वर्णक्रमीय Karyotyping पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग के साथ मनुष्य और चूहे में गुणसूत्र असामान्यताओं का अध्ययन

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Summary

वर्णक्रमीय Karyotyping (स्काई) एक उन्नत कोशिकाजननप्रकरण के जीनोमिक और गुणसूत्र aberrations की पहचान तकनीक है. इस तकनीक गुणसूत्र चित्रकला जांच का लाभ लेता है, जो सभी गुणसूत्रों के वर्गीकरण की अनुमति है. स्काई भी जटिल पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग सहित विभिन्न रोगों के साथ चूहों और मनुष्य में गुणसूत्र aberrations के अलगाव दोष की पहचान कर सकते हैं.

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AbouAlaiwi, W. A., Rodriguez, I., Nauli, S. M. Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease. J. Vis. Exp. (60), e3887, doi:10.3791/3887 (2012).

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Abstract

Protocol

1. सेल pretreatment और मेटाफ़ेज़ तैयारी

  1. कोशिकाओं ईगल (DMEM मध्यम) 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर साथ 10-15% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 37 डिग्री सेल्सियस से युक्त है Dulbecco संशोधन में बड़े हो रहे हैं, जब तक वे 70-80% confluency तक पहुँचने.
  2. 30-60 मिनट के लिए 0.05 / μg मिलीलीटर में colcemid समाधान के साथ कोशिकाओं का इलाज.
  3. 50 मिलीलीटर बाँझ बाज़ अपकेंद्रित्र ट्यूबों में किसी भी अस्थायी कोशिकाओं से युक्त मध्यम ले लीजिए. कोशिकाओं कुल्ला sterile1X पीबीएस के साथ थाली पर. 1-2 मिनट, फसल और एक ही ट्यूब में शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए बाँझ trypsin साथ incubating के बाद.
  4. 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर ट्यूबों स्पिन करने के लिए, सतह पर तैरनेवाला छोड़ने 0.5 मिलीग्राम महाप्राण (व्यंजन) और उंगली के साथ ही flicking द्वारा गोली ढीला.
  5. गोली के आकार पर निर्भर करता है, DH 2 हे में 0.56% KCl के hypotonic समाधान के 5-10 मिलीलीटर जोड़ने और 37 ° C पर 30-45 मिनट के लिए निलंबन सेते हैं.
  6. मेथनॉल / एसिटिक एसिड की एक बूंद जोड़ें(3:1 वॉल / वॉल) hypotonic सेल निलंबन के प्रति मिलीलीटर ट्यूब और मिश्रण के लिए धीरे पलटना.
  7. 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर अपकेंद्रित्र और 1.4 कदम के रूप में गोली इकट्ठा, तो 5 ताजा मेथनॉल / एसिटिक एसिड (3:1 वॉल / वॉल) लगानेवाला समाधान dropwise है मिलीलीटर जोड़ने जबकि गोली लगातार flicking के. यह प्रक्रिया महत्वपूर्ण है ताकि मेटाफ़ेज़ फैलता clumps 'कोशिकाओं जो प्रयोग समझौता होगा में नहीं फंस जाएगा.
  8. फिर 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर अपकेंद्रित्र और बहुत ठंडा / ट्यूब की दीवार के साथ एसिटिक एसिड लगानेवाला मेथनॉल के 5-10 मिलीलीटर जोड़ें. इस स्तर पर, अगर जरूरत है, कोशिकाओं अल्पावधि या -80 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एक कड़ा और सील ट्यूब में लगानेवाला समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है ° C भविष्य के उपयोग के लिए लंबी अवधि (वर्ष) के लिए.
  9. पूर्ण इथेनॉल में साफ स्लाइड, तब DH 2 हे approximately10X के लिए स्लाइड की डुबकी क्रम में स्लाइड की सतह पर पानी की एक म्यान के रूप में. एक गिलास और सेल निलंबन के 15 20μl ड्रॉप थाली पर स्लाइड (1.8 कदम से रखेंस्लाइड ऊपर एक पानी 65-70 में निर्धारित स्नान डिग्री सेल्सियस में) 10 से 1-2 मिनट के लिए स्लाइड और जगह के लिए सूखी अनुमति देते हैं.
  10. एक प्रकाश 10X और 40X सूखी यकीन है कि वहाँ है मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों और फैलता है समान रूप से स्थान बनाने के उद्देश्यों का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे स्लाइड की जाँच करें. Cytoplasm के गुणसूत्रों आसपास उपस्थिति के लिए जाँच करें. यदि cytoplasm वर्तमान स्लाइड pretreatment (पेप्सिन पाचन) के साथ आगे बढ़ना है, अगर कोई cytoplasm में मौजूद है और क्रोमोसोम अच्छा आकारिकी है, तो स्लाइड pretreatment के लिए कोई जरूरत नहीं है.

2. स्लाइड pretreatment (पेप्सिन उपचार)

  1. 1:200 RNase समाधान (20 मिलीग्राम / एमएल) एक 24 x 60 मिमी खुर्दबीन coverglass मिमी पर 2X - एसएससी में भंग के 120 μl लागू करें और चेहरा पलटना मेटाफ़ेज़ स्लाइड नीचे तो धीरे coverglass पर मेटाफ़ेज़ स्लाइड चेहरा पलटना और पर सेते हैं 37 ° सी 45 मिनट के लिए.
  2. ध्यान से स्लाइड scratching के बिना coverglass हटाने और एक coplin जार में 2X-एसएससी बफर में धो 15 मिनट के लिए हर 5 मिनटझटकों के साथ.
  3. एक साफ बीकर में पेप्सिन स्टॉक समाधान की 5-15 μl (100 मिलीग्राम / DH 2 हे में मिलीलीटर) को जोड़ें और फिर prewarmed की 100 मिलीलीटर जोड़ने (37 डिग्री सेल्सियस) 0.01M एचसीएल यह महत्वपूर्ण है कि एक साफ पेप्सिन में जोड़ा जाता है. पहली और बीकर एचसीएल समाधान में सीधे नहीं है, अन्यथा यह समाधान में भंग नहीं coplin 37 में एचसीएल / पेप्सिन समाधान युक्त जार में स्लाइड को सेते हैं. ° 3-5 मिनट के लिए सी. यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है के रूप में भी बहुत पाचन गुणसूत्रों overdigested जा करने के लिए और भी कारण थोड़ा पाचन cytoplasm पचाया नहीं छोड़ जो गैर विशिष्ट जांच के बंधन करने के लिए नेतृत्व है और संकरण संकेत के साथ हस्तक्षेप कर सकता है जाएगा.
  4. Coplin कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए दो बार 100 मिलीलीटर 1X - पीबीएस युक्त जार में स्लाइड धो लें.
  5. एक coplin कमरे के तापमान (1X - पीबीएस की 950 मिलीलीटर में 50 मिलीलीटर की 1M MgCl 2) में 5 मिनट के लिए 100 मिलीलीटर 2 1X-PBS/MgCl युक्त जार में स्लाइड धो लें.
  6. एक coplin जार containin में स्लाइड प्लेसजी कमरे के तापमान (2 1X-PBS/MgCl की 100 मिलीलीटर में 37% formaldehyde के 1.7 मिलीग्राम) में 10 मिनट के लिए 100 मिलीलीटर 1% formaldehyde.
  7. Coplin 5 मिनट के लिए 100 मिलीलीटर 1X - पीबीएस युक्त जार में स्लाइड धो लें.
  8. एक प्रकाश 40X शुष्क लेंस का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि स्लाइड ठीक से पच रहे हैं और कोई cytoplasm में मौजूद है और गुणसूत्र आकारिकी संरक्षित है खुर्दबीन के नीचे स्लाइड निरीक्षण. संकरण एक हीरे की कलम का उपयोग करने के लिए एक क्षेत्र का चयन करें.

3. गुणसूत्र और जांच विकृतीकरण और संकरण

  1. ताजा denaturing (70% formamide/2X एसएससी, 7.0 पीएच) समाधान और 70-80 के लिए prewarm डिग्री सेल्सियस एक एक पानी स्नान प्लेस में coplin स्लाइड रखा coplin 70 में एक नहाने के पानी में denaturing समाधान युक्त जार में जार में ° तैयार माउस क्रोमोसोम और 80 के लिए सी डिग्री सेल्सियस 30 - 1.5 मिनट के लिए मानव गुणसूत्रों के लिए.
  2. तुरंत बर्फ ठंड 70% इथेनॉल में 3 80% और 100% 3 मिनट प्रत्येक और शुष्क हवा के लिए इथेनॉल मिनट के लिए स्लाइड जगह है. स्लाइड की जांच करनागुणसूत्र आकारिकी के लिए. अच्छा गुणसूत्र morphology अंधेरे गुणसूत्रों और नहीं "चरण प्रकाश" या गुणसूत्रों प्रभामंडल के द्वारा चिह्नित है.
  3. 37 ° सेल्सियस पर 20 मिनट, भंवर, अपकेंद्रित्र और के लिए संक्षेप में कुछ सेकंड के लिए 1000 rpm पर हिल के साथ, SkyPaint जांच (# 1 शीशी स्काई रंग किट) गर्म.
  4. 85 ° C पर एक दो कदम चक्र के लिए 5 मिनट के बाद 60 मिनट preannealing के लिए लेबल जांच डीएनए की अनुमति के लिए 37 ° C चक्र के लिए क्रमादेशित thermocycler में जांच denature.
  5. संकरण और कवर के क्षेत्र पर एक 22 मिमी के साथ विकृत जांच की 10μl लागू x 40 मिमी हवाई बुलबुले नहीं जाल सुनिश्चित करने coverglass. रबर और humidified कक्ष में सीमेंट सेते हैं साथ coverglass के किनारों 48-72 घंटे के लिए 37 ° C पर सील.

4. फ्लोरोसेंट जांच का पता लगाने

  1. Coverglass ध्यान से निकालें और स्लाइड एक coplin युक्त जार में जगह prewarmed (45 डिग्री सेल्सियस) समाधान धोने मैं (हौसले से तैयार 2X एसएससी में 50% formamide). 5 मिनट के लिए धो डालें45 से कम तीन बार ° मिलाते हुए 45 rpm पर पानी के स्नान में सी
  2. धो समाधान द्वितीय (1X एसएससी) के 45 में मिलाते साथ ° सी 5 मिनट के लिए दो बार धोने में स्लाइड.
  3. 5 मिनट के लिए समाधान तृतीय (4X SSC/0.1 बीच 20%) 45 ° धोने झटकों के साथ सी में स्लाइड धो लें.
  4. अवरुद्ध अभिकर्मक की 80 μl (स्काई रंग किट, # 2 शीशी) लागू करने के लिए, 37 ° C पर 30 मिनट के लिए एक coverslip सेते हैं और जगह है.
  5. स्लाइड निकालें और तरल पदार्थ के निकास के लिए अनुमति देते हैं. Cy5 धुंधला अभिकर्मक (केंद्रित एंटीबॉडी जांच सीएडी किट, शीशी # 3) के 80 μl लागू करने के लिए, 37 ° C पर 40 मिनट के लिए एक coverglass और सेते हैं लागू होते हैं.
  6. 45 डिग्री सेल्सियस पर समाधान III 5 मिनट के लिए झटकों के साथ तीन बार धोने के साथ स्लाइड धो लें.
  7. Cy5.5 धुंधला अभिकर्मक (केंद्रित एंटीबॉडी जांच सीएडी किट, शीशी # 4) का 80 μl लागू करने के लिए, 37 ° C पर 40 मिनट के लिए जगह एक coverglass और सेते हैं.
  8. 45 डिग्री सेल्सियस पर समाधान III 5 मिनट के लिए झटकों के साथ तीन बार धोने के साथ स्लाइड धो लें.
  9. स्लाइड झुकाव और तरल पदार्थ करने की अनुमति नाली. विरोधी फीका DAPI अभिकर्मक (स्काई रंग किट, शीशी # 5) का 20 μl लागू करते हैं और एक 24 x 60 मिमी खुर्दबीन coverglass मिमी जगह है. ध्यान से हवाई बुलबुले का गठन हो सकता है हटा दें. स्लाइड तुरंत imaged किया जा सकता है या 4 में संग्रहीत ° 1 सप्ताह की तुलना में नहीं के लिए अंधेरे में सी.

5. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. छवि अधिग्रहण मेटाफ़ेज़ एक ओलिंप 60x तेल विसर्जन लेंस, एक वर्णक्रमीय घन (कस्टम डिजाइन ट्रिपल बैंड पास फिल्टर), एक DAPI फिल्टर और एक सीसीडी कैमरे के साथ एक sagnac interferometer मॉड्यूल के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्लाइड देखने के द्वारा पूरा किया है.
  2. वर्णक्रमीय-Karyotypes उपयोगकर्ता पुस्तिका के बाद स्काई देखें सॉफ्टवेयर (एप्लाइड वर्णक्रमीय इमेजिंग 1.62 संस्करण) का उपयोग कर किए गए.
  3. छवियों का विश्लेषण करने के बाद, गुणसूत्रों रंग छवियों (विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंगों के साथ), छद्म रंग छवियों (वर्गीकरण लिए रंग के साथ) और उल्टे DAPI छवियों (विशिष्ट बैंडिंग पैटर्न) के रूप में देखा जा सकता है.
e_title "> 6 प्रतिनिधि परिणाम.

एक पूरी स्काई प्रक्रिया आमतौर पर के बारे में एक सप्ताह का समय (चित्रा 1) लेता है. इस छवि के अधिग्रहण और विश्लेषण कि मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं पर्याप्त आपूर्ति में हैं शामिल हैं. Karyotyping विश्लेषण जंगली प्रकार चूहों (2a चित्रा) से कोशिकाओं की सामान्य माउस कुपोषण (40, XY) से पता चलता है. इसके विपरीत में, Pkd1 से कोशिकाओं / - माउस (PKD माउस मॉडल) गुणसूत्र संख्या और गुणसूत्र (क्रोमोजोम # 8) विलोपन और translocations (क्रोमोसोम # 11 और 19) (चित्रा 2b) के रूप में संरचनात्मक असामान्यताएं, में एक उल्लेखनीय वृद्धि दर्शाता है. हम भी ADPKD रोगियों से संवहनी ऊतकों का विश्लेषण किया. गुणसूत्र संख्या की गणना के द्वारा एक सरल अध्ययन में संकेत दिया कि गैर - से ADPKD और कुछ नमूने ADPKD संवहनी 23 जोड़े के सामान्य गुणसूत्र संख्या (चित्रा 2c) था. सामान्य में, तथापि, हम गुणसूत्र अलगाव की विफलता मनाया, एक में क्रोमोसोम के 46 जोड़े में जिसके परिणामस्वरूपDPKD नमूने के बजाय 23 जोड़े (चित्र 2 डी).

चित्रा 1
आकृति 1. स्काई प्रोटोकॉल प्रवाह संचित्र. स्काई प्रोटोकॉल का फ्लो चार्ट के लिए एक सेल pretreatment और मेटाफ़ेज़ तैयारी से छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए शुरू प्रयोग को पूरा करने के लिए कदम दिखाता है. एक अनुमानित समय एक सप्ताह के प्रत्येक दिन के लिए कदम दर कदम प्रक्रिया के साथ बाईं तरफ के प्रस्तुत किया है.

चित्रा 2
चित्रा 2. अमर माउस सेल लाइनों और हौसले से अलग मानव प्राथमिक कोशिकाओं पर वर्णक्रमीय karyotyping के रंग और व्यक्तिगत क्रोमोसोम के उल्टे DAPI छवियों से गुणसूत्र छँटाई से पहले दिखाया जाता है. छँटाई के बाद, क्रोमोसोम "वर्गीकरण" तालिका में प्रस्तुत कर रहे हैं) जंगली प्रकार माउस से एक मेटाफ़ेज़ प्रसार की स्काई छवि सामान्य कुपोषण होता है (40, XY). ख) / - माउस असामान्य गुणसूत्र (68 के बजाय 40) संख्या और गुणसूत्र (# गुणसूत्र 8) विलोपन और गुणसूत्र translocations (क्रोमोसोम # 11 और 19) के रूप में गुणसूत्र असामान्यताएं पता चलता है ग) स्काई rong> Pkd1 से मेटाफ़ेज़ प्रसार की स्काई छवि गैर ADPKD रोगी की संवहनी ऊतक से एक मेटाफ़ेज़ प्रसार की छवि सामान्य कुपोषण (46, XX) घ.) ADPKD रोगी के संवहनी ऊतक से एक मेटाफ़ेज़ प्रसार की की स्काई छवि असामान्य कुपोषण होता है (92, XXXX) है. डेटा के कुछ हिस्सों को पहले से सूचित किया गया है और अनुमति के साथ 14 से reused.

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Discussion

वर्णक्रमीय Karyotyping (स्काई) एक कोशिकाजननप्रकरण जीनोमिक और गुणसूत्र रचनाओं के अध्ययन में तकनीक का इस्तेमाल किया है. इस तकनीक गुणसूत्र चित्रकला जांच का लाभ लेता है, और इन जांच का पता लगाने एक sagnac interferometer के माध्यम से अर्जित कर रहे हैं. पूरा स्काई प्रक्रिया के आमतौर पर के बारे में एक सप्ताह लेता है, और यह कई महत्वपूर्ण कदम (चित्रा 1) शामिल है. स्काई एक मानक प्रोटोकॉल, जो पहली बार Padilla नैश एट 3 अल द्वारा वर्णित किया गया है का उपयोग करता है. प्रोटोकॉल के बाद से हमारा सहित विभिन्न कोशिकाजननप्रकरण प्रयोगशालाओं द्वारा अनुकूलित किया गया है.

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम के अलावा, एक अच्छी गुणवत्ता मेटाफ़ेज़ तैयारी अत्यंत महत्वपूर्ण है एक सफल स्काई विश्लेषण है. उदाहरण के लिए, अगर बहुत ज्यादा गुणसूत्रों cytoplasm है या अगर स्लाइड बहुत पुराने हैं, छवियों की गुणवत्ता से समझौता किया जा सकता है. हमारे फिल्म क्लिप में देखा है, cytoplasm से सामग्री को आसानी से अंतर का एक उच्च संकल्प का उपयोग कर की पहचान कर सकते हैंहस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी तकनीक. इसके अलावा, सक्रिय रूप से कोशिकाओं को विभाजित की उपलब्धता स्काई विश्लेषण के लिए एक शर्त है, इस colcemid साथ एक लंबे समय या अन्य विकास कारकों की कोशिकाओं के लिए एक अतिरिक्त के लिए उपचार के द्वारा दूर किया जा सकता है. स्काई की समग्र सफलता दर कौशल और उपयोगकर्ता के अनुभव पर काफी हद तक निर्भर है.

स्काई गुणसूत्र विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली और विश्वसनीय उपकरण सहित एक ही गुणसूत्र में संरचनात्मक परिवर्तन, प्रदान करता है. सेलुलर polyploidy के अलावा, स्काई गुणसूत्र सम्मिलन, हटाना, duplications और translocations अध्ययन की संभावना प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, स्काई उपन्यास और छुपा गुणसूत्र aberrations और कैंसर के विकास और 15 प्रगति के दौरान जटिल rearrangements की पहचान की पहचान की अनुमति देता है. इसके अलावा, स्काई के तुलनात्मक कोशिकाजननप्रकरण, जो विकास के दौरान 4 गुणसूत्र rearrangements अध्ययन के भीतर किया गया है एक अनुसंधान के क्षेत्र में लागू है. स्काई तकनीक का उपयोग करनाहमारी प्रयोगशाला चूहों और पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग के साथ मनुष्य (चित्रा 2) में गुणसूत्र असामान्यताओं की पहचान बन जाता है. इसमें कोई शक नहीं है कि स्काई कई अन्य गुणसूत्र जुड़े रोगों में लाभकारी होगा. वास्तव में, हम प्रस्ताव है कि स्काई भी कई cilia के रोगजनन से संबंधित है, जहां cilia के सेल 14 विभाजन को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है में उपयोगी होगा.

क्योंकि माउस और चूहा महत्वपूर्ण पशु मॉडल के लिए एक बीमारी की व्यवस्था का अध्ययन करने और vivo में एक कार्यात्मक मूल्यांकन, स्काई विश्लेषण के लिए माउस और चूहा जांच के विकास के माउस और चूहा गुणसूत्रों की दिनचर्या karyotyping की अनुमति प्रदर्शन. वर्तमान में, स्काई इसलिए मानव माउस, और चूहा में गुणसूत्र के अध्ययन के लिए सीमित है. हालांकि, के रूप में और अधिक अनुसंधान प्रयोगशालाओं अन्य प्रजातियों का उपयोग करने के लिए जीनोमिक रचनाओं का अध्ययन, यह निकट है कि विभिन्न जीवों के लिए अधिक गुणसूत्र चित्रकला जांच जल्द ही व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो जाएगा.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखक ब्रायन Muntean, शाओ लो, माकी ताकाहाशी और ब्लेयर बितर करने के लिए उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम (DK080640) NIH और Toledo और ProMedica translational अनुसंधान उत्तेजना डॉ. सूर्य Nauli के लिए पुरस्कार के विश्वविद्यालय से पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Cellgro 10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30088-03
Penecillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Inc. SV30010
Colcemid Roche Group 10 295 892 001 10 μg/ml
HCl Fisher Scientific A144-500
KCl Fisher Scientific S77375-1
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30256-01
SKY paint probe kit (Human) Applied Spectral Imaging SKY000028
SKY paint probe kit (Mouse) Applied Spectral Imaging SKY000030
Concentrated antibody detection kit Applied Spectral Imaging SKY000033
Trypsin Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30236.01
Methanol Fisher Scientific A433P-4
Acetic acid Fisher Scientific A38-212
RNase A Roche Group 10 109 169 001
Pepsin Sigma-Aldrich P6887-5G
MgCl2 Fluka 63069-500ML
37% Formaldehyde Mallinckrodt Baker Inc. 2106-02
20X SSC Promega Corp. V4261
Formamide Fluka 47671 prepare just before use
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Microscope glass slides Fisher Scientific 12-549
Microscope cover glass 24x60mm VWR international 16004-312
Rubber cement Elmer’s
Hybridization/ humidifiedchamber/Tray Simport M920-2 put wet paper towels at the bottom
Thermocycler Eppendorf Epgradient S
Shaking platform/Orbital shaker Bellco Glass
Shaking/water bath Precision Scientific
DAPI filter cube Chroma Technology Corp.
SKY filter cube Chroma Technology Corp.
SpectraCube Applied Spectral Imaging
Inverted cell culture microscope Nikon Instruments Nikon Eclipse TS100
Fluorescence microscope Olympus Corporation IX70 60X oil

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References

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