Abstract
Los tumores crean un microambiente único inmunosupresor (microambiente tumoral, TME) en el que los leucocitos son reclutados en el tumor por varias quimiocinas y 1,2 factores de crecimiento. Sin embargo, una vez en el TME, estas células pierden la capacidad de promover la inmunidad anti-tumoral y comenzar a apoyar el crecimiento del tumor y regular a la baja anti-tumor respuesta inmune 3-4. Los estudios sobre tumores asociados leucocitos se han centrado principalmente en las células aisladas de tumores drenaje de los ganglios linfáticos o el bazo debido a las dificultades inherentes a la obtención de un número suficiente de células y la pureza del tumor primario. Mientras que la identificación de los mecanismos de activación de las células y el tráfico a través del sistema linfático de ratones portadores de tumores es importante y puede dar una idea a la cinética de la respuesta inmune al cáncer, en nuestra experiencia, muchos leucocitos, incluyendo las células dendríticas (DCS), en el tumor de drenaje los ganglios linfáticos tienen un fenotipo diferente a las que se infiltran en los tumores de 5,6. Además, hemos demostrado previamente que adoptivamente-transferido células T aisladas del tumor-ganglios linfáticos de drenaje no se tolerantes y son capaces de responder a la estimulación secundaria in vitro a diferencia de las células T aisladas de la TME, que son tolerantes e incapaz de proliferación o citoquinas producción de 7,8. Curiosamente, hemos demostrado que la modificación del microambiente del tumor, como el suministro de células CD4 + T helper a través de la transferencia adoptiva, promueve células T CD8 + para mantener la pro-inflamatorias funciones efectoras 5. Los resultados de cada uno de los estudios mencionados anteriormente demuestran la importancia de la medición de las respuestas celulares a partir de TME-infiltración de células inmunes en oposición a las células que permanecen en la periferia. Para estudiar la función de las células inmunes que se infiltran en los tumores con el sistema de aislamiento Miltenyi Biotech 9, se ha modificado y optimizado el procedimiento de aislamiento a base de anticuerpos para obtener altamente correonriched poblaciones de células presentadoras de antígenos tumorales y de antígenos específicos de los linfocitos T citotóxicos. El protocolo incluye una detallada disección de tejido de la próstata de ratón a partir de un modelo de tumor de próstata espontánea (adenocarcinoma transgénico del ratón de la próstata TRAMP) 10 y un melanoma subcutánea (B16) el modelo del tumor seguida de la posterior purificación de las diversas poblaciones de leucocitos.
Protocol
1. El aislamiento de las células mieloides de tumores de próstata TRAMP
- Todos los procedimientos se realizaron bajo la dirección de una junta de revisión de los animales. Ratones TRAMP desarrollan espontáneamente tumores de próstata autóctonas como resultado de un transgén (SV40) controlada por el promotor probasin 10. Cualquier ratón macho se puede utilizar para este procedimiento. Mientras que los tumores TRAMP se pueden cosechar en cualquier edad, hay que señalar que TRAMP tumores de próstata por lo general permanecen pequeñas hasta que los ratones alcanzan edades superiores a 20 semanas. La eutanasia de los ratones por asfixia de CO 2. Retire del tracto urogenital (UGT), mediante la reducción abierta la cavidad peritoneal y tirando hacia atrás del tejido adiposo. El tejido adiposo es un tejido de espuma, brillante buscando.
- Localizar la vejiga; se encuentra directamente entre las dos vesículas seminales grandes, blancas. Apóyese en la vejiga con una pinza. Mantener las tijeras cerradas, suavizar el tejido adiposo y localizar la uretra. Reduzca el consumo de la URethra tan cerca de la cintura pélvica como sea posible y cortar los conductos deferentes. Si bien el corte hacia abajo, al mismo tiempo tire hacia arriba de la vejiga. Esto liberará la UGT entero que ahora puede ser micro-disección para obtener cada uno de los lóbulos de la próstata.
- Coloque la UGT en la temperatura ambiente PBS. El uso de un microscopio de disección para visualizar la UGT y limpiar cualquier exceso de tejido adiposo. Con unas pinzas, agarre la uretra y recoger los lóbulos ventral, lateral y anterior de la próstata. Coloque el tejido en PBS, mientras que recoja el resto de los lóbulos.
- Retire las vesículas seminales y deseche.
- Gire el tejido restante 180 °. Recoger la glándula ampular y los lóbulos dorsales de la próstata.
- Con unas pinzas, separar el tejido de la próstata y ponerla en la digestión (disociación) de amortiguación.
- Coloque el tejido tumoral en 1 ml de tampón de disociación (100 U / ml de colagenasa tipo IV y 100 ug / ml de DNasa en RPMI + FBS al 10%). Cada tumor requ mayoire únicas condiciones de disociación, porque TRAMP tumores prostáticos, el uso de 1 ml y B16 para los tumores, el uso de 5 ml (ver más abajo). Nota: el grado de colagenasa (I-IV) dependerá de la población de células para ser aislado; aislamiento de células mieloides es mejor con el tipo IV, mientras que el rendimiento es mayor utilizando linfocitos de tipo I.
- Coloque el tubo en la incubadora de 37 ° C durante 30 min.
- Pipetear arriba y abajo con una pipeta de 1 ml para obtener una suspensión que fluye fácilmente de células individuales.
- La suspensión filtra a través de 70 micrones y se lava 3 veces con buffer de separación MAC suplementado con FBS al 10% para el aislamiento de células mieloides.
- Centrifugar suspensión celular a 400 xg durante 10 min. A continuación, enjuagar el sedimento con 10 ml de tampón MAC y centrifugar de nuevo con la misma configuración.
- Resuspender el botón celular en 100 l de búfer MAC. A continuación, añadir 1 g anti-CD16/32 anticuerpos (Ab) por cada 10 8 células (200 l 2.4.G2 hibridoma sobrenadante de cultivo) y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Nota: tél cantidad de FcR-γ anticuerpo bloqueante (Ab) a añadir puede variar dependiendo de la frecuencia / número de FcR-gamma + células en el tejido y el volumen de la suspensión celular, por lo tanto, este paso puede requerir optimización.
- Añadir 100 l de "Pan-DC" o 10 l de anti-CD11b, anti-CD11c o anti-PDCA-1 MicroBeads por 10 8 células totales, dependiendo de la población celular deseada. Nota: la cantidad de microperlas necesarios pueden variar dependiendo de la frecuencia / número de células de la población deseada en el tejido, por lo tanto, este paso puede requerir optimización.
- Mezclar bien agitando suavemente tubo (no Vortex) e incube durante 15 minutos a 4-8 ° C, protegido de la luz. No incubar en hielo.
- Lavar las células mediante la adición de 10 ml de tampón de MAC. Centrifugar a 400 xg durante 10 min.
- Retirar completamente el sobrenadante y resuspender las células en 500 l de tampón MAC. Suspensiones de células tumorales fluya mejor a través de las columnas de LC. (Otrosopciones: MS, LS, LD).
- Aplicar una columna fresco al separador magnético. Primer la columna de lavado con una cantidad apropiada de tampón de MAC para la columna seleccionada: Para LC y columnas MS utilizar 500 l. Para LS o LD columnas usar 1 ml. Después de cebado de la columna, se aplican suspensión celular en la parte superior de la columna. Utilice una columna por cada 1 x 10 8 células.
- Recoger las células sin marcar (transferencia) y se lava la columna con un mínimo de tres (hasta cinco) veces con 500 l de volumen para un total de 1.5-2.5 ml de lavado fluido. Realizar lavar el paso 1 mediante la adición de tampón de MACs a la columna, es importante mantener la columna de fluido. Tan pronto como la columna gotea la última gota, añadir más tampón. No permita que la columna sin flujo o permitir que se ejecute en seco (esto no puede ser subestimada, como el secado de la columna puede arruinar la pureza y llevar a la pérdida significativa de la viabilidad celular.). Para el paso de lavado 2, lavar la columna con la disociación mezcla tampón (que contiene colagenasa + DNasa como dedescrito en el paso 1.7), lo que sirve como un paso "más dura" de lavado para eliminar los restos pegajosos de las células tumorales muertas o moribundas. Realice el paso de lavado con tampón 3 MAC, y si el flujo a través de no se ve del todo claro después de la etapa de lavado 3, continúe lavando durante 2 pasos de lavado adicionales con MACs de amortiguación (para un total de 5 lavados). Para grandes tumores subcutáneos (por ejemplo, melanoma B16), durante la etapa de lavado último, aplicar una presión suave con un dedo enguantado a la parte superior de la columna, que libera los desechos extra para un limpiador, purificado población celular. Este paso no es necesario para los tumores de tejidos sólidos como el de próstata, en su lugar, utilice los pasos adicionales de lavado, lavado de un total de al menos 5-6 veces.
- Retire la columna del separador magnético y colocarlo en un tubo de recogida adecuado. Pipeta 2 ml de tampón en la columna. Recoger las células marcadas magnéticamente, aplicando con firmeza el émbolo se suministra con la columna.
- Contar el número de células y confirmar la pureza de la población celular seleccionada poranálisis de citometría de flujo. Para la identificación de las poblaciones de CC, los marcadores sugeridos incluyen CD45, CD11c, PDCA-1, B220 y CD11b. Sugeridos incluyen marcadores de macrófagos CD45, CD11b, 80-F4, y Ly6C.
2. El aislamiento de adoptively transferido células T de tumores subcutáneos melanoma B16
Este protocolo funciona mejor con tumores que son de 250 mm o inferior a 2 (se calcula midiendo los diámetros bisectriz del tumor).
- B16 células tumorales se inyectaron por vía subcutánea en ratones C57BL / 6 y mediciones tumorales fueron registrados cada 2 días 8. Los ratones con tumores de 250 mm 2 son sacrificados por asfixia de CO 2. Usando autoclave instrumentos quirúrgicos enjuagados con 70% de EtOH, cortado en pequeños tumores (<3 mm) y se incuba piezas en 5 ml de solución de disociación (medio RPMI suplementado con FBS al 5%, colagenasa tipo I (200 U / ml) y DNasa I (100 ug / ml)) durante 30 min a 37 ° C, pipeteado (utilizando un μ 1.000l punta de la pipeta) y agitación cada 10 minutos durante la incubación. Si las células mieloides se aislaron posteriormente, sustituir 5% de FBS y colagenasa tipo I con FBS al 10% y colagenasa tipo IV (200 U / ml), respectivamente.
- Después de la incubación, pasar a la suspensión de células a través de un filtro de 70 micras de células y lavar dos veces con 10 ml de tampón de MAC (preparada según las instrucciones del fabricante, Miltenyi Biotech). Opcional - para los tumores grandes (> 300 mm 2), las células inflamatorias pueden ser pre-enriquecido por centrifugación en gradiente de densidad (Percoll o Ficoll).
- Aspirar el sobrenadante de lavado y se añade 1 g anti-CD16/32 antibody/10 8 células (200 l de sobrenadante clon cultura 2.4.G2) y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- No tiene lavadora, agregue 1 mg del anticuerpo anti-Thy1.1 PE por cada 10 8 células, mezclar bien agitando suavemente el tubo y se incuba durante 30 minutos en hielo y protegido de la luz.
- Lavar las células para eliminar sin consolidar PRIMaría anticuerpo mediante la adición de 10 ml de tampón MACs y centrifugar a 400 xg durante 5 minutos.
- Aspirar el sobrenadante y se añaden 20 l anti-PE microbolas (Miltenyi Biotech) por cada 10 7 células totales, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Mezclar bien agitando suavemente el tubo (no vórtex) e incubar a 4 ° C (no utilizar hielo) durante 15 minutos y protegido de la luz. Precaución: vórtex puede disminuir la integridad de las perlas.
- Lavar las células mediante la adición de 10 ml de tampón de MACs y centrifugar a 400 xg durante 5 minutos.
- Aspirar el sobrenadante de las células y se resuspenden en 500 l de búfer MAC. Para los tumores de mayor tamaño (> 300 mm 2), use 1 ml de tampón.
- Coloque una LC (de células grandes) de columna en el separador de campo magnético. Las suspensiones de células tumorales mejor fluir a través de estas columnas. Lavar la columna con tampón de 500 l MAC para cebar la columna. La mayoría de los tumores también fluirá a través de LS y columnas de LD, pero requieren más la digestión y la mecánica disruption para lograr el nivel adecuado de suspensión de células individuales. Lavar la columna con 1 ml de tampón MAC para cebar la columna.
- Aplicar suspensión de células en la columna y permitir que fluya completamente a través de (sin dejar que la carrera columna seca). A continuación, se lava con 500 l de búfer MAC, y repita el lavado de 3x. Sólo añadir nuevo buffer cuando el depósito de la columna está vacía, pero no dejes que la columna de pie sin flujo. Esto hará que la obstrucción y pureza disminuida.
- Este es un paso crítico para los grandes tumores subcutáneos: Después del último lavado, con una punta de un dedo enguantado, aplique una leve presión sobre la parte superior de la columna, mientras que todavía está en el separador magnético. Esto libera los desechos extra para una población más puramente enriquecido. A continuación, lavar la columna una vez más con 500 l de búfer MAC.
- Retire la columna del separador y colóquelo en un lugar limpio tubo de 15 ml cónico, añadir 2 ml de tampón de MAC en la columna. Lave el magnéticamente etiquetados cells firmemente empujando el émbolo en la columna.
- Centrifugar la fracción eluida a 400 xg durante 5 min. Pureza en este paso es típicamente entre 75-80%. Para alcanzar la pureza> 90%, repetir el procedimiento de separación magnética, como se describe en el paso 1.10-1.12 con una nueva columna de la EM. La columna de MS es más pequeño y más compacto por lo que la suspensión se ejecutará más lentamente a través de la columna, pero producirá un mayor número y la pureza de la célula de interés.
- Contar el número de células para otros experimentos y comprobar la pureza por análisis de citometría de flujo. Para el aislamiento de adoptivamente transferidos células T, tales como los descritos en este protocolo, los marcadores alélicas para la identificación incluyen CD45 y Thy1.1 (células transferidas) y Thy1.2 (acogida células T).
3. Los resultados representativos
El rendimiento de una población de células en particular (es decir, los macrófagos, CC, de células T, etc) variará dependiendo del tamaño del tumor y los tratamientos que se administrarontrado durante el crecimiento del tumor. Una próstata no se trata de un 14-16 semanas TRAMP viejo ratón debe rendir entre 8x10 5-1x10 6 CD11c + / PDCA-1 + (DC) en las células de 90-95% de pureza o de 1x10-6 1.5x10 6 F4/80 + / CD11b + (macrófagos) a 80-90% de pureza a partir de 300 mg de tejido siguiendo el protocolo de aislamiento por encima como se muestra en la Figura 1. El número de cada una de estas células aumenta ligeramente sobre la transferencia adoptiva de células antígeno tumoral-T específicas. Pureza pobre es generalmente un resultado de lavado insuficiente, lo que permite la columna se seque (lo cual puede resultar en la retención de los desechos del tumor en la columna), o el bloqueo del receptor Fc insuficiente.
De manera similar, las células total aislado de B16 tumores también variará dependiendo del tamaño del tumor en el momento de la cosecha tejido y la transferencia adoptiva de células T (transferencia de 5x10 6) con o sin vacuna DC (transferencia de 1x10 5). Muy pocos antígeno-SPELas células T específicas se infiltran en el tumor a menos que una vacuna de antígeno-pulsos DC también se da un día después de la transferencia de células T. Si una vacuna de CC se administra a un ratón que lleva una pequeña, palpables (<50 mm 2) del tumor, con un rendimiento de aproximadamente 3x10 5 Thy1.1 + células T, con una pureza del 80-85%, se considera una buena " "cosechar como se muestra en la Figura 2A. Sin embargo, si los tumores más grandes son cosechadas, rendimiento total y la pureza se reducirá.
Los macrófagos (F4/80 + / CD11b +) son por lo general un porcentaje menor del total de células en los tumores B16. La Figura 2B muestra que la utilización de CD11b, de un tumor que es de 250 mm 2, rinde aproximadamente 1x10 6 macrófagos a 90-95% de pureza . Además, la Figura 2B muestra que la población de CC en B16 tumores son heterogéneos. A diferencia de los tumores de próstata, dos subpoblaciones: CD11c + / PDCA-1 + (plasmocitoide DC) y CD11c+ / PDCA-1 - (CC convencional) se puede obtener a partir de tumores de melanoma B16. Se estima que el PDC y 2x10 6 4x10 6 CDC se espera que a partir de 250 mm 2 B16 tumores en el 80-90% de pureza. Reducción de la pureza suele ser una consecuencia de no eliminar las células tumorales de la columna. Paso 2,12 es un paso crítico para eliminar la pequeña masa de células de melanoma que persiste en la base de la columna. Tras este paso mejora la eficacia de los pasos de lavado y resulta en una mejor pureza.
Figura 1. Países en desarrollo (CD11c + / PDCA-1 +) y macrófagos (F4/80 + / CD11b +) fueron aisladas de un tumor de próstata TRAMP. Los valores de la trama de puntos representan el porcentaje de las células de interés pre-o post-purificación.
Figura 2. (A) Adoptively transferido Thy1.1 + / CD8 + T y (B) las células mieloides, incluyendo CD11c + / PDCA-1 + plasmacytoid países en desarrollo, CD11c + / PDCA-1 - Los países en desarrollo convencionales y F4/80 macrófagos CD11b + o + se aislaron por vía subcutánea melanoma B16 tumor Thy1.2 + ratones. Los valores de la trama de puntos representan el porcentaje de las células de interés pre-o post-purificación.
Discussion
Este protocolo puede ser modificado, basado en el tamaño y la fuente del tumor (subcutánea, espontánea del tumor, o tumores ortotópico). Para tumores más grandes, se recomienda para aumentar la cantidad de tampón de disociación, tampón MAC, y el número de lavados. La cordialidad de las células aisladas puede depender de la TME de las que están siendo enriquecido. Por ejemplo, en nuestra experiencia, las células aisladas de tumores espontáneos de próstata requiere la disociación más suave que las células aisladas de tumores subcutáneos melanoma B16. Durante la disección del tumor, eliminar, como mucho tejido adiposo, la piel, u otros desechos que pueden evitar la disociación enzimática eficaz. Es crítico para digerir completamente masas tumorales y obtener una suspensión de células individuales para garantizar la adecuada etiquetado Ab y para evitar la obstrucción de las columnas. Para el aislamiento de células mieloides, la cantidad de suero bovino fetal se recomienda en el tampón de aislamiento MACs se aumentó de 2% a 10% para mejorar la viabilidad celular. También es essential para mantener todos los tampones y celdas frías de todo el protocolo para prevenir no específica Ab unión y la obstrucción de la columna. En conclusión, para la obtención de poblaciones altamente enriquecido de células presentadoras de antígenos tumorales y de antígenos específicos de los linfocitos T citotóxicos, se ha modificado y optimizado un procedimiento de aislamiento a base de anticuerpos utilizando la tecnología Miltenyi Biotech. La utilización de este protocolo, ambas poblaciones adoptiva transferidos y endógeno de leucocitos puede ser enriquecido con Abs dirigidos contra marcadores de superficie celular específicos del tipo. Una ventaja de los procedimientos descritos es la reducción de los desechos del tumor arrastre después de lavar amplio y riguroso. Esto incluye el uso de la colagenasa en el tampón de lavado así como la identificación de un punto en el que la presión añadida a la columna puede eliminar obstrucciones de las columnas por las células tumorales. La obtención de un número suficiente de células inmunes de los tejidos, especialmente a una pureza que es adecuado para el análisis funcional, puede ser una tarea difícil.Sin embargo, en nuestra experiencia, el protocolo de aquí se obtiene el mayor número de células, en la mayor pureza, con la mayor consistencia.
Disclosures
Los autores no tienen descripciones relevantes.
Acknowledgments
Los autores desean dar las gracias a Dr. Scott Durham para la revisión del manuscrito y de vídeo. Este trabajo es apoyado en parte por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional del Cáncer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase I | GIBCO, by Life Technologies | 17100-017 | Use when selecting for T cells |
| Collagenase IV | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | Use for myeloid selection |
| DNase | Calbiochem | 260913 | |
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | 21870 | |
| Dulbecco’s PBS | Lonza Inc. | 17-5158 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza Inc. | 14-501F | |
| MACs Buffer | 2% FBS for T cells 10% FBS for myeloid cells |
||
| Thy1.1 PE | eBioscience | 551401 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-294 | |
| Anti-Pan DC microbeads | Miltenyi Biotec | 120-003-183 | |
| Anti-CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-300 | |
| LC column | Miltenyi Biotec | 130-042-202 | |
| MS column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 |
References
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