Author Produced

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por * These authors contributed equally

Neuroscience
 

Summary

Controlar a expansão de células estaminais somáticas é um factor principal dificultando o seu estudo e a utilização em terapia. Aqui, descrevemos um sistema para controlar temporalmente neural haste de expansão de células durante o desenvolvimento e na vida adulta, o que pode ser usado para aumentar o número de neurónios gerados no cérebro do rato.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (68), e4093, doi:10.3791/4093 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

As células-tronco somáticas pode dividir para gerar células-tronco adicionais (expansão) ou tipos de células mais diferenciadas (diferenciação), o que é fundamental para a formação de tecido durante o desenvolvimento embrionário e homeostase do tecido durante a vida adulta 1. Atualmente, grandes esforços são investidos para o controle do interruptor de células-tronco somáticas de expansão para a diferenciação, porque este é pensado para ser fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias para 1,2 medicina regenerativa. No entanto, um dos principais desafios no estudo e utilização de células somáticas com células-tronco é que a sua expansão foi provado muito difícil de controlar.

Descrevemos aqui um sistema que permite o controlo das células estaminais / progenitoras neurais (completo referido como NSC) expansão do rato embrionário do hipocampo ou córtex adulto através da manipulação da expressão do complexo de cdk4/cyclinD1, um regulador importante da fase G1 do ciclo celular e da haste de células somáticas differentiation 3,4. Especificamente, duas abordagens diferentes são descritas pela qual o complexo é sobre-expressa em cdk4/cyclinD1 NSC in vivo. Por a primeira abordagem, a sobreexpressão dos reguladores do ciclo celular é obtido por injecção de plasmídeos que codificam para cdk4/cyclinD1 no lúmen do telencéfalo de rato seguido de in utero eletroporação para os fornecer aos NSC do córtex lateral, portanto, provocando a expressão episómico da transgenes 5-8. Pelo segundo método, altamente concentradas HIV derivadas de vírus são injectados estereotaxicamente no giro dentado do hipocampo de rato adulto, portanto, provocando a expressão constitutiva dos reguladores do ciclo celular após a integração da construção no genoma viral de células infectadas 9. Ambas as abordagens, cujos princípios básicos foram já descritas por outros protocolos de vídeo 10-14, foram aqui otimizado para i) reduzir danos nos tecidos, ii) porções alvo de largura de muito específico cérebro regions, iii) obter um número elevado de células manipuladas em cada região, e iv) accionar elevados níveis de expressão dos transgenes dentro de cada célula. Sobre-expressão transiente dos transgenes utilizando as duas abordagens é obtida por diferentes meios ou seja, pela diluição natural dos plasmídeos electroporadas devido a divisão celular ou a administração de tamoxifeno na Cre-expressando NSC infectado com vírus transportando cdk4/cyclinD1 flanqueadas por locais loxP, respectivamente 9,15 .

Estes métodos proporcionam uma plataforma muito poderosa para agudamente e dos tecidos especificamente manipular a expressão de qualquer gene no cérebro do rato. Em particular, através da manipulação da expressão do complexo de cdk4/cyclinD1, o nosso sistema permite que o controlo temporal da expansão NSC e sua chave de diferenciação, assim, em última análise, o aumento do número de neurónios gerados no cérebro de mamíferos. Nossa abordagem pode ser muito importante para a pesquisa básica e uso de células-tronco somáticas para a terapiado sistema nervoso central de mamíferos, proporcionando uma melhor compreensão da i) conter contribuição para a formação de tecido de células durante o desenvolvimento, ii) a homeostase dos tecidos durante a fase adulta, iii) o papel da neurogénese adulta em funções cognitivas, e, talvez, iv) uma melhor utilização somática haste células em modelos de doenças neurodegenerativas.

Protocol

Nota preliminar

A cirurgia deve ser realizada por pesquisadores treinados totalmente após a aprovação das autoridades locais para o bem-estar animal. Todas as precauções devem ser tomadas para minimizar a dor eo estresse causado ao animal, incluindo anestesia profunda, a administração de analgesia pós-operatória e, para operações que duram mais de 10 minutos, a aplicação de um lubrificante ocular para evitar a desidratação da córnea e cegueira. Ratinhos anestesiados deve ser mantido constantemente aquecido a 37 ° C até à recuperação completa e cada ferramenta cirúrgica e solução tem de ser estéril. Embora o uso de uma capa biológica não é estritamente necessário, o operador deve tomar todas as precauções razoáveis ​​para minimizar a possibilidade de infectar o animal durante a operação, vestindo um jaleco, máscara e luvas. Da mesma forma, cada passo sobre a geração e utilização de vírus deve ser autorizado e deve ser realizada em áreas S2 de acordo com os regulamentos das autoridades locais.Finalmente, uma descontaminação completa de todas as ferramentas e superfícies que poderiam ter estado em contacto com o vírus deve ser realizado de acordo com as práticas de instalações aprovadas de desinfecção (por HIV, limpando com 70% Et-OH e / ou autoclavagem).

Parte 1: Expansão do embrionário NSC

1. Em electroporação utero

  1. Após a clonagem (isto é, os transgenes cdk4/cyclinD1) em PCMS-EGFP (Clontech) ou pDSV-mRFPnls vetores 16, purificar os plasmídeos utilizando kit EndoFree e ressuspender em PBS estéril a uma concentração de 3-5 ug / uL. Logo antes da cirurgia, misturar os plasmídeos com FastGreen 0,05% em PBS a uma razão final de ca. 4:04:01 e centrifugar a mistura durante 2 min a 16000 xg para remover todo o precipitado.
  2. Coloque a mistura de DNA em um vidro de borosilicato anteriormente puxado capilar. Parâmetros puxando usando um P-97 pipeta extrator são: tração: 200; vel: 140; tempo: 140. O calor é determinada por um teste de rampa e depende da especificaçãoific lote de capilares a ser utilizado. Montar o tubo capilar sobre o bocal do PicoPump que está perto do in utero eletroporação plataforma (Figura 1A) e, sob um microscópio estereoscópico, e dobrar a ponta nick-a no ponto de inflexão.
  3. Esterilizar todos os instrumentos de cirurgia em uma conta de vidro seco esterilizador e profundamente anestesiar um rato grávida no dia 12-15 de gestação usando um vaporizador isoflurano. Colocar o animal na posição supina sobre uma plataforma de aquecimento regulado a 37 ° C e manter sob administração de isoflurano constante por meio de um cone de nariz.
  4. Raspar a pele do abdómen, desinfectar, com tempos de Betaisodona múltiplas, eventualmente limpando em meio com 70% de etanol, e injectar a buprenorfina (diluído em PBS) por via subcutânea, a 0,1 mg / kg de concentração como preventivo analgésico. Com uma tesoura fina, fazer um corte longitudinal 2 centímetros da pele e, em seguida, a parede de base muscular para aceder à cavidade peritoneal. Dispense na ca cavidade peritoneal. 2ml de solução IUE (D-PBS contendo 100 U / ml de pen / strep) previamente aquecida a 37 ° C e manter a solução em um bloco de aquecimento.
  5. Cobrir o rato com drap estéril contendo uma fenda a partir do qual os úteros serão removidos. Retrair a incisão com afastador de tungstênio, identificar o útero e puxe-o segurando-o com uma pinça entre embriões adjacentes (Figura 1B; esquerda) e finalmente colocá-lo para baixo no drap estéril. Durante toda a operação, lavar o útero com IUE solução para hidratar a cavidade do corpo e órgão e evitar a desidratação do animal.
  6. Lidar com o útero cuidadosamente segurando-o entre o polegar eo indicador e rode um embrião até a sua cabeça é visível e orientada para o operador. Identificar os hemisférios telencefálicos e injetar um deles do lado dorso-lateral. Libertar 1-2 ul da solução de ADN, utilizando o interruptor de pé de um PicoPump até o ventrículo está delineada por FastGreen (Figura 1B; direita).
  7. (Figura 1C) e entregar 6 impulsos de 30 V para 50 ms com 950 ms de intervalo entre cada pulso usando um electroporador de forma quadrada gerar campos eléctricos operados através de um pedal. Evite colocar os eletrodos perto da placenta, pois isso pode causar hemorragia e danos ao embrião.
  8. Quando todos os embriões são injetadas e eletroporadas, coloque o útero de volta para a cavidade abdominal e fechar as paredes musculares com um fio de sutura sutura cada 3-4 mm. Os nós deve ser confortável para o músculo, mas não demasiado apertado para permitir que um pouco de inchaço do tecido. Finalmente, feche a pele sobrejacente usando clipes de metal. Desinfectar a pele com Betaisodona, retire o rato da máscara de isoflurano e transferi-lo em uma gaiola habitação quando totalmente acordado. Monitorizar a recuperação do rato até que o comportamento locomotor é normal.

2. Processamento da samsoas

  1. Um ou mais dias após a electroporação, o sacrifício do rato, recolher os embriões e identificar aqueles correctamente electroporação usando um estereomicroscópio fluorescente (Figura 1D). Dissecar os cérebros em PBS gelado, e fixá-los durante a noite, em PFA a 4% (de paraformaldeído em tampão fosfato pH 7,4). Eventualmente, BrdU pode ser administrado antes sacrifício de acordo com diferentes paradigmas para investigar cinética do ciclo celular e proliferação celular 3.
  2. Os cérebros são então processados ​​para seccionamento e coloração imunológica para os vários marcadores de células gliais radiais, progenitores basais e neurónios (PAX6, nestina, Tbr2, Tbr1, TUJ1 etc), para avaliar o efeito dos transgenes funcionais no NSC-alvo e sua progénie que são identificado pela expressão do gene repórter co-electroporated.

Figura 1
Figura 1.Em eletroporação utero. (A) Representação esquemática de uma plataforma no útero eletroporação. (B) Desenhos mostrando o posicionamento do rato prenhe durante a cirurgia (direito) e a injecção da mistura de DNA / FastGreen (azul), no hemisfério telencefálica de um embrião de rato (à esquerda). (C) Esquema mostrando a colocação dos eléctrodos em contacto com as paredes do útero, com o ânodo (+) adjacente ao sítio de injecção (azul). As setas indicam a migração de DNA para o ânodo. (D) Imagem de um rato hr 24 embrião após a eletroporação com plasmídeos GFP no dia embrionário 13. A linha tracejada demarca o hemisfério telencefálico. Esquema em A modificado a partir Calegari et al., 2004 17.

Parte 2: Expansão do Adulto NSC

1. A produção de derivados de HIV-partículas virais

  1. Dia 1: placa de 5 x 10 6 293T células numa cm 10prato com 8 ml de D-MEM contendo 10% de soro fetal inactivado pelo calor de bovino e 100 U / ml de pen / strep (meio de cultura). Usar 15 pratos para uma preparação viral e cultura durante a noite a 37 ° C, 5% CO 2.
  2. Dia 2: para cada prato, dilua em 1 ml de D-MEM sem formatação de 5 ug de cada um dos três plasmídeos codificando para i) proteína de envelope VSVG (tipo vírus da estomatite vesicular G), ii), gag / pol (grupo antigénio específico / polimerase) e iii) uma construção policistrónica expressando os transgenes funcionais e repórter (ou seja, cdk4/cyclinD1/GFP) previamente clonado num vector de transferência do VIH-based (p6NST90) 9. Misturar a solução com 1 ml de D-MEM contendo 45 ul de polietilenimina que tenha sido previamente dissolvido em PBS a 1 mg / ml de solução concentrada, e incuba-se durante 15-30 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, remova a mídia a partir de células e adicionar 4 ml por prato de doce D-MEM contendo 15% de calor soro fetal bovino inactivado e 100 U / ml de pen / strep. Adicionar a m 2l da mistura de transfecção e cultura durante a noite.
  3. Dia 3: adicionar 120 ul de 500 mM Na-butirato por prato para aumentar a expressão dos transgenes, misturar suavemente e cultura durante 6-8 horas após o qual substitui o meio de transfecção com 5 ml de meio de cultura.
  4. Dia 4: recolhem-se os sobrenadantes (total ml ca. 70), passar através de um filtro de 0,22 ^ M e de transferência, em 2 tubos de centrífuga de polialómero (35 x 89 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando um rotor oscilante. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 6 mL de PBS a cada tubo e incubar em gelo durante 1 hr. Ressuspender o sedimento e transferi-lo para um tubo de centrífuga polialómero (14 x 95 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando um rotor oscilante. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 50 ul de PBS, fazer alíquotas de 5 ul e armazenar a -80 ° C. Título virai irá estar no intervalo de 10 8 -10 9 cfu / ml. (Nota: os vírus são muito sensíveis à temperatura e armazenamento, avoID de recongelamento, manter em gelo seco durante o transporte e descongelar logo antes do uso.)

2. Injeção estereotáxica

  1. Anestesiar um rato 6-10 semanas de idade com isoflurano e colocar o animal em decúbito ventral sobre uma estrutura estereotáxica (Figura 2A), utilizando as barras de orelha e o suporte paladar para fixar correctamente a cabeça. O animal é mantido quente sobre uma almofada de aquecimento regulado a 37 ° C e sob administração de isoflurano constante.
  2. Injectar por via subcutânea 100 ml de solução buprenorfina trabalhando como preventivo analgésico, raspar uma faixa de pele sobre a cabeça do rato, e desinfectares como descrito em 1.4. Usando um bisturi, faça uma ca. 1,5 centímetros longa incisão longitudinal na pele, cabeça expor o crânio no nível da sutura sagital. Retrair a pele e limpe cuidadosamente a superfície do osso com um cotonete estéril.
  3. Half-encher um copo capilar (especificações 1.2) com óleo de parafina e montá-lo na bomba injetora inserindoo capilar até ao segundo anel (Figura 2B). Mover o suporte do capilar no eixo x, y e z, até a ponta do capilar é posicionado sobre a bregma, o ponto de articulação entre as suturas sagital e lateral (Figura 2C) (a ser determinado com a ajuda de um estereomicroscópio), e re set-x, y, z e os valores para 0.
  4. Mova o capilar de ± 1,6 mm no eixo médio-lateral (x) e -1,9 mm no eixo ântero-posterior (y) e marcar o osso usando uma caneta marcador cirúrgico. Fazer um buraco de ca. 0,5 mm de diâmetro sobre o crânio, usando um furador eléctrico prestar atenção para não danificar o cérebro.
  5. Colocar uma gota de 5 ul de suspensão viral (uma aliquota) sobre um pedaço de parafilm colocada nas barras de ouvido e mergulhar a ponta do capilar na gota. Sugar ca. 3,5 ul de suspensão viral utilizando um injector nanolitro fixado em 55 nl / seg. Executar este passo rapidamente como a gotícula irá evaporar-se.
  6. Mover o capilar para o local of injeção e movê-lo para baixo até a ponta toca a superfície pial. Redefinir o valor do eixo dorso-ventral (z) a 0. Neste ponto, penetram no tecido com o capilar para -1,9 mm e libertar 1,5 ul de suspensão virai a uma taxa de 4 nl / seg. Esperar durante 2-3 minutos, para minimizar o refluxo de suspensão viral através da pista capilar e, em seguida, retirar o tubo capilar. Uma segunda injecção pode ser realizada no hemisfério controlateral.
  7. Sutura da pele, desinfectar, e permitir que o animal recuperar da anestesia, como descrito anteriormente para in utero de electroporação (1,8).

Figura 2
Figura 2. Injecção estereotáxica viral. (A e B) Representação esquemática dos componentes necessários para a realização da injecção estereotáxica (A) e um suporte de capilar desmontada mostrando a inserção de uma capillary até que o segundo anel (B). (C) Imagem da cabeça de rato imobilizada por as barras de suporte do ouvido e palato com a pele cortada para expor o crânio (à esquerda). A ampliação da caixa a tracejado (direita) mostra as suturas sagital e laterais, a bregma, e do local de injecção (círculo).

3. Processamento da amostra

  1. Uma a três semanas após a infecção, perfundir o rato com ca. 100 ml de PFA 4%, dissecar o cérebro e pós-corrigi-lo durante a noite em PFA 4%. Eventualmente, BrdU e / ou tamoxifeno pode ser administrado antes do sacrifício de acordo com diferentes paradigmas para investigar cinética do ciclo celular e para interromper a expressão dos transgenes virais flanqueadas por locais loxP, respectivamente 9.
  2. O cérebro pode então ser processado para imunocoloração utilizando vários marcadores de células tronco e progenitoras e neurónios (eg Sox2, GFAP, nestina, Tbr2, doublecortin, etc).

Representative Results

  1. No geral, em electroporação utero produz 60-80% de embriões electroporadas exibem forte expressão do gene repórter em uma ampla área do córtex lateral (Figura 3A). As proteínas fluorescentes pode ser facilmente detectado em embriões inteiros de montagem assim que 3-6 horas após a cirurgia, com o sinal de duração de mais de uma semana. Dentro da área de alvo, cerca de 30-50% de células normalmente expressam o transgene (s) com a proporção de células co-expressão de duas (ou mais) co-electroporadas transgenes sendo geralmente superior a 90% (Figura 3B, para a esquerda) 6,8 de 15. Embora um nível mínimo de apoptose (ca. 2,0-2,5%) pôde ser observada após cerca de 2 horas a partir de electroporação, este valor irá retornar para níveis fisiológicos (0,5-1,0% ca.) após cerca de 6 horas (FC, dados não publicados). A proporção de embriões ou camundongos prenhes morrer devido a cirurgia é geralmente insignificante (<5%). Co-electroporação com cdk4/cyclinD1 sob estas condições, seguido por 48 horas de desenvolvimento desencadeia um aumento na expansão de células progenitoras neurais em 30% (Figura 3B, para a direita, e C) 15.

Figura 3
Figura 3. Expansão de células progenitoras neurais por cdk4/cyclinD1 superexpressão. (A) imagem de fluorescência de uma secção através da cortical lateral de um embrião de rato 24 horas após a electroporação com GFP e RFP plasmídeos no dia embrionário 13. (B) as imagens fluorescentes como em A 48 horas após a co-electroporação com cdk4/GFP e cyclinD1/RFP plasmídeos e imunomarcação para o marcador de células progenitoras Tbr2 basal. Repórteres fluorescentes com DAPI counterstainig (esquerda) e Tbr2 (direita) são mostrados. Linhas indica a superfície apical da zona ventricular (VZ; linha branca) e os limites da zona subventricular (SVZ; amarelos linhas tracejadas). Observe o aumento thickness da SVZ na porção electroporated do córtex (pontas de seta brancas), devido a um aumento da geração e da expansão de células progenitoras basais após sobre-expressão de cdk4/cyclinD1. (C) A quantificação do efeito mostrado na B. Barras = SD, p <0,05, n = 3. Gráfico de barras em C é retirado de Lange et al., 2009 15.

  1. Após a injeção estereotáxica viral, ca. 80% dos ratos operados exibir forte expressão dos transgenes em todo o giro denteado todo. A expressão constitutiva de GFP pode ser facilmente detectado em 40 secções uM logo que 4 dias após a cirurgia. Ao longo do eixo rostral-caudal para o giro denteado, cerca de 10-30% de células (equivalente a um total de cerca de 10,000-30,000. Células) normalmente expressam o transgene (s) (Figura 4A) 9. A proporção de ratos que morrem devido a cirurgia é insignificante (<5%). Três semanas a superexpressão de cdk4/cyclinD1 sob estas condições provoca um aumento no NSC por mais de doisdobras (Figura 4B), enquanto que diminuindo a neurogénese em 70% (Figura 4C) 9.

Figura 4
Figura 4. Efeitos da infecção viral. (A) reconstrução 3D de 7 imagens de fluorescência tomadas a partir de 40 um de espessura de série secções coronais (1 a cada recolha de 6) ao longo do eixo rostral-caudal para o hipocampo. GFP + células infectadas (verde) e DAPI coloração nuclear (azul) do giro denteado são mostrados (superior). Brilhantes imagens de campo dos cortes coronais correspondentes aos mostrados em A (meio) e representação em 3D (fundo) de todo o hemisfério cerebral com o hipocampo em destaque na verde pseudo (modificado a partir do Cérebro Allen Atlas; www.brain-map.org ) . Setas brancas apontar o local da injecção. Lateral (L), rostral (R), e dorSal (D) eixos (x, y, e z coordenadas estereotáxicas) são indicados (direita). (B e C) Proporção de nestina + NSC (B) e DCX + neurônios (C) dentro da população de células infectadas GFP + 3 semanas após a injeção estereotáxica de GFP (branco) ou cdk4/cyclinD1/GFP (preto) vírus. Bares = SD, p <0,005, n = 3. Gráficos em B e C constante do Artegiani et al., 2011.

Discussion

Um passo crítico para electroporação em útero é a qualidade ea pureza do ADN, desde a sua migração direccional durante a entrega dos campos eléctricos depende da sua carga. Os protocolos para a purificação de ADN que não incluem a remoção de outras moléculas carregadas, tais como endotoxinas, pode levar ao mascaramento das cargas negativas de ADN naturais que levam a entrega pobre. Claramente, tocar nas paredes uterinas com os eléctrodos de tão perto quanto possível da área a ser alvo irá melhorar a eficiência de electroporação. Igualmente importante é a qualidade dos eléctrodos utilizados uma vez que esta é fundamental para a entrega de óptimos campos eléctricos. Micro-arranhões nem sequer visíveis a olho nu e / ou resíduos orgânicos, tais como traços de soro, lípidos, e assim por diante, vai inevitavelmente se acumulam ao longo do tempo que conduz a eléctrodos de perder as suas propriedades. Electropes velhos e / ou suja são a causa mais provável de uma queda repentina na eficiência electroporação e, portanto, deve ser replaced logo que este é notado. Embora relativamente simples, em eletroporação utero normalmente exige algumas semanas de treinamento, a fim de atingir de forma satisfatória e reprodutibilidade dos resultados. Esta técnica é muito versátil uma vez que podem ser aplicadas, virtualmente, a qualquer órgão e tecido do embrião em desenvolvimento. Certamente, os órgãos que contêm uma cavidade, tal como o cérebro, são particularmente fáceis de orientar e permitir uma elevada percentagem de células transfectadas devido à facilidade de injectar um volume relativamente grande de DNA.

Um problema comum encontrado na criação de injecção estereotáxica viral é ter poucas células infectadas e / ou para definir áreas indesejadas. O primeiro problema está principalmente relacionado com a injecção de vírus de título baixo. As células 293T com menor número de passagens em cultura de crescer mais rapidamente e levam a maiores títulos virais. Utilizando células com mais de ca. 20 passagens não é recomendado e meios de transfecção com menos de 80% de eficiência não permitem assegurar uma boaprodução viral. Ressuspender o sedimento viral é também crítico, a suspensão viral tem a aparecer tufos homogéneos e virais que poderiam obstruir os capilares têm que ser evitadas. Os vírus são muito sensíveis à temperatura cai e armazenamento a longo prazo. Por estes motivos, as alíquotas de ser permanentemente armazenado a -80 ° C e não pode ser novamente congelado. Mesmo sob estas condições, uma diminuição na infecciosidade pode ser observada depois de 6-12 meses de armazenamento. Nas fases de aprendizagem, sugere-se a testar o título virai de cada preparação viral e para fazer de novo após armazenamento a longo prazo. A presença de células infectadas em áreas não desejadas do cérebro pode depender de um posicionamento suboptimal da cabeça do rato sobre a armação estereotáxica, que requer alguma prática. Além disso, é essencial para não danificar a superfície do cérebro enquanto que a abertura do orifício no crânio, porque de outro modo não será possível para restaurar o 0 correctamente na superfície pial, resultando em injecção imprecisa. As coordenadasque no presente Protocolo são referidos C57/BL6 6-10 semanas de idade e fêmeas sugerimos otimizando-as para diferentes cepas / idade / sexo. Aquisição desta técnica pode exigir mais tempo do que no útero devido à electroporação as fases mais longos necessários para preparar os vírus e analisar as amostras. Recomendamos fortemente que os vírus só são utilizados após a cirurgia do mouse e injeção estereotáxica tornaram-se confiável e reprodutível. O primeiro passo para alcançar este objectivo é injectar células permeantes corantes de ADN, tais como a Hoechst 33342, em ratos submetidos a eutanásia e analisar os cérebros imediatamente.

In utero eletroporação e injeção viral estereotáxica são dois sistemas poderosos para aguda e tecido-específica manipular a expressão de genes dentro do SNC durante o desenvolvimento dos mamíferos e idade adulta. Apesar da sua limitação em alvejar apenas uma sub-população de células, esses sistemas proporcionam uma velocidade sem precedentes e facilidade, em comparação com métodos mais convencionais, in particular a geração laborioso e demorado de ratinhos transgénicos. No entanto, apesar dessa semelhança, existem várias diferenças entre as duas técnicas que merecem destaque. Em primeiro lugar, no que respeita à orientação dos diferentes tipos celulares, de electroporação utero conduz inicialmente para a transfecção de células estaminais adequadas (também chamado de células da glia radial), porque estas são as únicas células que delimitam o ventrículo, onde o DNA é injectada. Como resultado de divisões celulares, plasmídeos vai subsequentemente ser herdado de alvo, as células estaminais da mãe para a sua progenitora e / ou células filhas neuronais levando a redistribuição de células transfectadas em todo o córtex como uma função do tempo. Em contraste, o uso dos lentivírus HIV no cérebro adulto leva à infecção simultânea de qualquer tipo de células, incluindo as células estaminais, progenitoras, bem como neurónios maduros células gliais. De notar, no que diz respeito ao uso de lentivírus HIV em oposição a retrovírus mais vulgarmente utilizados é o factoque a integração lentiviral iria ocorrer independentemente do estado mitótico das células, permitindo assim que a segmentação também de adultos, as células estaminais quiescentes.

Em segundo lugar, uma outra diferença importante entre a electroporação e infecção viral é a de que uma expressão transitória episomal é conseguido pelo primeiro, em oposição à integração irreversível de ADN no genoma das células infectadas obtidos por este último. Como resultado das divisões celulares sucessivas, a diluição dos plasmídeos electroporadas e degradação da proteína cyclinD1 ectópica, poderia advir em cada ciclo celular. Assim, a expansão da NSC durante o desenvolvimento embrionário foi demonstrado que apenas é de aproximadamente dois dias 15, enquanto no cérebro adulto este efeito foi encontrado para a duração de vários meses (resultados não publicados).

Terceiro, uma vez que i) cdk4/cyclinD1 tem um forte efeito sobre as células com um longo G1 e ii) cometidos progenitores neurais durante o desenvolvimento tem um ciclo celular maisdo que as células-tronco, enquanto o oposto é verdadeiro na vida adulta, os nossos dois manipulações foram encontradas para desencadear a expansão, principalmente, de progenitores neurais durante o desenvolvimento e células-tronco durante a vida adulta. Em ambos os casos um aumento nos neurónios tem sido alcançada por ambos os métodos.

Injecção, quarta viral pode ser facilmente realizado, de forma fiável e reprodutível, em muitas regiões diferentes do cérebro adulto, simplesmente mudando as coordenadas estereotáxicas. Em contraste, o direccionamento preciso de certas regiões do sistema nervoso central, tais como o tronco cerebral, hipocampo, ou da medula espinhal, por electroporação em utero pode ser mais difícil de conseguir de forma reprodutível. Além disso, enquanto que a injecção estereotáxica podem ser realizadas em ratos de qualquer idade, o desempenho óptimo de electroporação no útero está limitado de cerca de E11 a E16. Estágios antes de E11 exigiria a utilização de um microscópio de backscatter de ultra-som 18,19 ou um culto todo embriãoure sistema 17,20.

Recentemente, um crescente interesse em biologia celular básica de células-tronco somáticas foi promovido porque o seu estudo e manipulação são considerados fundamentais para o desenvolvimento de novas terapias baseadas em células regenerativas. Em particular, para a superexpressão de cdk4/cyclinD1, o nosso protocolo fornece os meios para aumentar transitoriamente a expansão da NSC in vivo (Figura 3B e 4B e C e C), a fim de aumentar o número de neurónios gerados no cérebro adulto. Acreditamos que estas manipulações podem ser importantes em vários contextos diferentes para melhor compreender o papel da NSC no desenvolvimento do cérebro, evolução e homeostase, bem como a sua contribuição para a função cognitiva ou recuperação a partir de degeneração neural ou lesão.

Disclosures

BA e FC apresentaram um pedido de patente que descreve a expansão condicional de células-tronco adultas somáticas por cdk4/cyclinD1 vírus (PE 10.160.288,6).

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Centro de terapias regenerativas, a Faculdade de Medicina da TU Dresden, ea DFG Collaborative Research Center SFB655 (A20 subprojeto). BA foi apoiado por uma bolsa do programa CAVE-BB, Dresden. Agradecemos os drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Lie Chichung e Ravi Jagasia para o conselho precioso durante a criação de no útero eletroporação e injeção viral estereotáxica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endofree maxi plasmid kit Qiagen 12362
FastGreen Sigma F7258
P-97 Flaming/Brown pipette puller Sutter Instruments
Borosilicate capillaries with filament Sutter Instruments BF120-69-10
Table top laboratory animal anesthesia system VetEquip 901806
Isofluran Baxter HDG9623
Germinator 500 glass bead sterilizer SouthPointe Surgical GRM5-1460
Iris forceps WPI 15917
Betaisodona solution Mundipharma 1931491
Pico Pump WPI PV820
ECM 830 square wave electroporator Harvard Apparatus 450052
Round tweezer electrodes NEPAGENE CUY650P1
Suture material Ethicon V493H
Reflex clip applier for wound closure WPI 500345
Temgesic injection solution Essex Pharma AG
DMEM w/Glutamax-I Invitrogen 31966021
Fetal Bovin Serum Invitrogen 1027016
Penicillin/Streptomicin Gibco 15140
Tissue culture dish Falcon 353003
Polyethylenimine 250 ml Sigma-Aldrich 40872-7
n-Butyric acid, sodium salt Sigma B 5887
Tube, thinwall, polyallomer Beckman 326823 / 331374
Model 900 small animal stereotaxic instrument Kopf Instruments
OPMI pico microscope Zeiss
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector WPI B203MC4
Glass replacement 3.5 nanoliter WPI 4878
SR drill general application Foredam K2272
Antibody Supplier Catalog # Dilution
Doublecortin Santacruz SC8066 1:100
GFAP Chemicon MAB3404 1:500
Nestin BD Biosciences 556309 1:1000
S100β Abcam Ab868 1:1000
Sox2 Millipore AB-5603 1:500
Tbr2 Abcam Ab23345 1:400
Table of antibodies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
  3. Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
  4. Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
  5. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  6. Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain--using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
  8. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. Suppl 19 Supp. 120-125 (2009).
  9. Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
  10. Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  12. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  13. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
  14. Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
  15. Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
  16. De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
  17. Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
  18. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
  19. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
  20. Osumi, N., Inoue, T. G. ene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics