In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Este protocolo nos permite realizar uma manipulação genética in vivo em um modelo animal chave que nos permite estudar a expansão e a dobra de um neocórtex em desenvolvimento. A principal vantagem deste método está em usar alta especificidade espacial e temporal no direcionamento dessas células-tronco neurais que são o tipo de célula chave para o desenvolvimento cerebral. Antes de iniciar o procedimento, puxe capilares de vidro em um puxador de micro pipeta e use fórceps para cortar a parte distal do capilar para ajustar o diâmetro da ponta capilar.

No dia 33, adicione a concentração adequada de DNA na PBS, suplementada com 0,1% Fast Green com mistura suave, e coloque um furão feminino grávida de 3 horas em uma mesa de operação com uma almofada de calor. Confirme o nível adequado de sedação tocando a pele periocular e beliscando a pele entre o segundo e o terceiro ou terceiro e quarto dedo dos dois membros traseiros. Isoflurano pode causar efeitos adversos, incluindo náuseas e tonturas.

Ao manusear isoflurane em forma líquida, use o equipamento de proteção. Durante a cirurgia, use recipientes apropriados para capturar o gás. Injete o animal subcutâneamente com analgésico, antibiótico e glicose, e coloque pomada nos olhos do animal.

Use cortadores para raspar o abdômen e limpe a pele exposta com uma solução de água, sabão e iodo. Em seguida, seque a pele com cotonetes de gaze e desinfete com álcool e esfoliantes de iodo. Pois na eletroporação uterica, coloque uma cortina estéril sobre o animal e use um bisturi para fazer uma incisão de pele de aproximadamente 5 centímetros na linea alba.

Use uma tesoura para cortar a camada muscular e coloque cotonetes de gaze ao redor do local da incisão. Molhe a gaze com PBS e coloque o útero nos cotonetes. Usando uma pipeta com uma ponta longa, carregue um dos capilares de vidro puxados com 5 microliters de solução de DNA por embrião a ser injetado.

Conecte o capilar carregado a um suporte e conecte o outro lado do suporte a um tubo e a um porta-voz. Localize a cabeça do primeiro embrião e coloque uma fonte de luz de fibra óptica ao lado da cabeça. Usando a íris pigmentada como ponto de referência, penetre a pele, crânio e tecido cerebral com a ponta do capilar de vidro e use tubos bucais para facilitar o fornecimento de 3-5 microliters da solução de injeção no ventrículo de um dos hemisférios cerebrais.

Como a solução injetada contém 0,1% Verde Rápido, uma injeção bem sucedida resultará em uma coloração verde escura do ventrículo injetado, que agora será visível como uma estrutura em forma de rim. Após a injeção, coloque os eletrodos da pinça no útero acima da cabeça do embrião com o polo positivo acima da área a ser alvo e o polo negativo abaixo da área injetada. Defina o comprimento do pulso do eletroporato para 50 milissegundos, a tensão de pulso para 100 volts, o intervalo de pulso para um segundo, e o número de pulsos para cinco.

Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, pressione o Pulse”e solte rapidamente várias gotas de PBS quente no embrião eletroporado. Quando todos os embriões tiverem sido eletroporados, devolva o útero à cavidade peritírea e use uma sutura 4-0 para fechar a camada muscular com o peritônio. Feche a pele de forma semelhante e cubra a ferida com spray de alumínio.

Em seguida, devolva o animal para sua gaiola com uma fonte de calor e monitorando até a completa recumbência. Quatro dias após a eletroporação no dia 37, a maioria das células-alvo e sua descendência ainda estão nas zonas germinais e as células raramente são observadas ainda mais basicamente dentro da placa cortical. A identidade progenitora pode ser examinada por imunofluoresência para marcadores de células ciclísticas, como PCNA, enquanto um subconjunto de progenitores submetidos à mitose pode ser mostrado por marcadores como fosfo-histona 3.

No dia zero pós-natal, oito dias após a eletroporação, a prole das células-alvo se espalhou para todas as camadas histológicas. Usando uma combinação de marcadores de fator de transcrição, diferentes populações progenitoras basais podem ser reveladas. Por exemplo, Sox2 é um marcador de células progenitoras proliferativas, incluindo glia radial basal.

E a proteína cerebral T-box 2 é um marcador de progenitores basais neurogênicos, que são principalmente progenitores intermediários. No pós-natal do dia 16, a maioria das células-alvo param de se dividir e se diferenciar em neurônios e glia, com furão pós-natal dia 16 neocórtex exibindo o padrão de dobramento característico. A eletroporação no útero de embriões furões é um método extremamente poderoso para estudar a função dos genes.

Permitiu-nos estudar genes que foram implicados na expansão do neocórtex na evolução, incluindo genes específicos do homem. E usando este método poderoso, nós realmente fomos capazes de descobrir características-chave de como a expansão evolutiva do neocórtex humano provavelmente funcionou.