琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段

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Summary

描述一个基本协议的DNA片段,用琼脂糖凝胶电泳分离。

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Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012).

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Abstract

琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的不同大小不等,从100个基点,25 KB 1是最有效的方法。琼脂糖是从海藻属石花菜江蓠 ,分离和重复agarobiose(L-和D-半乳糖)亚基2组成。凝胶过程中,关联的琼脂糖凝胶聚合物非共价和束的孔径确定凝胶的分子筛性能形成一个网络。使用琼脂糖凝胶电泳,彻底改变了DNA的分离。在此之前通过琼脂糖凝胶,DNA主要是分离采用蔗糖密度梯度离心,只提供了一个大小近似。使用琼脂糖凝胶电泳分离DNA,DNA被装入预制凝胶和当前应用井。磷酸骨架的DNA和RNA分子是带负电荷,因此放置在电场中时,DNA片段,将迁移到p阳极ositively收费。由于DNA有一个统一的质量/电荷比,DNA分子在琼脂糖凝胶电泳分离模式行驶距离成反比,其分子量3日志的大小。 DNA通过琼脂糖凝胶电泳运动的领导模式是“偏爬行”,即领先前进和拉其余的分子沿4。 DNA分子通过凝胶迁移率取决于以下几点:1)DNA分子的大小; 2)琼脂糖浓度; 3)DNA构象; 4)电压应用,5)存在的溴化乙锭,6)型琼脂糖和7)电泳缓冲液。分离后,DNA分子的紫外光照射下,可以可视化后,以适当的染料染色。按照此协议,学生应该能够:

  1. 了解DNA片段在凝胶基质中分离机制
  2. 了解如何构DNA分子将决定其流动性,通过凝胶基质
  3. 他们的需要,确定适当浓度的琼脂糖溶液
  4. 琼脂糖凝胶电泳的DNA样本准备
  5. 成立凝胶电泳仪电源
  6. 选择适当的电压为分离的DNA片段
  7. 了解溴化乙锭的DNA条带的可视化的机制,允许
  8. 确定分离的DNA片段的大小

Protocol

1。凝胶的制备

  1. 称量烧瓶的琼脂糖适当质量。琼脂糖凝胶电泳准备使用AW / V比例解决方案。琼脂糖凝胶浓度的DNA片段的大小将取决于与大多数凝胶0.5%-2%之间不等,要分开。缓冲区的数量不应该超过1/3瓶的容量更大。
  2. 添加运行缓冲液的琼脂糖含瓶。涡流混合。运行缓冲区的最常见的凝胶栓塞(三醋酸40毫米,1毫米EDTA)和TBE(45毫米的Tris-硼酸,1毫米EDTA)。
  3. 融化的琼脂糖/缓冲液。这是最常见的微波炉加热,但也可以通过本生灯火焰。在间隔30秒,取出拌匀瓶和漩涡的内容。重复,直到琼脂糖完全溶解。
  4. 溴化乙锭(EtBr)可添加浓度为0.5微克/毫升。另外,也可能被凝胶染色后电电泳在运行缓冲液含0.5微克/毫升乙锭为15-30分钟,其次是在运行的时间长度相等的缓冲区脱色。

注:乙锭是一种可疑的致癌物,必须妥善处置每机构管理条例。处理凝胶含有ETBR时,应始终戴手套。可替代染料染色的DNA ETBR但仍然是最流行的一种,由于其敏感性和成本。

  1. 允许琼脂糖在65℃水浴中冷却,无论是在台式或由孵化。如果不这样做,将凝胶托盘变形。
  2. 凝胶托盘放到铸造设备。另外,也可能磁带凝胶的托盘,以创建一个模具的开放边。凝胶模具放到一个适当的梳子,以创建井。
  3. 倒入熔化的琼脂糖凝胶模具。让琼脂糖设置在室温。取出梳子和凝胶放置在凝胶中。另外,在GEL也可以被包裹在保鲜膜,并保存于4°C,直到使用( 图1)。

2。设立仪器凝胶DNA片段分离

  1. 添加载入染料要分开的DNA样本( 图2)。凝胶上样染料通常由的6X浓度(0.25%,0.25%溴酚蓝二甲苯青,30%甘油)。装载染料有助于跟踪已走过多远,您的DNA样本,还允许陷入凝胶样品。
  2. 方案的电源供应器所需的电压(电极之间1-5V/cm)。
  3. 加入足够的运行缓冲液,凝胶覆盖面。重要的是要使用相同的运行缓冲液作为一个用于制备凝胶。
  4. 凝胶盒的导线连接电源。打开电源和验证,胶盒和电源工作。
  5. 取下盖子。慢慢地而谨慎地装载到凝胶的DNA样本(S)( 图3)。一个相应的DNA大小标记应始终被载入随着实验样本。
  6. 更换凝胶盒的盖子。阴极(黑线)应该接近井比阳极(红色导线)。仔细检查,电极插入到正确的插槽电源。
  7. 接通电源。运行凝胶,直到染料迁移到适当的距离。

3。观察分离的DNA片段

  1. 当电泳完成后,关闭电源,取出凝胶盒的盖子。
  2. 从凝胶中取出凝胶。从凝胶表面,排出多余的缓冲区。将凝胶托盘上的纸巾吸收任何额外的运行缓冲。
  3. 从凝胶托盘取出凝胶和暴露在紫外线照射下,凝胶。这是最常见的使用凝胶文件系统( 图4)。 DNA条带应显示为橙色荧光带。采取的凝胶图片( 图5)。
  4. 妥善处置每机构管理条例凝胶和运行缓冲区。

4。代表结果

图5表示一个典型的结果后,琼脂糖凝胶电泳PCR产物。分离后,所产生的DNA片段作为明确界定波段可见。 DNA标准或梯子应允许有用的样品带的大小确定,在一定程度上分离。在这个例子所示,765基点,880 bp和1022 bp的DNA片段的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,连同2日志的DNA梯状条带。

图1。
图1。琼脂糖凝胶固化后去除梳子。

图2。
图2。样染料学生加入到她的DNA样本。

图3。
图3。学生装成凝胶以及DNA样本。

图4。
图4。凝胶文件系统的一个例子。

图5。
图5。凝胶后电泳图像。 ,ETBR被添加到凝胶电泳至0.5微克/毫升的终浓度为1小时,在100至五分离前。凝胶被暴露在紫外线和凝胶文件系统所采取的图片。

Discussion

已被证明是琼脂糖凝胶电泳分离核酸的高效和有效的方式。琼脂糖凝胶强度高,允许大DNA片段的分离处理的比例很低凝胶。分子筛是由7琼脂糖凝胶基质束所产生的毛孔大小。在一般情况下,较高浓度的琼脂糖,孔径越小。传统的琼脂糖凝胶电泳在100 bp和25 kb的DNA片段之间的分离是最有效的。分开大于25 KB的DNA片段,将需要使用脉冲场凝胶电泳,其中包括目前从两个不同的方向交替应用。在这样的较大规模的DNA片段分离的速度,他们在重新调整自己与电流方向的变化。 DNA片段小于100个基点,更有效地使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。不像琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶基质是通过自由基驱动化学反应形成的。这些稀释剂的凝胶浓度较高,运行和垂直方向有更好的分辨率。在现代的DNA测序毛细管电泳,使毛细管用凝胶基质填充。毛细管允许使用高电压的应用,从而使分离的DNA片段(DNA序列的测定)迅速。

琼脂糖可以修改,创建羟乙基低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖一般是分离的DNA片段需要隔离时使用。羟乙基降低琼脂糖包的堆积密度,有效地降低其孔径8。这意味着一个同样大小的DNA片段,将需要更长的时间将通过低熔点琼脂糖,而不是一个标准的琼脂糖凝胶电泳凝胶。因为彼此关联的束通过非共价相互作用9,它有可能重新融化的琼脂糖凝胶电泳后,它已设置。

ETBR是最常见的试剂,用于染色的DNA琼脂糖凝胶10。当暴露在紫外线下,乙锭分子芳香环中的电子被激活,从而导致释放的能量(光)电子返回基态。 ETBR工程通过插层本身在DNA分子中的浓度依赖性。这允许根据其强度在任何特定的DNA带的DNA量的估计。由于其正电荷,ETBR使用减少15%的DNA迁移率。 ETBR是一个可疑的诱变剂和致癌物质,因此必须小心处理琼脂糖凝胶含有它时。 ETBR此外,被认为是危险废物,必须妥善处置。 DNA琼脂糖凝胶替代污渍的SYBR黄​​金的SYBR绿,结晶紫和甲基蓝。其中,甲基蓝和结晶紫不需要暴露的DNA条带的可视化的紫外光凝胶,如果需要恢复从凝胶中的DNA片段,从而减少了基因突变的概率。然而,他们的敏感性比ETBR较低。 SYBR黄​​金和SYBR GREEN是高度敏感,防紫外线依赖低于ETBR毒性染料,但它们是相当昂贵的。此外,所有的替代染料要么不能或不工作时,直接添加到凝胶,凝胶电泳后染色后。由于成本,易用性和敏感性,ETBR仍有许多研究者的首选染料。然而,在某些情况下,如危险废物处置时很难或青年学生时,正在执行一项实验,毒性较低的染料可能被优先考虑。

载入染料在凝胶电泳为三个主要目的。首先,他们增加密度的样品,允许它沉入凝胶。第二,染料提供颜色和简化加载过程。最后,按标准费率的染料移动通过凝胶,使DNA片段的迁移距离的估计。

分离DNA片段的确切大小,可确定策划针对每个波段行驶距离的DNA标准的不同频段的分子量日志。 DNA标准包含一个预先确定大小的DNA片段,可以对未知的DNA样本相比的混合物。重要的是要注意,不同形式的DNA以不同的速率通过凝胶移动。超螺旋质粒DNA,由于其结构紧凑,通过凝胶最快的移动,循环行驶最慢的开放形式,一个同样大小的线性DNA片段。

总之,通过在20世纪70年代以来琼脂糖凝胶DNA分离,它具有被证明是最有用和最通用的技术,在生物科学的研究之一。

Disclosures

我们什么都没有透露。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose I Amresco 0710
Boric acid Sigma-Aldrich B7901
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
EDTA Sigma-Aldrich E9884
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637 Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP2401-212 Corrosive
Glycerol Fisher Scientific G33-1
Xylene cyanol FF Sigma-Aldrich X4126
Tris base Sigma-Aldrich T1503
Investigator/FX gel documentation system Fotodyne Incorporated
Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system Thermo Fisher Scientific, Inc. B1-PTM
EPS 301 power supply GE Healthcare 18-1130-01

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References

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Comments

5 Comments

  1. Well understood................great explanation

    Reply
    Posted by: Muhammad Rizwan A.
    February 27, 2015 - 4:01 PM
  2. Agarose Gel Image -

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    Posted by: Jennifer C.
    March 23, 2015 - 7:49 AM
  3. too good

    Reply
    Posted by: Rosella B.
    April 26, 2015 - 10:12 AM
  4. Thank you!

    Reply
    Posted by: Axel W.
    November 30, 2016 - 1:55 AM
  5. very clear thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2017 - 6:11 AM

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