Spectral karyotyping til Studieinformationen kromosomfejl hos mennesker og mus med polycystisk nyresygdom

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Spectral karyotyping (SKY) er en avanceret cytogenetik teknik til at identificere genomiske og kromosomforandringer. Denne teknik drager fordel af kromosom maleri prober, hvilket muliggøre klassificering af alle kromosomer. SKY kan også identificere komplekse kromosomafvigelser og adskillelse mangler i mus og mennesker med forskellige sygdomme, herunder polycystisk nyresygdom.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

AbouAlaiwi, W. A., Rodriguez, I., Nauli, S. M. Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease. J. Vis. Exp. (60), e3887, doi:10.3791/3887 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Konventionel metode at identificere og klassificere individuelle kromosomer afhænger af den unikke banding mønster af hvert kromosom i en specifikke arter, der analyserede 1, 2. Denne klassiske banding teknik, imidlertid, er ikke er pålidelig i at identificere komplekse kromosomforandringer såsom dem associeret med cancer. For at overvinde de begrænsninger af banding teknik, er Spectral karyotyping (SKY), indført til at give meget pålidelige oplysninger om kromosomfejl.

SKY er en flerfarve fluorescens in-situ hybridisering (FISH) teknik til at detektere metafasekromosomer med spektral mikroskop 3, 4. SKY har vist sig at være et værdifuldt værktøj til cytogenetisk analyse af en bred vifte af kromosom abnormiteter i forbindelse med et stort antal af genetiske sygdomme og maligniteter 5, 6. SKY involverer anvendelsen af ​​flerfarvede fluorescens-mærkede DNA-prober fremstillet ud fra den degenererede oligonucleotide primere ved PCR. Således, hver kromosom har et unikt spektral farve efter in-situ hybridisering med prober, der er differentielt mærket med en blanding af fluorescerende farvestoffer (Rhodamin, Texas Red, Cy5, FITC og Cy5.5). Proberne, der anvendes for SKY bestå af op til 55 kromosomområder specifikke prober 7-10.

Den Proceduren for SKY involverer flere trin (figur 1). SKY kræver tilgængeligheden af ​​celler med højt mitotisk indeks fra normalt eller sygt væv eller blod. Kromosomerne af en enkelt celle fra enten en frisk isoleret primær celle eller en cellelinie er spredt på et objektglas. Dette kromosom spread er mærket med en forskellig kombination af fluorescerende farvestoffer specifikke for hvert kromosom. Til detektering og image erhvervelse består spektral imaging system sagnac interferometer og et CCD-kamera. Dette tillader måling af det synlige lysspektrum udsendt fra prøven og til at erhverve en spektral billede tilbagem. individuelle kromosomer. HiSKY, den software, der bruges til at analysere resultaterne af de billeder, giver det let at identificere kromosom anomalier. Slutresultatet er en metafase, og en karyotype klassifikation billede, i hvilken hvert par af kromosomer har en distinkt farve (figur 2). Dette giver mulighed for nem identifikation af kromosom identiteter og omplantning. For flere detaljer, kan du besøge Applied Spectral Imaging hjemmeside ( http://www.spectral-imaging.com/ ).

SKY blev for nylig anvendt til en identifikation af kromosom adskillelse fejl og kromosomfejl hos mennesker og mus med autosomal dominant polycystisk nyresygdom (ADPKD), en genetisk sygdom karakteriseret ved dysfunktion i primære cilier 11-13. Ved at bruge denne teknik, vi viste tilstedeværelsen af unormal kromosom segregering og kromosomfejl i ADPKD patienter og musemodeller 14. Yderligere analyser anvender SKY ikke kun lov for os at identificere kromosomalt antal og identitet, men også nøjagtigt at detektere meget komplekse kromosomforandringer såsom kromosomområder deletioner og omplantning (figur 2).

Protocol

1. Celle præbehandling og metafase forberedelse

  1. Cellerne dyrkes i Dulbeccos Modifikation af Eagle 's Medium (DMEM) indeholdende 10-15% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin ved 37 ° C med 5% CO 2 inkubator, indtil de når 70-80% konfluens.
  2. Behandle de cellerne med colcemid opløsning ved 0,05 ug / ml for 30-60 min.
  3. Indsamle den medium indeholdende eventuelle flydende celler i 50-ml sterile falk at centrifugerør. Skyl cellerne på pladen med sterile1X-PBS. Efter inkubering med sterilt trypsin for 1-2 min, høst og indsamle de resterende celler ind det samme rør.
  4. Snurre rørene ved 1000 opm i 5 min, aspireres supernatanten forlader 0,5 ml og løsn pellet ved at svirpe med finger blot.
  5. Afhængigt af pelleten størrelse, 5-10 ml af hypotonisk opløsning af 0,56% KCl i dH 2 O tilføje og inkuber suspensionen ved 37 ° C i 30-45 min.
  6. Tilsættes en dråbe methanol / eddikesyre(3:1 vol / vol) pr ml af hypotonisk cellesuspension og invertér røret forsigtigt for blanding.
  7. Centrifugér ved 1200 rpm i 5 min og indsamle pellet som trin 1,4, tilsæt derefter 5 ml af frisk methanol / eddikesyre (3:1 vol / vol) fikseringsopløsning dråbevis medens flicking pelleten kontinuerligt. Denne procedure er kritisk, så at de metafase spreads ikke vil blive fanget i cellernes klumper hvilket ville kompromittere eksperimentet.
  8. Centrifuger igen ved 1200 rpm i 5 min og der tilsaettes 5-10 ml af is-kold methanol / eddikesyre fiksativet langs væggen af ​​røret. På dette stadium,, hvis det er nødvendigt kan cellerne opbevares i fiksativ opløsning i en strammet og forseglet rør ved -20 ° C til kortvarig eller -80 ° C for på lang sigt (år) til fremtidig brug.
  9. Rene objektglassene i absolut ethanol, derefter dyppe diaset i dH 2 O for approximately10X for at danne en skede af vand på overfladen af objektglasset. Placer glider på en glasplade og drop 15-20 ul cellesuspension (fra trin 1,8) Fra 10 "over diaset. Sæt dias i et vandbad indstillet til 65-70 ° C i 1-2 min og lad det tørre.
  10. Kontroller slæden under et lysmikroskop med 10X og 40X tørre mål at sikre at der er metafasekromosomer og spændene er jævnt fordelt. Kontroller cytoplasma tilstedeværelse omkring kromosomerne. Hvis cytoplasma tilstedeværende Fortsæt med slide forbehandling (pepsin fordøjelse), hvis ingen cytoplasma er til stede og de kromosomerne har god morfologi, så er der ikke behov for dias forbehandling.

2. Slide forbehandling (pepsin behandling)

  1. Anvend 120 ul 1:200 RNase-opløsning (20 mg / ml) opløst i 2X-SSC på en 24 mm x 60 mm mikroskop dækglas og vend metafase slide med forsiden nedad på dækglas derefter forsigtigt vendes metafase glideflade op og inkuberes ved 37 ° C i 45 min.
  2. Fjern forsigtigt dækglas uden at ridse slæden og vask i 2X-SSC buffer i en Coplin krukke hvert 5 min i 15 minmed rystning.
  3. Tilsættes 5-15 ul pepsin stamopløsning (100 mg / ml i dH 2 O) i et rent bægerglas og derefter tilføje 100 ml forvarmet (37 ° C) 0,01 M HCl. Det er vigtigt, at pepsinet tilsættes ind i et rent bægerglas 1:a og ikke direkte ind i den HCl-opløsning, ellers ville det ikke opløses i opløsning. Inkubér diaset i en Coplin krukke indeholdende den HCl / pepsin opløsning ved 37 ° C i 3-5 min. Dette trin er meget kritisk som for meget fordøjelse vil forårsage de kromosomer, der skal overdigested og for lidt fordøjelse vil forlade det cytoplasmaet ufordøjede som kan føre til non-specifik binding af sonden og interferere med hybridiseringen signal.
  4. Vaske diaset i en Coplin krukke indeholdende 100 ml 1X-PBS i 5 min to gange ved stuetemperatur.
  5. Vaske diaset i en Coplin krukke indeholdende 100 ml 1X-PBS/MgCl 2 i 5 minutter ved stuetemperatur (50 ml af 1M MgCl 2 i 950 ml af 1X-PBS).
  6. Placer dias i en Coplin krukke containing 100 ml 1% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur (1,7 ml af 37% formaldehyd i 100 ml 1X-PBS/MgCl 2).
  7. Vaske diaset i en Coplin krukke indeholdende 100 ml 1X-PBS i 5 min.
  8. Observere dias under et lysmikroskop ved hjælp 40X tørt linse at sikre, at objektglassene er fordøjet korrekt og ingen cytoplasma er til stede og kromosomet morfologi bevares. Vælg en område for hybridisering under anvendelse en diamant pen.

3. Chromosom og probe denaturering og hybridisering

  1. Forberede frisk denaturerende opløsning (70% formamide/2X SSC, pH 7,0) og forvarm til 70-80 ° C i en Coplin krukke anbringes i et vandbad Placer diaset i den Coplin krukke indeholdende den denaturerende opløsning i et vandbad ved 70 ° C for musekromosomer og 80 ° C for humane kromosomer for 30s-1,5 min.
  2. Øjeblikkeligt stille diaset i is-kold 70% ethanol i 3 minutter fulgt af 80% og 100% ethanol for 3 minutter hver og luft tør. Undersøg slidefor kromosom morfologi. God kromosom morfologi er angivet ved mørke kromosomer og ikke "fase-light" eller glorie kromosomer.
  3. Opvarme SkyPaint proben (SKY maling kit; hætteglas # 1) ved 37 ° C under omrystning i 20 minutter, vortex og centrifuger kortvarigt ved 1000 opm i et par sekunder.
  4. Denaturere det probe i en termocyklusapparat programmeret til en totrins-cyklus ved 85 ° C i 5 min cyklus, efterfulgt af 37 ° C i 60 min at tillade mærkede-probe DNA til preannealing.
  5. Anvend 10 gi af denatureret probe på området for hybridisering og dæk med en 22 mm x 40 mm dækglas og sørg for ikke at fange luftbobler. Forsegle kanterne af daekglas med gummi cement og inkuber i et befugtet kammer ved 37 ° C i 48-72 timer.

4. Fluorescerende probe detektion

  1. Fjerne daekglas omhyggeligt og placer objektglasset i en Coplin krukke indeholdende forvarmet (45 ° C) vaskning-opløsning I (friskfremstillet 50% formamid i 2X SSC). Vaske i 5 mintre gange ved 45 ° C i et rystevandbad ved 45 rpm
  2. Vaske diaset i vaskeflotten II (1X SSC) ved 45 ° C i 5 min to gange med omrystning.
  3. Vaske diaset i vaskeflotten III (4X SSC/0.1% Tween 20) i 5 minutter ved 45 ° C med rystning.
  4. Anvende 80 gl blokerende reagens (SKY maling kit; hætteglas # 2), placere et dækglas og inkuber ved 37 ° C i 30 min.
  5. Du fjerne dias og tillade fluid til dræne. Anvende 80 gl Cy5 farvning reagens (Koncentreret Antistof Detection CAD kit; hætteglas # 3), anvende et daekglas og inkuber ved 37 ° C i 40 min.
  6. Vaske objektglasset med vaskeopløsningen III ved 45 ° C i 5 min tre gange med omrystning.
  7. Anvend 80 gl Cy5.5 farvning reagens (koncentreret antistof Detection CAD sæt; hætteglas # 4), placere et dækglas og inkuber ved 37 ° C i 40 min.
  8. Vaske objektglasset med vaskeopløsningen III ved 45 ° C i 5 min tre gange med omrystning.
  9. Vippe objektglasset og tillade fluidet til afløb. Anvend 20 ul af anti-fade DAPI reagens (SKY maling sæt; hætteglas # 5) og placere et 24 mm x 60 mm mikroskop dækglas. Forsigtigt fjerne luftbobler der kunne have dannet. Objektglas kan afbildes straks eller opbevares ved 4 ° C i mørke for ingen længere end 1 uge.

5. Image erhvervelse og analyse

  1. Billede overtagelse opnås ved at se metafase dias med et Olympus mikroskop udstyret med et 60X olieimmersion linse, en spektral terning (specialdesignet triple band pass filter), et DAPI-filter og en sagnac interferometer modul med et CCD-kamera.
  2. Spektrale-karyotyper blev udført ved hjælp af Sky View software (Applied spektral scanning Version 1,62) efter brugervejledningen.
  3. Efter at have analyseret billederne, kan kromosomerne ses som farvebilleder (med særlige fluorescerende farver), pseudo farvebilleder (med farver til klassificering) og omvendte DAPI billeder (specifik banding mønster).
e_title "> 6. Repræsentative Resultater

En komplet SKY procedure tager normalt omkring en uge gang (figur 1). Dette omfatter billede indsamling og analyse af, forudsat at de celler i metafase er tilstrækkelig forsyning. Karyotypebestemmelse analyse afslører normal muse karyotype (40, XY) af celler fra vildtypemus (figur 2a). I modsætning, celler fra pKD1 - viser mus (PKD musemodel) en betydelig stigning i kromosom antal og strukturelle abnormiteter, såsom kromosomområder deletioner (kromosom # 8) og omplantning (kromosomer # 11 og 19) (figur 2b) - /. Vi analyserede også vaskulære væv fra de ADPKD patienterne. En simpel undersøgelse ved tælling de kromosomale numre, indikerede, at non-ADPKD og nogle ADPKD vaskulære prøver havde normale kromosomale numrene på 23 par (figur 2C). I almindelighed,, vi imidlertid observerede svigt af kromosomal segregation, hvilket resulterer i 46 par af kromosomer i ADPKD prøver i stedet for 23 par (figur 2d).

Figur 1
Figur 1.. SKY protokol flowchart. Rutediagram for SKY protokol illustrerer trin for at fuldføre et eksperiment startende fra celle forbehandling og metafase forberedelser til billede indsamling og analyse. En tilnærmet en uges tidslinje præsenteres på venstre med trin-for-trin procedurer for hver dag.

Figur 2
Figur 2. Spectral karyotyping den udødelige muse cellelinier og frisk isolerede humane primære celler. Farve og omvendte DAPI billeder af de enkelte kromosomer er vist før kromosomale sortering. Efter sortering, er kromosomer præsenteret i "klassifikation"-tabellen. A) SKY billede af en metafasespredning fra vildtype mus indeholder normal karyotype (40, XY). B) pKD1 - / -. mus viser unormal kromosom nummer (68 i stedet for 40) og kromosom abnormiteter såsom kromosom deletioner (kromosom # 8) og kromosom translokationer (kromosomer # 11 og 19) c) SKY billede af en metafase spread fra det vaskulære væv af en non-ADPKD patienten har normal karyotype (46, XX). d) SKY billede af en metafase spread fra det vaskulære vævet af en ADPKD patient indeholder unormal karyotype (92, XXXX). Dele af de data, der tidligere er blevet indberettet og genbruges med tilladelse 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spectral karyotyping (SKY) er en cytogenetik teknik, der anvendes i at studere genomiske og kromosom-kompositioner. Denne teknik drager fordel af kromosom maleri prober, og påvisning af disse prober er erhvervet gennem en sagnac interferometer. Den komplette SKY proces tager normalt omkring en uge, og det indebærer flere vigtige skridt (figur 1). Det SKY bruger en standard protokol, som første gang blev beskrevet af Padilla-Nash et al 3. Protokollen er siden blevet tilpasset af forskellige cytogenetik laboratorier, herunder vores.

Blandt de vigtigste skridt i protokollen, er en god kvalitet metafase forberedelse meget vigtigt at have en vellykket SKY analyse. For eksempel hvis diassene er for gammel hvis de kromosomerne har for meget cytoplasmaet eller, kunne kvaliteten af ​​de billederne blive kompromitteret. Som det ses i vores filmklip, kan indholdet af cytoplasmaet let identificeres ved hjælp af en høj opløsning på forskelleninterferens kontrast mikroskopi teknik. Derudover, er tilgængeligheden af ​​aktivt delende celler en forudsætning for SKY analyse; dette kan overvindes ved behandling med colcemid for en længere tid eller en tilsætning af andre vækstfaktorer til cellerne. Den samlede succesrate på SKY, er i høj grad afhængig af kvalifikationer og erfaring af brugeren.

SKY tilbyder en kraftfuld og pålideligt værktøj til kromosomanalyse, herunder strukturelle ændringer i et enkelt kromosom. I tillæg til cellulær polyploidi, tilbyder SKY en muligheden for at studere kromosomområder insertioner, deletioner duplikationer og omplantning. For eksempel tillader SKY identifikation af nye og skjulte kromosomafvigelser og identifikation af komplekse rearrangementer under udviklingen af kræft og progression 15. Endvidere har SKY blevet anvendt til et forskningsfelt inden for komparative cytogenetik, som undersøger kromosomale omlejringer under udvikling 4. Brug SKY teknik, Vores laboratorium bliver den første til at identificere kromosom abnormaliteter i mus og mennesker med polycystisk nyresygdom (figur 2). Der er ingen tvivl om, at himlen vil være gavnlig i mange andre kromosomale associerede sygdomme. I virkeligheden, foreslå, vi, at SKY ville også være nyttigt i mange cilia-relaterede patogenese, hvor cilia er blevet vist at regulere celledeling 14.

Fordi mus og rotte er vigtige dyremodeller at studere den mekanisme af en sygdom og at udføre en funktionel vurdering in vivo, udvikling af muse og rotte prober for SKY analyse har tilladt rutinemæssig karyotypebestemmelse af muse og rotte kromosomer. På nuværende tidspunkt, er SKY derfor begrænset til kromosomale studier i menneskelig, mus og rotte. Men efterhånden som flere forskningslaboratorier bruge andre arter til at studere genomiske kompositioner, er det forventeligt, at flere kromosom maleri sonder til forskellige organismer snart vil være kommercielt tilgængelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi og Blair Mell for deres tekniske assistance. Dette arbejde blev støttet af priser fra NIH (DK080640) og The University of Toledo & ProMedica Translationel Forskning Stimulation Award til Dr. Surya Nauli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Cellgro 10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30088-03
Penecillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Inc. SV30010
Colcemid Roche Group 10 295 892 001 10 μg/ml
HCl Fisher Scientific A144-500
KCl Fisher Scientific S77375-1
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30256-01
SKY paint probe kit (Human) Applied Spectral Imaging SKY000028
SKY paint probe kit (Mouse) Applied Spectral Imaging SKY000030
Concentrated antibody detection kit Applied Spectral Imaging SKY000033
Trypsin Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30236.01
Methanol Fisher Scientific A433P-4
Acetic acid Fisher Scientific A38-212
RNase A Roche Group 10 109 169 001
Pepsin Sigma-Aldrich P6887-5G
MgCl2 Fluka 63069-500ML
37% Formaldehyde Mallinckrodt Baker Inc. 2106-02
20X SSC Promega Corp. V4261
Formamide Fluka 47671 prepare just before use
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Microscope glass slides Fisher Scientific 12-549
Microscope cover glass 24x60mm VWR international 16004-312
Rubber cement Elmer’s
Hybridization/ humidifiedchamber/Tray Simport M920-2 put wet paper towels at the bottom
Thermocycler Eppendorf Epgradient S
Shaking platform/Orbital shaker Bellco Glass
Shaking/water bath Precision Scientific
DAPI filter cube Chroma Technology Corp.
SKY filter cube Chroma Technology Corp.
SpectraCube Applied Spectral Imaging
Inverted cell culture microscope Nikon Instruments Nikon Eclipse TS100
Fluorescence microscope Olympus Corporation IX70 60X oil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).
  2. Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2, 971-972 (1971).
  3. Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).
  4. Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research. Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).
  5. Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms. Genes, Chromosomes & Cancer. 30, 349-363 (2001).
  6. Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping. Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).
  7. Karpf, A. R., Matsui, S. Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells. Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).
  8. Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids. Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).
  9. Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer. Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).
  10. Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).
  11. AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation Research. 104, 860-869 (2009).
  12. Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells. Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).
  13. Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1. Circulation. 117, 1161-1171 (2008).
  14. AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation. Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).
  15. Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping. Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics