Waterborne를 검색하는 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 및 열 분해 단계를 사용 수정일 EPA 방법 1,623

Immunology and Infection
 

Summary

이 프로토콜은 waterborne의 검출을위한 다른 단계로 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 샘플 농도 시스템의 사용 및 열 분해를 설명

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Rhodes, E. R., Villegas, L. F., Shaw, N. J., Miller, C., Villegas, E. N. A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.. J. Vis. Exp. (65), e4177, doi:10.3791/4177 (2012).

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Abstract

CryptosporidiumGiardia 종, 그 원인 waterborne diarrheal 질병 발생은 전세계 원생 동물문 가장 널리 두 가지입니다. 나은이 병원체의 유행을 특성화하기 위해 EPA 방법 1623가 개발하고 미국의 식수에서 이러한 유기체의 수준을 모니터링하는 데 사용된 것은 12 공급하고 있습니다. 방법은 세 가지 주요 부분으로 구성되어 있으며, 첫 번째는 원시 표면의 물이 적어도 10 패가 필터링되는 시료 농도입니다. 생물과 덫에 파편 나서 필터에서 eluted 및 추가 샘플을 집중 centrifuged있다. 메서드의 두 번째 부분은 농축 물 샘플은 특히 농축 잔해에서 기생충의 특정 제거 허용 Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts에 바인딩 immunomagnetic 구슬에 적용됩니다 immunomagnetic 분리 절차를 사용합니다. 이러한 (OO) cysts 그러면 산성 분해 proce에 의해 자석 구슬로 떨어뜨려졌다dure. 메서드의 마지막 부분 (OO) cysts는 슬라이드, 스테인드에 적용하고, 현미경으로 열거됩니다 immunofluorescence 염색법과 열거입니다.

Envirochek 필터 (막 공사, 앤아버 미시건), Envirochek HV 필터 (막 공사), Filta - 맥스 필터 (IDEXX, 웨스트 브룩, MA) : 방법 1623은 물 속에 Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts를 캡처 목록에 명시된 4 가지 시료 농도 시스템을 가지고 또는 연속 흐름 원심 분리 (Haemonetics, Braintree, MA). 그러나, CryptosporidiumGiardia (OO) 낭종의 recoveries는 1,14를 사용한 소스 물 매트릭스 및 필터에 따라 매우 다양합니다. 새로운 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration (HFUF) 시스템은 최근 Cryptosporidium oocysts를 복구에서보다 효율적이고보다 강력한 것으로 표시되었습니다 각종 수상 매트릭스에서 Giardia의 cysts는, 또한, 다른 캡슐 필터 옵션을보다 저렴S는 동시에 1-3,5-8,10,11을 여러 병원균을 집중하실 수 있습니다. 또한, 힐 및 동료에 의해 ​​이전의 연구들은 직접 Envirochek HV 필터 4 비해 HFUF 크게 Cryptosporidium oocysts의 recoveries를 개선한다는 보여주었다. 현재의 방법에 대한 추가적인 수정은 또한 방법의 성능을 향상시키기 위해보고되었습니다. 열 분해하여 산성 분해 절차를 교체하는 것은 어떤 매트릭스 9,13의 자석 구슬에서 Cryptosporidium를 분리에서보다 효과적인 것으로 표시되었습니다.

이 프로토콜은 열 분해 단계로 새로운 HFUF 여과 시스템을 사용하는 수정된 방​​법 1623에 대해 설명합니다. 이 수정된 방​​법으로 HFUF의 사용은 현재 EPA 방법 1,623 여과 옵션 저렴한 대안이며, 여러 생물의 농도를 허용함으로써 더 많은 유연성을 제공합니다.

Protocol

1. 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 절차

  1. 버퍼 및 솔루션의 준비 :

    용출 솔루션 (1 패) :
    시약 등급 물 1 L은 0.1 g 나트륨 polyphosphate, 0.1 ML 십대 초반-80 및 0.01 ML Y-30 antifoam을 추가하려면.

  2. 생물 학적 안전 캐비닛에 필터 어셈블리 (그림 1) 준비 :
    1. Masterflex I / P 정밀 brushless 드라이브에 연결된 Masterflex I / P 쉬운로드 펌프 헤드를 통해 Masterflex I / P 73 실험실 튜브를 삽입합니다.
    2. 나사 클램프와 펌프 헤드의 상류 NPT 지점 T-커넥터가 장착되어 0-60 PSI, 글리세린 가득한 압력 게이지에 튜브를 확보하고, 펌프 헤드의 HDPE T-커넥터 하류에.
    3. Nalgene Masterflex L / S 15 실험실 튜브와 53-B 충전 / 방출 모자와 T-커넥터를 맞추려고하고 1 패 Nalgene 무거운 듀티 폴리 프로필렌 병에 확보하여 retentate 병을 조립.
    4. Masterflex L / S 24 튜빙 W를 맞추기ith 핀치 클램프 (핀치 클램프 2)와 HDPE T-커넥터에 retentate 병에서 연결합니다.
    5. 압력 게이지에서 아사히 Kasei에 Masterflex L / S 24 실험실 튜브를 연결은 나사 클램프와 초 하이 플럭스 dialyzer을 Rexeed하고 dialyzer에서 retentate 병. 중공 섬유 ultrafilter에 튜브를 연결 ¼ "ID 튜빙을 수용하도록 설계된 맞춤 DIN 어댑터를 사용하십시오.
    6. 핀치 클램프 (핀치 클램프 1) Masterflex L / S 24 실험실 튜브를 장착하고 샘플 이해 라인 역할을 제거 팁 및 목화 플러그와 함께 10 ML 플라스틱 피펫에 연결하고 HDPE에 튜브를 장착 T- 커넥터.
    7. 램프는 필터의 출구 끝 부근 유출물 포트에 튜브 클램프 접속과 Masterflex L/S-36 실험실 튜브의 한쪽 끝을 어울린다. 폐기물 컨테이너의 다른 쪽 끝을 놓으십시오.
  3. 0.01 % (W / V) 10 L의 물을 샘플로 나트륨 polyphosphate 및 3 분 혼합을 추가합니다.
  4. 핀치 클램프 2 닫기그리고 retentate 병의 배출구 뚜껑을 제거합니다. 다른 모든 클램프가 열려 있어야합니다.
  5. 압력 게이지 (왼쪽 아래 그림 1 오른쪽)에 T-커넥터에서 유체를 이동하기 위해 펌프의 방향을 설정합니다. 최대 속도의 25 %로 펌프 속도를 조절하고 펌프를 켜십시오.
  6. retentate 병이 3분의 2 전체, 오픈 핀치 클램프 2 빠르게 retentate 병에 환기구 뚜껑을 교체합니다. 라인과 전혀 누수가없는 있도록 부속품을 모두 확인합니다.
  7. 천천히 누수를 확인하고, 원하는 여과 속도 (약 1.5 L / 분)로 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 졸업 실린더와 타이머 또는 플로우 미터를 사용하여 방류수 라인 (그림 1의 파란색 L / S 36 관)에서 종료 물을 여과물 속도를 확인합니다. 기포가 일반적으로 어렵게 안정적인 압력과 여과 속도를 달성하는 필터의 출구 끝에 형성할 수 있습니다. 이것은 잠시 손으로 유출물 라인을 곤란에 의해 수정되었습니다. 이 작업은일반적으로 여과물 포트에 공기 방울이 동축 케이블되며 유출물 라인을 통해 종료합니다. 완두콩 크기의 공기 방울은 종종 불가 피한 것을 염두에두고 필요에 따라 반복합니다.
  8. 여과 과정을 모니터링합니다. 필요에 따라 압력과 여과 속도를 측정하고 기록합니다. 압력이 20 Psi를 초과하지 않습니다. 이것은 여과 속도가 2.0 L / 분을 초과하지 말아야하는 것이 좋습니다. 그것은 retentate 병의 물을 볼륨은 강물을 쏟아 내죠 결코 않도록 감시하는 것이 중요합니다. 그것은 약간 높이거나 줄일 수있는 볼륨 정상입니다. retentate 병의 저수량은 아래 3분의 1 전체 떨어지는 경우 배출구 뚜껑을 제거하고 가까운 핀치는 retentate 병 라인에서 2 클램프. 대한 삼분의이 전체로 볼륨을 지참, 클램프를 열고 신속하게 단단히 밀봉을 보장, 환기구 뚜껑을 교체하십시오. retentate 병의 볼륨이 신속하고 지속적으로 떨어지는 경우 retentate 병 뚜껑을 꽉이며 배출구 캡이 제자리에 안전을 보장하고 있다고 tubiNG는 물 시료와 접촉 여전히입니다. 이러한 문제가 발생하지 않는 경우, 그때 그것은 retentate 병 뚜껑의 봉인이 불량이므로 교체해야 가능성이 높습니다.
  9. 샘플 컨테이너가 비어있는 경우, 즉시 가까운 핀치 클램프 1, 최대 20 %까지 펌프 속도를 줄이고, retentate 병에서 배출구 뚜껑을 제거하고 램프 클램프를 닫습니다.
  10. 램프 클램프를 강화하거나 풀어하여 약 200 ML에 retentate 병에 시료의 볼륨을 조정합니다. 볼륨이 약 200 ML되면 용출 단계 (1.11-1.12)에 대한 경사로 클램프를 조입니다.
  11. 샘플 용기에 용출 용액 500 ML을 추가하고 컨테이너의 내부를 씻어. 용출 용액이 들어있는 용기에 시료 이해 라인에 연결된 10 ML의 피펫를 놓습니다. 진입로 클램프가 닫혀 있는지 확인합니다. 오픈 핀치 1 클램프와 가까운 핀치는 용출 솔루션을 구축하기 위해 일시​​적으로 2 클램프.
  12. 용출 용액의 500 ML이 수립되면가까이 클램프 1과 오픈 핀치 클램프 2 꼬집어. 용출 솔루션은 최대 20 %의 펌프 속도를 5 분 동안 순환하도록 허용합니다.
  13. 유출물 줄에 램프 클램프를 강화하거나 풀어하여 약 100 ML에 retentate 병에 시료의 볼륨을 조정합니다. 램프 클램프를 조여하고 예제 1 분 순환 수 있습니다. retentate 병에 시료의 볼륨을 확보하여 튜브에 공기를 당기는 것은 피한다 retentate 병을 입력 L / S 15 튜빙을 감추기에 충분 할만큼 높습니다.
  14. retentate 병에 시료를 강제 펌프의 방향을 역방향. 펌프 retentate 병에 ~ 225 ML의 총 발생 20 초 동안 반대로 실행하도록 허용합니다. 펌프의 전원을 끕니다.
  15. 펌프 헤드에서 Masterflex I / P 73 튜브를 제거하고 압력 게이지를 분리합니다. 중공 섬유 ultrafilter을 종료 Masterflex L / S 24 튜브 연결을 끊습니다. 로 모든 나머지 샘플을 강제로 retentate 병 위에 튜브를 잡아병을 retentate.
  16. 병에서 모든 튜브를 분리하고 비 방출 캡으로 방출 뚜껑을 교체하십시오.
  17. ~ 225 ML의 retentate으로 IMS / IFA 절차로 진행합니다.

2. Immunomagnetic 분리 절차

  1. 버퍼 및 솔루션의 준비 :
    1. Cryptosporidium / Giardia 콤보 키트는 실내 온도에 도달 : Dynabeads에 포함된 버퍼를 허용합니다.
    2. 1X SL-버퍼 : 10X SL-버퍼 9 ML 시약 등급 물 1 ML을 추가합니다.
  2. 라벨 250 ML 원추형 원심 관에 retentate 병에서 액체 ~ 225 ML을 전송합니다. 시약 물 10 ML로 두 번 retentate 병을 씻어하고, 원추형 원심 튜브에 물에 빨고을 추가합니다. 4에 15 분 °없이 브레이크와 C에 대해 1,500 XG에 현탁액을 원심 분리기.
  3. 조심스럽게 펠렛 볼륨의 모든 0.5 ML (즉, 기음 1을위한 공기 물 인터페이스에서 포장 펠렛 위의 5 ML에 뜨는을 기음5 1.3 ML의 펠릿 볼륨 위의 ML, 그리고 대기음 0.5 ML 이하)의 펠렛 5 ML합니다.
  4. 철저하게 vortexing 및 / 또는 피펫 혼합하여 뜨는로 펠렛을 resuspend. 한 ML을 포함하는 평면 양면 Dynal 10 파운드 라니 튜브에 액체 각 1 부​​ 5 ML 볼륨을 전송하고 SL-버퍼 B. 10X는 시약 물 2.5 ML로 두 번 원추형 원심 튜브를 씻어과에 린스를 추가 SL-버퍼 10X 각 버퍼를 포함하여 10 파운드 라니 튜브 ~ 12 ML의 전체 볼륨을 데려오 10 파운드 라니 튜브.
  5. 10 파운드 라니 튜브에 100 μl 잘 혼합 resuspended 안티 Cryptosporidium 및 안티 Giardia Dynabeads를 각각 추가합니다. 회전 믹서에 실온에서 1 시간 18 rpm으로 10 파운드 라니 튜브를 회전합니다.
  6. MPC-6 자석 부드럽게 손으로 바위 2 분을 튜브 엔드 - 투 - 엔드, 180 ° 반대 10 파운드 라니 튜브의 평평한 면을 넣습니다.
  7. 자석 측면과 MPC-6 자석에 10 파운드 라니 튜브를 유지할 수있다는 것은 최대, 비드 / (OO) 낭종 단지 보우 멀리 뜨는을 가만히 따르다자석에 ND. 자석에서 10 파운드 라니 튜브를 제거하고 튜브에 1X SL-버퍼 0.5 ML을 추가합니다. 수직 위치에있는 자석으로 MPC-S에서 열리는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로를 SL은 버퍼 1X 0.5 ML의 두 개의 추가 물에 빨고을 사용하여 현탁액을 전송합니다.
  8. 부드럽게 1 분 MPC-S 자석 180 °에서 튜브를 흔들. 대신에 자석으로 microcentrifuge 튜브의 하단으로 이동 파스퇴르 피펫을 사용하여 표면에 뜨는을 기음.
  9. microcentrifuge 튜브의 전면 측면에 1X PBS 1 ML 추가 자석을 제거하고 구슬이 resuspended 때까지 그냥 부드럽게 튜브를 흔들. 수직 위치에 자석을 교체하고 부드럽게 1 분 관 180 °를 흔들. PBS는 가능한 한 많은 파편으로 제거하는 파스퇴르 피펫을 사용하여 비드 펠렛을 방해하지 않고, 린스 기음.
  10. 자석을 제거하고 microcentrifuge 튜브의 뒷면에 시약 물을 50 μl를 추가합니다. 와동 50 초만 전속력으로 튜브,다음 삼십초 와동이어서 10 분 동안 80 ° C에서 튜브를 품어. 자석에 비즈를 묶는 방식과 액체에 (OO) cysts두고, 한쪽으로 치우 쳤던 위치에서 MPC-S에 자석을 교체하십시오. SingleSpot 아니라 슬라이드에 (OO) 낭종 서스펜션을 적용합니다.
  11. 최초의 분리를 포함하는 동일한 잘으로 액체를 적용, 단계 2.10를 반복합니다. 37 ° C 슬라이드도 슬라이드에 현탁액을 건조하여 1 시간 정도 따뜻한 장소에 슬라이드.

3. 염색법 및 심사

  1. 버퍼 및 솔루션의 준비 :
    DAPI 솔루션을 일하는 것은 : 1X PBS의 25 ML에 DAPI 증권 솔루션 (메탄올 2 밀리그램 / ML) 25 μl를 추가합니다. 매장 재고와 1 ° C와 어둠 속에서 10 ° C 사이에서 작동 솔루션.
  2. 물론 슬라이드에 메탄올 50 μl를 적용하고 실온에서 건조하실 수 있습니다.
  3. 물론 슬라이드로 작동 DAPI 용액 50 μl을 넣고 실온에서 2 분 동안 품어.
  4. Kimwi 사용PE는 우물에서 DAPI를 심합니다. EasyStain 50 μl을 적용합니다. 30 분간 35 ° C에서 품어.
  5. Kimwipe으로 잘를 착색하고 천천히 그것이 잘 끄트머리로 흐를 수 있도록 추운 EasyStain 고정 버퍼 300 μl를 추가 위크. 실온에서 2 분 동안 품어.
  6. 우물에서 버퍼를 등심과 EasyStain 장착 매체의 10 μl을 적용하는 Kimwipe을 사용합니다.
  7. 조심스럽게 발생하는 기포를 제거, 커버 전표를 적용합니다. 투명 매니큐어로 커버 슬립을 봉쇄해.
  8. oocyst이나 낭종 유사 난형 또는 원형 사과 녹색 형광 개체, 200X 총 배율에서 FITC 필터를 사용하여 전체 슬라이드를 검사합니다. 또한 1000X 총 배율에서, 1000X 총 배율에서 DAPI 필터와 함께 다음 DIC있는 이러한 모든 개체를 검사합니다. 보정 안구 마이크로 미터 및 형태학의 특성을 사용하여 크기를 기록합니다.
  9. 문서 결과입니다.

참고 : 추가 infor원래 프로 시저에 대한 mation은 EPA 방법 1623 12 2005년 12월 버전에서 찾을 수 있습니다. 설명 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 절차는 EPA 방법 1623의 섹션 12.0 대신 사용됩니다. 열 분해는 EPA 방법 1623의 섹션 13.3.3을 수정합니다. 절차는 또한 추가적인 PBS 섹션 13.3.2.16 후에 방법 1623의 2005년 12월 버전에 삽입될 수 IMS 과정 린스 설명합니다. 이러한 수정 사항을 포함하여 EPA 방법 1623에 사용되는 소모품, 시약 및 장비의 전체​​ 목록은 장비 목록에 나열됩니다.

4. 대표 결과

여과 및 immunomagnetic 분리의 과정을 통해 복구된 Cryptosporidium의 oocysts과 Giardia의 cysts는 현미경 분석에 의해 감지됩니다. 그림 2와 같이 200X 전체 배율에서, 각 유기체는 일반 염색법 패턴, 크기 및 모양을 전시 Cryptosporidium은 구면 개체 난형이다 밝게 강조 모서리 (그림 3A와 함께 빛나는 사과 녹색의 FITC의 형광을 전시 직경 4-6 μm의 ). 녹색 테두리없이 뚜렷한 핵 (DAPI 제외), 강렬한 파란색 내부 염색법, 또는 최대 4 개의 별개의, 스카이 블루 핵 (DAPI와 하늘색 내부 염색법 : DAPI 자외선으로 oocyst는 다음과 같은 일반적인 기능 범주 중 하나를 전시합니다 긍정 - 그림 3B). 비정형 특징은 색깔, 구조, 또는 DAPI 형광 (예를 들어, 너무 많은 스테인드 핵, 붉은 색은 내부 구조를 fluorescing)의 편차를 포함합니다. 형광 객체가 일반적인 FITC와 DAPI 염색법에 대한 기준을 충족하고있다면, 그것은 차동 간섭 죄수를 사용하여 검사하고 있습니다trast (DIC). 개체는 같은 세포 벽 장식, 또는 셀을 채울 하나 또는 두 개의 커다란 핵 같은 비정형 외부 또는 내부 형태학의 특성을 면밀히 검토합니다. 비정형 구조가 관찰되지 않은 경우 개체가 전체 IFA 카운트에 기록하고 빈 비정질 구조이나 현재 1-4 sporozoites (그림 3C)로 분류됩니다. 마찬가지로, Giardia와 같은 개체는 FITC와 DAPI 염색법뿐만 아니라 axonemes, 중간 기관, 그리고 핵 같은 DIC 특성에 관한 검토되고 Giardia의 cysts는 난형의 사과 - 그린 화려한 개체, 8 라운드가 - 5.에 의해 긴 18 μm의 - 15 μm의 밝게 강조 모서리 (그림 3D)와 폭. DAPI 자외선으로 Giardia의 포낭은 DAPI-부정적인 염색법, 또는 DAPI - 긍정적인 특성 (그림 3E) 전시됩니다. Cryptosporidium에 대해 설명한 것처럼 형광 객체는 같은 방식으로 전형 및 비정형 특징을위한 DIC을 면밀히 검토합니다.비정형 기능이 관찰되지 않으면 개체는 총 IFA 카운트에 기록하고 빈 함유 비정질 구조로서, 또는 현재의 내부 구조 (그림 3 층) 중 하나 이상의 유형으로 분류됩니다.

비정형 특징을 가지고 관찰되는 모든 유기체는 (OO) 낭종으로 계산해서는 안됩니다. 환경 시료의 현미경 분석은 자동 형광 또는 FITC-복합 백신 Cryptosporidium 및 / 또는 방지 Giardia 항체 1 교차 반응 있습니다 유기체가로 도전하실 수 있습니다. 그것은 분석가가 수생 미생물, CryptosporidiumGiardia을 파악 경험을 쌓을 수있는 슬라이드를 검토 수십 잘 알고 있어야하는 것이 좋습니다. 최소한 세 (OO) 긍정적인 염색법 컨트롤 슬라이드에 cysts 전에 현미경의 모든 세션에 대한 특징으로한다.

품질 관리 표본 %의 우물을 결정하기 위해 (OO) cysts를 타서 수 있습니다계산을 사용하여 각 protozoan에 대한 보임 :
(OO) 낭종 비율 복구 = ((QC 샘플 백작 - Unspiked 샘플로부터 세어) / 스파이크) × 100.

그림 1
그림 1. 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 시스템의 그래픽 표현. 튜빙은 원조를 담고 색깔 것은 시스템의 조립입니다.

그림 2
그림 2. CryptosporidiumGiardia (OO) cysts 대표 형광 이미지. Cryptosporidium의 oocysts과 Giardia의 cysts는 FITC 분류 안티 Cryptosporidium / Giardia 항체 물들일되었다. 화살표, Giardia의 cysts, 화살촉, Cryptosporidium oocysts. 네 Cryptosporidium oocysts 여섯 Giardia의 cysts의 총 초점 비행기에서 발견되었다. 샘플 observ200X 배율 미만의 에드.

그림 3
. 특성화에 사용 Cryptosporidium oocysts 및 Giaridia의 cysts의 그림 3 대표 미세한 이미지 Cryptosporidium의 oocysts (- C가).. 뚜렷한, 스카이 블루 DAPI의 핵 (B)와 oocyst 당 1-4 sporozoites (S) (C)까지 포함하고 밝게 강조 가장자리 ()와 직경 구형 물체 4-6 μm의의 빛나는 사과 녹색의 FITC의 형광. Giardia의 cysts (D - F). 난형의 개체에 둥근 8의 빛나는 사과 녹색의 FITC 형광 - 5에 의한 길이 18 μm의 - 포 스카이 블루 DAPI의 핵 (E)까지 포함하고 밝게 강조 가장자리 (D)와 등 하나 이상의 뚜렷한 내부 구조와 폭 15 μm의 핵 등 (N), 중간 몸 (M) 및 또는 axonemes () (F). 흰색 화살표, 화려한 사과 녹색 형광 염색법의 Cryptosporidium의 oocysts 및 Giardia cysts walls, 흰 화살촉, DAPI 긍정적인 핵. 샘플 1000X 배율 하에서 관찰했다.

Discussion

접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration은 Cryptosporidium의 oocysts와 물에서 Giardia의 cysts의 초기 농도에 대한 대안과 효과적인 기술입니다. 중공 섬유 ultrafiltration은 기존의 필터보다 저렴합니다. 그것이 다른 수상 매트릭스의 다양한 Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts을 집중하는 능력을 가지고 있기 때문에 그것은 EPA 방법 1623에 사용되는 현재의 여과 기술에 대한 유용한 대안입니다. 대부분의 다른 여과 방식과 마찬가지로 중공 섬유 ultrafiltration은 매우 흐린 샘플과 오염하는 경향이있다. 높은 수압에 필터가 오염으로부터 초래 하리라는 않으므로 그것은 여과 실행하는 동안 압력을 모니터링하는 것이 좋습니다. Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts 이외에 중공 섬유 ultrafiltration은 박테리아와 바이러스 1-3,5,8을 집중시킬 것으로 표시되었습니다. 중공 섬유 ultrafiltration O이 방법에 utlined은 하나의 샘플에서 여러 생물을 집중하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 200 및 250 ML 사이에 최종 볼륨을 취득하면 (OO) 낭종의 손실을 초래할 수도 여분 원심 분리 단계 있으므로 농도 절차에서 중요한 마지막 단계, (단계 2.2) 피할 수있다는 것을 주목할 것입니다. retentate 병으로 모든 oocysts 또는 cysts를 강제로 충분한 액체 부피 없을 것이다 때문에 그러나 병의 볼륨이 너무 낮게 떨어뜨 수 있도록하는 것은 recoveries에 불리한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 그것은 200 및 250 ML 사이에 최종 볼륨을 유지하는 것이 좋습니다.

열 분해는 방법 1623의 산성 분해 단계에 대한 대안입니다. 이 대안이 단계는 Cryptosporidium oocyst 복구를 개선하고 하천이나 시약 물 9 중 격리 때 메서드 편차를 줄이기 위해 표시되었습니다. 산성 및 열 분해 방법 나란히 비교 시연 그 dissocia에 열을 사용소리지르는 immunomagnetic 구슬의 생물은 CryptosporidiumGiardia 모두 높은 뜻 recoveries을 생산했다. 또한, CryptosporidiumGiardia recoveries의 정밀도 산성 분리 구에 비해 열 분해로 처리된 시료에서 더했습니다.

농도 단계로 HFUF의 설립은 여러 유기체를 집중하는 능력을 제공함으로써 더 많은 유연성을 허용합니다. 또한 그것은 현재의 방법 1,623 여과 옵션에 대한 저렴한 대안입니다.

Disclosures

미국 환경 보호국은 지하수 및 먹는물의 기술 지원 센터의 사무소와 공동 연구 및 개발에 자사의 오피스를 통해 여기에서 설명한 연구 자금. 모든 작품은 미국 EPA, 신시내티, 오하이오에서 현장에서 지원되었다. 이 문서에서 설명하는 정보가 쏘 환경 및 인프라, INC에 계약 하에서 미국 환경 보호청 (계약 EP-C-06-031)에 의해 전적으로 혹은 부분적으로 재정 지원되었지만, 그것은 필연적으로의 전망을 반영하지 않습니다 대행사없이 공식적인 승인은 그렇게 유추 해서도 안됩니다. 이것은 기관 평가를 받게 및 게시를 위해 승인되었습니다.

Acknowledgments

우리는 그의 기술 지원이 원고와 더그 해밀턴의 비판적 검토를 위해 앤은 그림과 마이클 짐머만 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters Dial Medical REXEED25S/R
I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent Cole-Parmer EW-06408-73
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-24
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-15
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-36
I/P Precision Brushless Drive Cole-Parmer EW-77410-10
I/P Easy Load Pump Head Cole-Parmer EW-77601-10
Black HDPE Tee, 1/4"x 3/8" x 3/8" US Plastics 62064
Masterflex T-connector L/S 15-25 Cole-Parmer EG-30613-12
Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle Cole-Parmer EW-06257-10
10 ml pipettes Fisher Scientific 13-678-11C
Nalgene filling/venting cap for 1/4" tubing, 53B Cole-Parmer EW-06258-10
Pressure gauge Cole-Parmer A-680-46-10
Straight coupling, NPT(F), 1/4" Cole-Parmer EW-06469-18
NPT branch tee, natural pp Cole-Parmer A-30610-75
Pinch clamps, 1/2" Cole-Parmer EW-06833-00
Custom fit DIN adapters Molded Products Corp MPC-855NS.250
Ring stand Fisher Scientific 14-670B
Ring stand clamps Fisher Scientific 05-769-6Q
Keck ramp clamp, 14mm Cole-Parmer EW-06835-10
Sodium polyphosphate Sigma-Aldrich 305553
Sodium thiosulfate pentahydrate Sigma-Aldrich 72050
Antifoam Y-30 emulsion Sigma-Aldrich A5758
Tween-80 Sigma-Aldrich P1754
10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer VWR international IR314-0025
Centrifuge bottle rack Fisher Scientific 05-663-103
250 ml conical centrifuge tubes Corning 430776
Disposable funnel Cole-Parmer U-6122-10
Wash bottle Cole-Parmer U-06252-40
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X-15R
Swinging bucket rotor Beckman Coulter Inc. ARIES SX4750
Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes Beckman Coulter Inc. 349849
200 μl large bore pipette tips Fisher Scientific 02-707-134
VacuShield Filter Gelman 629-4402
5 ml pipettes Fisher Scientific 13-678-11D
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit IDEXX 73002
50 ml conical centrifuge tubes Falcon BD 352098
Dynal L10 flat sided tubes IDEXX 74003
Timer VWR international 23609-202
Dynal MPC-6 magnet IDEXX 12002D
1 ml pipettes VWR international 53283-700
1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
1000 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P1000/DF1000ST
100 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P100/DF100ST
9 inch Pasteur pipettes VWR international 14672-412
Dynal MPC-S magnet IDEXX 12020D
Vortex VWR international 14216-188
Dynabeads rotator mixer IDEXX 94701
Heat block Fisher Scientific 11-718-2
Lab Armor Beads Lab Armor 42370-750
Digital thermometer Fisher Scientific 15-077-60
Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) Sigma-Aldrich P4417
Single Spot slides IDEXX 30201
Cover glass Corning 287018
EasyStain direct kit BTF -
10 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P10 & DF10ST
4',6'-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Clear nail polish Fisher Scientific S30697
Methanol Fisher Scientific L6815
Kimwipes Kimberly Clark 34155
Incubator Boekel Scientific 133000
slide warmer Fisher Scientific 11-474-521
Immersion oil, Type A ND= 1.515 Nikon Instruments MXA20234
Nikon 90i microscope with DIC capabilities Nikon Instruments MBA 77000
Plan APO 100X oil objective Nikon Instruments MRD01901
Plan Achro 20X Nikon Instruments MRL00202
FITC filter Nikon Instruments 96302
DAPI filter Nikon Instruments 96301
X-cite fluorescence illuminator Nikon Instruments 87540
Lens paper Nikon Instruments 76997
Biohazard disposable bag Fisher Scientific 01-829D
Biohazard sharps container Fisher Scientific 14-827-117
3 % hydrogen peroxide VWR international BDH3540-2
Bleach Fisher Scientific 1952030
Wypall Kimberly Clark 34790

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References

  1. DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952 (2002).
  2. Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).
  3. Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).
  4. Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623. J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).
  5. Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus. J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).
  6. Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples. J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).
  7. Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).
  8. Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from. 176, 38-45 (2011).
  9. Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters. J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).
  10. Simmons, O. D. 3rd, Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W. 3rd, Francy, D. S. Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).
  11. Sobsey, M. D., Glass, J. S. Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods. Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).
  12. USEPA. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. Office of Water. 815-R-05-002, EPA. (2005).
  13. Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. 3rd Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water. J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).
  14. Zuckerman, U., Tzipori, S. Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices. J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).

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