Ex Vivo Organotypische Corneal Modell der akuten Epithelial Herpes Simplex Virus Typ I Infection

Published 11/03/2012
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Neuroscience

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Summary

In diesem Video Artikel beschreiben wir die Verwendung eines neuen

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Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. J. Vis. Exp. (69), e3631, doi:10.3791/3631 (2012).

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Abstract

Herpes-Keratitis ist einer der schwerwiegendsten Pathologien, die mit dem Herpes-simplex-Virus-Typ 1 (HSV-1) zugeordnet ist. Herpes Keratitis ist derzeit die führende Ursache von sowohl Hornhaut abgeleitet und Infektion verbundene Blindheit in der entwickelten Welt. Typische Präsentation von Herpes-Keratitis umfasst Infektion der Hornhautepithel und manchmal die tiefere Hornhautstroma und Endothel, was zu solchen dauerhaften Hornhaut Pathologien als Narbenbildung, Ausdünnung, und Opazität ein.

Kornealen HSV-1 Infektion ist traditionell in zwei Typen von experimentellen Modellen untersucht. Die in vitro-Modell, in dem kultivierten Monolayer von Hornhautepithelzellen in einer Petrischale infiziert sind, bietet Einfachheit, hohe Reproduzierbarkeit und schnelle Experimente und relativ niedrigen Kosten. Auf der anderen Seite bietet das in vivo Modell, in dem Tiere wie Kaninchen oder Mäuse direkt in der Hornhaut geimpft, eine hochentwickelte physiologischeSystem, hat aber höhere Kosten, längere Experimenten tierischen notwendigen Sorgfalt und einen größeren Grad an Variabilität.

In diesem Video Artikel stellen wir eine detaillierte Demonstration einer neuen ex vivo Modell der Hornhautepithels HSV-1-Infektion, das die Stärken sowohl der in vitro und in vivo Modellen kombiniert. Die ex vivo-Modell nutzt intakten Hornhaut organotypically in Kultur gehalten und infiziert mit HSV-1. Die Verwendung des ex vivo-Modell ermöglicht eine hohe physiologische Basis Schlussfolgerungen, doch ist es sehr preiswert und erfordert Zeitaufwand vergleichbar mit der in vitro-Modell.

Protocol

Alle Reagenzien und Ausrüstung wurden gekauft wurden steril oder vor dem Verfahren sterilisiert. Dieser Artikel beschreibt die Schritte zum Einrichten der ex vivo-Modell beginnt mit einer Pre-entkernte Auge. In unseren Experimenten verwenden wir frische ganze Augäpfel aus jungen (8-12 Wochen) Albino-Kaninchen (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). Darüber hinaus nutzen wir die menschliche Hornhäute von der örtlichen Hornhautbank erhalten. Bei Durchführung Enukleation selbst darauf achten, dass eine Beschädigung der Hornhaut oder den Limbus während des Verfahrens. Kaninchen Enukleation Protokolle können an anderer Stelle 2 zu entnehmen.

Teil 1: Die Exzision des korneoskleralen Knopf

  1. Befeuchten Sie einen schmalen Streifen aus Gaze mit PBS und wickeln Sie es um den Augapfel zu erleichtern hielt sie während des Verfahrens.
  2. Mit einem scharfen Skalpell einen tangentialen Einschnitt in der Sklera zu machen, etwa 0,5 cm vom Limbus.
  3. Verwenden Sie eine scharfe Schere, um den Einschnitt und vollständig Verbrauchsteuern die corneoscleral Taste.
  4. Sobald die korneoskleralen Taste isoliert, necken sich die Blende während die Sklera Felge mit einer Pinzette. Vermeiden Sie Schäden am Endothel bzw. auszuüben übermäßige Belastung auf der Hornhaut.

Teil 2: Einführung der Cornea in Organotypische Kultur

  1. Explantierten Hornhäute werden in Minimum Essential Medium (MEM) mit Non-Essential Amino Acids (1X), L-Glutamin (2 mM), Penicillin (200 U / ml) und Streptomycin (200 ug / ml) kultiviert. Ein Antipilzmittel, wie Amphotericin, können ebenfalls zugesetzt werden, wenn notwendig.
  2. Vorbereiten einer 1% igen Lösung in Kulturmedium und halten es bereit bei 55 ° C
  3. Gründlich die Hornhaut in sterile PBS enthaltend Penicillin (200 U / ml) und Streptomycin (200 ug / ml).
  4. Legen Sie die Hornhaut epithelialen Seite nach unten in eine Vertiefung einer sterilen Tüpfelplatte.
  5. Fügen Sie die Agarose-haltigem Medium auf die endotheliale Konkavität der Hornhaut gerade genug, umfüllen Sie es vollständig aus. Lassen Sie ~ 1 min für die Agarose zu verfestigen.
  6. Legen Sie die Hornhaut mit dem tragenden Gerüst Gel epithelialen Seite nach oben in eine 35 mm Gewebekulturschale und fügen Kulturmedium, um die Epithelzellen bedecken.
  7. Die Hornhaut kann auf diese Weise über eine Woche kultiviert werden, wobei das Medium alle 48 Stunden.

Teil 3: Eine Infektion mit HSV-1 und Behandlung mit experimentellen Drogen

  1. 1 ml Medium, enthaltend die gewünschte Menge des Virus in eine 35 mm Gewebekulturschale. Wir arbeiten normalerweise mit 1x10 4 PFU von Stamm KOS HSV-1 pro Hornhaut zu infizieren. Unser Lager Titer indem Plaque-Assays auf CV-1 Monolayer bestimmt.
  2. Legen Sie die Hornhaut zusammen mit dem Agarose Gerüst epithelialen Seite nach unten in die Virus-haltigem Medium.
  3. Platzieren Sie die Hornhaut in einer Gewebekultur-Inkubator für 1 Stunde mit intermittierenden Schaukelstuhl alle 10-15 min infizieren.
  4. Nach 1 Stunde absaugen Virus-ContaiNing mittleren und spülen 2-3 mal mit PBS, um alle restlichen virale Partikel zu entfernen.
  5. Platzieren der Hornhaut wieder in seine vorherige Position und frisches Kulturmedium, um die epitheliale Oberfläche bedeckt.
  6. Experimentelle Therapien können vor oder nach der Infektion gestartet werden kann, je nach Art des Experiments.
  7. Kulturmedium wird alle 48 Stunden gewechselt.

Teil 4: Probenahme

  1. Medium für die Plaque-Assay-Analyse. Mischen Sie die Medium gut und verwenden Sie es sofort für einen Plaque-Assay oder bei -80 ° C für eine spätere Verwendung, wenn Sammeln von Proben zu verschiedenen Zeitpunkten.
  2. DNA, RNA, Protein oder Zellen von Hornhautepithel
    1. Entfernen Sie die Agarose Gerüst und spülen Sie die Hornhaut gut mit PBS.
    2. Excise der Ring aus Skleragewebe von der Hornhaut, dass nur Hornhautepithels Materials gewährleistet ist, gesammelt.
    3. Usingen ein Skalpell, schaben die kornealen Epithelzellen in die entsprechenden Puffer in Abhängigkeit von der Art des Materials zu isolieren. Für die Isolierung von DNA und RNA, verwenden wir die DNeasy Blood & Tissue Kit und die RNeasy Mini Kit bzw. (QIAGEN, Hilden, Deutschland). Für die Sammlung von Proteinlysate, verwenden wir Laemmli Puffer. Für Flusszytometrie Analyse Hornhautepithelzellen wir vorher inkubiere die Hornhäute in einer kleinen Menge von Trypsin, um die Zellen lösen, und verdrängen sie in Trypsin mit einem Skalpell. Da Abkratzen des Hornhautepithel ergibt keine gleiche Mengen von Gewebe, ist es wichtig, geeignete Kontrollen beinhalten bei der Analyse der Proben. Wir verwenden 18S rRNA als Referenz Transkript in qRT-PCR, GAPDH als Referenz-Gen in qPCRs und Nukleolin als Ladekontrolle für Western-Blots.
  3. Gewebeproben für die Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz
    1. Entfernen Sie die Agarose Gerüst und spülen Sie den Maisea gut mit PBS.
    2. Abhängig von Ihrer experimentellen Ziel, verwenden Sie die Hornhaut ein Paraffin Gewebe Block oder eine gefrorene Gewebe Block zu machen, wie in dem Video gezeigt. Wir folgen Standardverfahren bei der Vorbereitung Hornhautgewebe Abschnitte.

Repräsentative Ergebnisse

Die meisten der verfügbaren Methoden zur Untersuchung von Zellen in Gewebekultur kann leicht für den Einsatz in Hornhäute mit HSV-1 ex vivo infiziert angepasst werden. Sehen Sie hier repräsentative Ergebnisse für einige der am häufigsten verwendeten Techniken für das Studium HSV-1-Infektion - qPCR (1D), qRT-PCR (Abbildung 1B), Western Blot (1F), Plaque-Assay (Abbildung 1C) und Gewebe Immunfluoreszenz (1E).

Abbildung 1
Abbildung 1. Analyse der Hornhäute mit HSV-1 ex v infiziertivo. (A) Schematische Darstellung der ex vivo Modell der akuten Hornhautepithels HSV-1-Infektion. (BF) Analyse der Augenhornhaut infiziert mit der Methode in diesem Video Artikel beschrieben. Explantierten Kaninchenhornhäuten wurden mit 1x10 4 PFU / Hornhaut Stamm KOS HSV-1 infiziert und kultiviert in Gegenwart (PAA) oder Abwesenheit (Mock) von Phosphonoessigsäure (400 ug / ml), ein bekannter Inhibitor von HSV-Replikation. (B) Gesamt RNA wurde zu den angegebenen Zeitpunkten gesammelt, und die virale Transkription wurde durch qRT-PCR mit Primern für HSV-1-Polymerase beurteilt. Primern gegen 18S rRNA wurden als Referenz benutzt. n = 3 ist. Fehlerbalken zeigen ± SEM. (C) Das Kulturmedium wurde auf 48 hpi gesammelt und infektiöses Partikel Produktion wurde durch Plaque-Assay auf CV-1-Monoschichten beurteilt. (D) Gesamt-DNA wurde bei 48 hpi gesammelt und viralen Genom-Replikation wurde beurteilt ein qPCR Assay mit Primern für die HSV-1-Genom. PrIMers gegen GAPDH wurden als Referenz benutzt. n = 3 ist. Fehlerbalken zeigen ± SEM. (E) Mock-behandelten Hornhäute wurden auf 48 hpi, geschnitten, schockgefroren und analysiert durch indirekte Immunfluoreszenz auf die Anwesenheit eines viralen frühen Proteins (ICP8) innerhalb des infizierten Epithels. Kerne werden mit Höchst 33.258 gegengefärbt. (F) Proteinlysate wurden bei 48 hpi gesammelt, und die Expression eines viralen Proteins (ICP0) wurde durch Western-Blot bestimmt. BCA-Assay wurde verwendet, um gleiche Belastung der Proben zu gewährleisten. hpi = Stunden nach der Infektion.

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Discussion

In diesem Video Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung akuter Hornhautepithels HSV-1-Infektion in einem ex vivo-Modell. Dieses Modell ist ein nützliches Sprungbrett zwischen den in vitro und in vivo Modellen, weil es für physiologisch genaue Validierung der Zellkultur Ergebnisse ermöglicht und dadurch begrenzt die Menge von Tierversuchen, die durchgeführt werden müssen. Zusätzlich stellt die ex vivo Modell eine einzigartige Gelegenheit, und wertvolle epithelialen Herpes-Infektion bei intakte menschliche Hornhaut untersuchen. Outlined unten sind einige Überlegungen, die berücksichtigt werden, wenn Sie dieses Modell muss:

  • Es ist wichtig zu betonen, dass der Ansatz in diesem Video Artikel beschrieben ist nicht dazu gedacht, um ein Modell der Herpes-Keratitis, sondern ist eher ein Modell der akuten Hornhautepithels HSV-1-Infektion. Herpes-Keratitis ist ein Ergebnis mehrerer Confounding Prozesse, einschließlich Infektion, Entzündung und dem Host imImmunantwort gegen das Virus. Antigen-spezifische CD4 + und CD8 + T-Zell-Reaktionen sind ein wesentlicher Bestandteil der Pathogenese von Herpes-Keratitis, die in diesem Modell nicht reproduziert werden kann, weil explantierten Hornhäute nicht unterliegen, Infiltration von Zellen des Immunsystems. Aus diesem Grund haben sie sich nicht entwickeln die typischen epithelialen dendritische Ulzera und fehlt das Stroma Einbeziehung klassisch bei Herpes Stromakeratitis 3 beobachtet. Daher erziehlt der Schwere der Erkrankung und Fluorescein Bildgebung von Hornhautgeschwüren nicht im ex vivo Modell möglich. Darüber hinaus sind die meisten Fälle von Herpes-Keratitis durch virale Reaktivierung aus der Latenz verursacht. Da unser Ansatz stützt sich auf direkte Infektion von explantierten Hornhäute mit exogenen Virus, modelliert es akuten HSV-1 Hornhautinfektion und nicht Reaktivierung Krankheit. Aus diesen Gründen ist die hier vorgestellten Modell nicht für das Verständnis des Gesamtsystems der Pathologie der Erkrankung, sondern should verwendet, um virale Replikation und Virus-Wirt-Wechselwirkungen strikt studieren im Hornhautepithel werden.
  • Die ex vivo Herpes-Keratitis führt zu Ergebnissen mit größerer Variabilität als die in vitro Gewebekultur Experimente. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß jeder Hornhaut aus einem anderen Kaninchen gesammelt und können geringfügig unterschiedlich verarbeitet werden. Menschlichen Hornhaut zeigen eine noch größere Variabilität der Ergebnisse als Kaninchenhornhäuten, weil sie von Spendern Variable Alter, Rasse und Gesundheitszustand stammen und für unterschiedliche Mengen an Zeit Obduktion erhalten. Jedoch mit der Verwendung von mindestens fünf Hornhäute pro experimenteller Behandlung, konnten wir statistisch zuverlässige Daten zu erzeugen.
  • Das traditionelle Verfahren zum Kultivieren explantierten Hornhäute 4-5 schlägt mit gerade genug Kulturmediums auf den Limbus der Kornea abzudecken. Wir fanden, dass die Erhöhung der Menge des Mediums vollständig abzudecken das Epithel einheitlichere Ergebnisse liefert,wahrscheinlich aufgrund der Minimierung der Unterschiede zwischen den einzelnen Hornhäute den Zugang zu den mittel-und experimentellen Medikamenten darin enthalten sind.
  • Bei Verwendung Kaninchenhornhäuten für jede Anwendung unter Verwendung von Antikörpern, ist es wichtig, im Auge zu behalten, dass die traditionellen Antikörper mit Spezifitäten von Mensch, Maus, Ratte usw. wahrscheinlich nicht gegen Kaninchen Antigenen kreuzreagieren sind. Zusätzlich kann sekundären Anti-Kaninchen Antikörper natürlich nicht in diesen Anwendungen verwendet werden. Aus diesen Gründen verwenden wir menschlichen Hornhaut in Experimenten mit Antikörperfärbung zellulärer Ziele.
  • Beim Sammeln von Epithelzellen für die Durchflusszytometrie-Analyse muss der Experimentator vorsichtig über die Auswirkungen von Trypsin auf membrangebundene Proteine. So zum Nachweis von Oberflächenproteinen, kann es vorteilhaft sein, andere Mittel Ablösen der Zellen, wie Kollagenasen oder Nicht-Trypsin-Proteasen verwendet werden.
  • Tiermodelle von Herpes-Keratitis vertrauen auf kornealen scarification vor der Inokulation mitdas Virus. Wir konnten ein einheitliches Niveau der Infektion ohne Vertikutieren die explantierten Hornhaut zu erreichen. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Abwesenheit des Tränenfilms und Blinken dass rasch beseitigen das Virus aus der Hornhautoberfläche in einem lebenden Tier.

Mögliche Änderungen der ex vivo Herpes-Keratitis Modell nicht erforscht in diesem Video Artikel:

  • Genetischen Modifizierung Hornhautepithelzellen vor HSV-1-Infektion unter Verwendung von DNA Versandmethoden in Zellkultur und in der Gentherapie Forschung, wie Transfektion, virale Lieferung und Gen Spritzmassen 6 ausgenutzt.
  • Verwenden der GFP-exprimierenden HSV-1 7-8 oder FITC-konjugiertem Anti-HSV-Antikörpern 9-10, visuell bewertet, inwieweit der Infektion.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Die Unterstützung der Lions Eye Bank of Delaware Valley war für diese Arbeit von unschätzbarem Wert. Primäre Maus-monoklonaler Antikörper gegen ICP8 war eine Art Geschenk von Dr. David Knipe (Harvard Medical School). Wir danken auch Dr. Stephen Jennings (Drexel University College of Medicine) und Dr. Peter Laibson (Wills Eye Institute) für hilfreiche Diskussionen und Know-how.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium (MEM) Mediatech, Inc. 10-010-CV
Non-Essential Amino Acids (100x solution) Mediatech, Inc. 25-025-CI
L-Glutamine Mediatech, Inc. 25-005-CI
Penicillin G Sodium Salt Sigma-Aldrich P3032
Streptomycin Sulfate Salt Sigma-Aldrich S9137
Agarose Invitrogen 15510-027
Phosphate Buffered Saline (PBS) Prepared in Lab N/A
Trypsin EDTA (1x) Mediatech, Inc. 25-053-CI
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Laemmli Buffer Prepared in Lab N/A
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound Tissue-Tek 4583
Whole Rabbit Eyes (Young) Pel-Freez Biologicals 41211-2
Human Corneas and Whole Eyes Local Supplier N/A
12 Well Porcelain Spot Plate Avogadro’s Lab Supply 1877
35 mm Tissue Culture Dish Falcon BD 353001
6 Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One 657160
Cryomold Intermediate Tissue-Tek 4566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaye, S., Choudhary, A. Herpes simplex keratitis. Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).
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