20 ° C (500 ml 0,1 M PBS, 7,2 pH, 30 g sukrose, 10 PVP40 g, 300 ml etylenglykol). Juster siste bind å 1L med destillert vann) 3. For lem knokler samle cryosections direkte på gelatin forbelagte lysbilder (eller Superfrost Plus lysbilder, Fisher Scientific) og la det lufttørke for 1 time, før lagring ved -20 ° C. Bone seksjoner på lysbilder lagret på denne måten kan brukes til farging formål innen 2-3 måneder.

3. Farging av Tissue seksjoner for Sensoriske nervefibre

3.1. Plantar punsjseksjoner - flytende delen flekker

  1. Ved hjelp av et barberblad, kutt 6-7 mm fra enden av en 1 ml mikropipette spissen. Pre-betingelse innsiden av tuppen ved å aspirere 1% fetal bovint serum (FBS) i 0,1 M PB flere ganger (dette hemmer stikker av vevet seksjoner til veggene i spissen). Transfer plantar slag seksjonene til å være farget til en 24-godt vev kultur plate. Normalt 8-10 seksjoner bør være farget per brønn for å sikre flere høykvalitets seksjoner blir generert per farging.
  2. Vask plantar punsj seksjoner med 500 mL 0,1 M PB per brønn for 5 min med livskraftige miksing på en rocker på RT. Gjenta 2 ganger.
  3. Kast vaskeløsning og inkuber plantar slag seksjonene i blokkering løsning, bestående av 10% geit serum og 0,3% Triton X-100 på 0,1 M PB (500 mL av å blokkere løsning per brønn), med milde miksing på en rocker i 1 time ved 4 ° C.
  4. Kast blokkering løsningen og inkuberes vevet seksjoner i grunnskolen antibody / antistoffer fortynnes i 250 mL blokkering løsning for 18-24 timer med forsiktig miksing på en rocker ved 4 ° C. Basert på undersøkerens eksperimentelle krav, enkelt immunolabeling (med en primær antistoff mot et bestemt protein eller nerve fiber markør), eller dobbel immunolabeling (med to primære antistoffer mot to proteiner eller nerve fiber markører) kan utføres på den samme delen. Mens utfører dobbel immunolabeling det er viktig å kontrollere at de to primære antistoffer som brukes er oppvokst i forskjellige vert arter (for eksempel en oppvokst i mus og én oppvokst i kanin), eller alternativt, renset monoklonale antistoffer forskjellige immunoglobulin G (IgG) isotypes (f.eks en IgG1 og en IgG2a) kan brukes. Det anbefales å forsegle plate med Parafilm for overnatting inkubasjoner å unngå overdreven fordampning. For å farge de perifere sensoriske nervefibre, kan flere spesifikke antistoffer brukes. Antistoffer mot proteinet neurofilament 200 (NF200, Sigma) label Large-diameter fibre, mens calcitonin gen relatert peptid (CGRP, Sigma) og forbigående receptor potensielle vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) label peptidergic, liten diameter perifere sensoriske fibre. Alle perifere nervefibre kan også farges med antistoffer mot β3-tubulin. I huden, er kollagen IV (Abcam) brukes for å avgrense basalmembran som skiller overhuden fra dermis. Som en generell regel antistoffer trenger å være 5-10 ganger mer konsentrert enn for dyrket cellebasert immunfluorescens analyser, vanligvis i en arbeidsgruppe konsentrasjon på 5-10 mikrogram / ml.
  5. Vask vevet seksjoner med 500 mL av blokkering løsning (med Triton X-100) per brønn for 5 min med livskraftige miksing på en rocker på RT. Gjenta tre ganger.
  6. Kast vaskeløsning og inkuber vev seksjoner i passende fluoroforen-konjugert sekundære antistoffer (vanligvis fortynnet 1:1000 i blokkering løsning, 500 mL) med forsiktig miksing på en rocker ved 4 ° C. Platen must være innpakket i aluminiumsfolie for å unngå fotobleking av fluorophores.
  7. Vask vevet seksjoner med 500 mL av å blokkere løsning per brønn for 10 min med livskraftige miksing på en rocker på RT. Vask deretter med 500 mL 0,1 M PB med energisk blanding for 10 min ved RT. Til slutt, vask med 500 mL av 0,05 M PB med sprek miksing for 10 min ved RT.
  8. Bruk en 1 ml mikropipette med en FBS-behandlet tip (klipp 6-7 mm fra enden), aspirer delene fra vevet kultur plate og overføring til SuperFrost Plus mikroskop lysbilder. Ordne avsnittene og absorbere overflødig vaskebuffer med en fin pensel. Unngå langvarig eksponering for lys. Inkuber lysbilder på RT, slik at deler tørke seksjoner på lysbilde (50-30 min).
  9. Påfør flere dråper montering medium (ProLongGold, Vectashield eller lignende), sakte plassere et glass dekkglass på seksjoner. La lysbilder å sitte i mørket i 5 min, og deretter forsegle dekkglass kantene med gjennomsiktig spikerpolish. La luft-tørking i 15-20 min. Lysbildene kan nå bli visualisert eller lagret ved -20 ° C i flere år uten betydelig tap av fluorescens.

3.2. Limb bein seksjoner - på gli flekker

  1. La lysbilder å returnere til RT fra -20 ° C lagring. Ved hjelp av en hydrofob barriere penn (Super Pap Flytende Blokkering Pen, Ted Pella Inc.) circumscribe regionen på lysbildet som inneholder bein seksjoner å bli beiset med et sjenerøst lag av løsning. La det lufttørke i 10-15 min.
  2. Vask bein seksjoner med 250 mL 0,1 M PB per lysbilde i 5 min og gjenta for 2 flere ganger.
  3. Kast vaskeløsning og inkuber beinet seksjoner i blokkering løsning, bestående av 10% geit serum og 0,3% Triton X-100 på 0,1 M PB (250 mL av å blokkere løsning per lysbilde) for 1 t ved 4 ° C.
  4. Kast blokkering løsningen og inkuberes beinet seksjoner i primær antistoff (eller kombinasjon av primære antistoffer, i tilfelleav dobbelt immunolabeling som nevnt under 3.1.4) fortynnes i 250 mL blokkering løsning for 18-24 t ved 4 ° C. Det er svært viktig å merke seg at slides må plasseres i en fuktet kammer med forseglet lokk, for å unngå uttørking av primær antistoff løsning. For å farge de perifere sensoriske nervefibre, ovennevnte sett av antistoffer (se avsnitt 3.1.4) kan brukes med lignende arbeid konsentrasjoner.
  5. Vask vevet seksjoner med 250 mL av blokkering løsning (med Triton X-100) per lysbilde i 15 min ved RT og gjenta for 3 flere ganger.
  6. Kast vaskeløsning og inkuber bein seksjoner i passende fluoroforen-konjugert sekundære antistoffer (vanligvis fortynnet 1:1000 i blokkering løsning, 250 mL) ved 4 ° C. Den flekker kammeret må være innpakket i aluminiumsfolie for å unngå fotobleking av fluorophores. For enkelhets skyld, er det tilrådelig å bruke mørke flekker kamre (f.eks Slide inkubering brett / boks, RPI Corp).
  7. Wash beinet seksjoner med 250 mL av å blokkere løsning per lysbilde i 15 min ved RT. Vask deretter med 500 mL 0,1 M PB for 15 min ved RT. Til slutt, vask med 500 mL av 0,05 M PB for 15 min ved RT. Dypp kort i DDH 2 O å skylle lysbilder og deretter inkuber ved RT for å gi benet seksjonene lufttørke (50-30 min). Unngå langvarig eksponering for lys.
  8. Påfør flere dråper montering medium (ProLongGold eller lignende) og sakte plassere et glass dekkglass på seksjoner. La lysbilder stå i mørket i 5 min, og deretter forsegle dekkglass kantene med gjennomsiktig neglelakk. La tørke i 15-20 min. Lysbilder kan oppbevares ved -20 ° C i flere år uten tap av fluorescens.

Fire. Representant Resultater

4.1. Plantar slag seksjonene

Plantar punsj vev seksjoner kan visualiseres i henhold epifluorescence mikroskop, eller under en confocal mikroskop med en 10X, 40X eller 63X objektiv.

Figur 1
Figur 1. AD show farging med Kollagen IV antistoff (grønt) i kjelleren membraner, ved epidermal-dermal krysset og i brusk og muskel. Tallrike CGRP-(AB, rød) og NF200-positive fibre (CD, rød) er fordelt over hele musen huden i plantar regionen (piler). β3-tubulin er en pan-neuronal markør (E, red), mens TRPV1 flekker (F; rød) er i hovedsak begrenset til små-diameter fibre som også CGRP-positive (grønn, pilspisser). A og C er epifluorescence bilder tatt med en 10X objektiv (skala bar -500 mikrometer), B, D, E og F er confocal bilde kompositter generert fra en 11-image z-stack tatt på 2 mikrometer trinn under en 60X objektiv (skala bar - 50 mikrometer).

4.2. Limb bein seksjoner

Limb benvev seksjoner kan også visualiseres i henhold epifluorescence mikroskop, eller under en confocal microscope med en 10X, 40X eller 63X objektiv.

Figur 2
. Figur 2 viser farging med anti-CGRP (AB, rød, piler), anti-NF200 (CD, rød, piler), anti-β3-tubulin (E; rød) og anti-TRPV1 (F; rød) co-farget med anti-CGRP antistoff (grønn; piler). Disse bildene viser undergrupper av sensoriske nervefibre fordelt over hele benmatrise i spongy hodet regionen mus femur. A og C er epifluorescence bilder tatt med en 10X objektiv (skala bar -500 mikrometer), B, D, E og F er confocal bilde kompositter generert fra en 11-image z-stack tatt på 2 mikrometer trinn under en 60X objektiv (skala bar - 50 mikrometer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi detaljerte metoder for utarbeidelse av mus hud og benvev seksjoner for farging og påvisning av perifere sensoriske nervefibre. Delene produseres av plantar punsj biopsier inneholder både snau og hårete hud, noe som betyr at protokollen kan brukes på alle hudtyper. Disse teknikkene kan også brukes til å stain andre celletyper i disse vev (f.eks leukocytter, vaskulær endothelia, glatt muskulatur blant annet). Disse metodene gir et utmerket kompromiss mellom optimal ultrastructural bevaring (som oppnås ved glutaraldehyd fiksering, men ofte resulterer i avbrudd av epitoper og redusert farging flekker kvalitet) og immunocytochemical detectability, dersom prosedyrene er fulgt steg-for-trinn på en streng måte.

Påvisning av sensoriske nervefibre i disse vev kan hjelpe i vår forståelse av reguleringen av perifere neurite utvekst og spirende 4, ener vel som anatomiske forandringer i perifere sensoriske afferenter under ulike patologiske tilstander. Videre kan endringer i uttrykket av nevrotransmittere, reseptorer, ionekanaler eller andre fenotypiske markører i normal utviklingsmessige eller patologiske tilstander også bli studert 3,5-10. Sammen med passende elektrofysiologiske, biokjemiske og atferdsmessige testing, kan slike endringer i perifere sensoriske nevroner flekker mønstre brukes til å teste hypoteser knyttet til ulike smerte tilstander 6,9, betennelse 11 og nevropati 5,12. I konklusjonen, disse teknikkene gir en uvurderlig kilde til in vivo data som utfyller og forsterker andre anatomiske, strukturelle og funksjonelle data ervervet gjennom flere tilnærminger, fremme vår forståelse av regulering og erverv av plastisitet i perifere sensoriske nervefibre i helse og sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker dr. Yuriy M. Usachev for hans hjelp i den innledende standardisering av konfokalmikroskopi / avbildning av mus plantar punch biopsi farging, og Dr. Donna L. Hammond for hennes videre hjelp og konstruktiv kritikk i dette arbeidet. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra NINDS / NIH (NS069898), og en idéutvikling Grant Award fra Department of Defense Prostate Cancer Research Program (DoD-PCRP-101096) til DPM

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
  2. Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
  3. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
  4. Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
  5. Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
  6. Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
  7. Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
  8. Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
  9. Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
  10. Persson, A. -K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
  11. Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
  12. Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics