İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üç Boyutlu Model İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında

Medicine
 

Summary

Biz nöroendokrin kanser hücre hatlarını kullanarak 3D çok hücreli sferoidler büyümek için basit bir agaroz bindirme platformu sunmak. Bu yöntem, endokrin tümör hücreleri üzerindeki terapötik ilaçların etkisini araştırmak için çok uygun bir yol sağlar. Bu da bize kanser tedavisi için insan nöroendokrin tümör sferoidler kurulmasına yardımcı olabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy. J. Vis. Exp. (66), e4218, doi:10.3791/4218 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nöroendokrin tümörler (NET'ler) yılda 100, 000 kişi başına iki bir insidans, nadir görülen tümörlerdir ve hepsi insan tümörlerinin% 0.5 'sini oluşturur. 1 lokalize hastalığı ile başvuran hastaların azınlık için ameliyat dışında, orada sistemik terapiye çok az veya hiç sağkalım avantajı. Bu nedenle, daha iyi NET'ler biyolojisinin anlaşılmasında, özellikle de nonresectable veya metastatik nöroendokrin tümörü olan hastalar için yeni tedavi hedefleri tanımlamak için büyük bir ihtiyaç vardır. 3D hücre kültürü vivo tümör dokusu organizasyon ve mikroçevresindeki modellemelerinde alaka nedeniyle ilaç tarama için popüler bir yöntem haline gelmektedir. 2,3 3D çok hücreli sferoidler doğrudan 2D geçmeden daha zamanında ve daha az pahalı şekilde değerli bilgiler sağlayabilir hayvan hücre kültür deneylerinde (fare) modelleri.

NET pat için yeni ilaçlar keşfi kolaylaştırmak içinients, insan NET hücre dizileri kullanılarak in vitro 3D modeli çokhücreli sferoidler bir geliştirmişlerdir. NET hücre dışı bir yapışkan agaroz-kaplı 24-kuyulu plakalı içinde kaplandı ve sonra kaplama 16-24 saat boyunca çok yavaş bir ajitasyon ile fizyolojik koşullar (% 5 CO2, 37 ° C) altında enkübe edilmiştir. Hücreler 3. veya 4. gün başlayan ve çok hücreli sferoidler oluştururlar. Sferoidler ilaç tedavileri başlatılır ve bu noktada 6. gün, daha küresel hale gelir. NET sferoidler üzerinde ilaç tedavilerinin etkinliği bir faz-kontrast ışık mikroskobu ile parçacıklarının morfolojisi, şekil ve boyutuna göre izlenir. Parçacıklarının büyüklüğü aktif bir kontur algoritmasına göre geliştirilmiş özel bir MATLAB programı kullanılarak otomatik olarak tahmin edilmektedir. Ayrıca, standart histolojik ve immünohistokimyasal tekniklerin kullanımına izin veren, bu 3D sferoidler üzerine HistoGel gömme işlemek için basit bir yöntem gösterilmektedir.

Protocol

1. % 1 agaroz-kaplı 24-kuyulu plakanın Hazırlanması

  1. Agaroz sterilize etmek için 250-500 ml şişe ve otoklavda 100 ml deiyonize su ile 1 gr agaroz (RPI, A20090-500) ekle (121 ° C, 15 psi, otoklav makinede 15 dk). Bir 70 ° C su banyosuna sterilize agaroz ile şişe aktarın. Agaroz bununla ilgili bir saat sürer 70 ° C'ye kadar soğutuldu, ne zaman döküldü üzere hazırdır. Her zaman agaroz steril tutmak için emin olun.
  2. 24-iyi düz alt plakalar (Falcon, 353.047) elde edilir; plakalar bir faz-kontrast mikroskop altında yansıma olabilir eğer 24 sıra düz alt levhaları her türlü çalışır.
  3. Biyogüvenlik kabini ve de eşit kapak yapmak için de etrafında girdap agaroz bir Eppendorf Repeater pipet ile her kuyuya agaroz 200 ul dağıtın. Agaroz 200 ul sferoidler tutarlıdır yuvarlak şekillerde oluşturacak şekilde, bir içbükey yüzeyi oluşturmak üzere uygundur. Az 200 ul agaroz olmayabilirde tamamen kapsayacak, ancak 200'den fazla ul agaroz içbükey yüzeyi ve üzerinde yetiştirilen sferoidler kuramazlar küresel şekillere olmayabilir.
  4. Agaroz-kaplı 24-kuyucuklu plaklar yaklaşık 10 dakika içinde kullanılmak üzere hazırdır. (İsteğe bağlı) önceden tohum hücrelerinin kültür ortamı ile agaroz dengelemek için orta 100 ul ekleyin.
  5. Alternatif olarak, agaroz tamamen katılaşmış sonra, her kuyuya 100 ul besi ekleyin ve steril koruyucu bant (Nunc, 236.366) ile tabak kapatın. Bu plakalar bir haftaya kadar 4 ° C'de saklanabilir.

2. Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması

  1. Tüm deneyler bir biyogüvenlik kabini içinde standart aseptik teknikler kullanılarak yapılır ve belirtilmediği sürece, tüm kültürlerin, havada% 5 CO 2 ile 37 ° C nemli inkübatör yetiştirilmektedir.
  2. İnsan pankreas NET BON-1 hücreleri% 10 fetal bovin serumu (FBS, Invitrogen ile DMEM/F12 (Invitrogen, 10.565) içinde tutulur100 mm 16.000-044) orta x 20 mm steril doku kültürü çanak (Corning, 430167).
  3. Tek tabakalı BON-1 hücreleri% 70-80 konfluent ulaştığında, orta kaldırılır. 37 hücreleri, 5 dakika inkübasyon ile 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12.604) eklenerek ° C ile iki kez PBS ile yıkandı, ve bulaşık uzaklaştırıldı edilir TrypLE tripsin benzer, ancak 15 stabildir - 30 ° C de 4 ° C. Tüm hücreler çanak ayrılmış emin olmak için mikroskop altında kontrol edin.
  4. Tripsinize hücrelere 9 ml besiyeri ekleyin ve bir daha tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için birkaç kez aşağı hücrelerin Pipeti ve bir pipet kullanın.
  5. Hücrelerin filtre 70-um hücre süzgecinden (Fisher, 22.363.548) kullanın.
  6. Hücreleri toplayın ve Guava PCA-96 Base System (Millipore) kullanarak bir hücre sayımı yapmak.
  7. % 10 FBS büyüme medyumu ile fenol-free DMEM/F12 ml başına 5.000 hücre, bir süspansiyon hazırlamak.

3. Sfero Kültür

  1. Tek Overlay 200 ulHücre agaroz-kaplı 24-iyi levhaya süspansiyonlar ve buharlaştırma önlemek için steril sızdırmaz bantla 24-kuyucuklu plaklar içinde sızdırmazlık.

Not: - kaplanacaktır hücrelerin sayısı gün 6 parçacıklarının boyutuna göre ampirik olarak tespit edilmelidir; parçacıklarının 300-400 mikron çapında ilaç tedavisine başlamak için ideal bir boyutu olacaktır; 1000 BON-1 ve H727 hücrelerinin levhalara edilir.

- 3D hücrelerin canlılığı hakkında günlük 10 (veri lığa, gösterilmemiştir) düşüş başlarsa çünkü 6 gün sonra ilaç tedavileri başlayan önermiyoruz.

  1. Havada% 5 CO2 içeren bir 37 ° C'de bir gece boyunca nemli bir inkübatörde az 40 rpm'lik bir karıştırma çok yavaş bir çalkalamalı BON-1 hücreleri ile birlikte yukarıda agaroz-kaplı 24-kuyucuklu plaklar yerleştirin. Sonra kültürleri büyüyen tutmak için istikrarlı bir platform için bu plakaları taşıyın.
  2. Yukarıda plakanın her oyuğa 200 ul büyüme medyumu eklemes 3 günde. Sferoidler Rahatsız etmeyin. Iyi tarafına pipet dokunmadan ve kuyunun içine orta akış aşağı vererek her kuyunun duvarı boyunca orta eklemeyi deneyin.
  3. Bir mikroskop altında 24-kuyucuklu plaklar içinde steoid oluşumu izler.

4. İlaç Tedavisi

  1. Sferoidler gün 6 çapı 300-400 mikron çapında ulaştığınızda, 3D sferoidler ilaçlarla tedavi edilir. Bu ilaç tedavisi için günlük 0 olarak ifade edilir.
  2. Günlük 6, plakanın her ortam yaklaşık 400 ul içerir. 8 için yeterli çoğaltır olan bir 15 ml konik bir tüp içinde 5 ml büyüme medyumu içinde ilacı stok yapılır ilaç tedavileri tedavileri için her bir doz, her sıra, 3x seri seyreltiler in 1x son konsantrasyonda olduğundan emin olmak için.
  3. 24-kuyulu plakanın her bir sıradaki sferoidler araç, dozu 1, 2, 3, 4 ve 5 olarak sınıflandırılır. 4 (bakınız bir 24-kuyucuklu plak üzerinde tedaviler, her doz için çoğaltır vardır
  4. 4 az 5 dakika boyunca 800 rpm'de 24-iyi plaka aşağı spin ° sızdırmazlık bandı üzerindeki tüm terlemeyi iyi gider emin olmak için C. 3D parçacıklarının yüzer özelliği nedeniyle, her bir yanı içerisinde orta parçacıklarının rahatsız etmeyecek kaldırılır.
  5. Dikkatli bir şekilde, her sıra ile duvarı boyunca uygun kuyulara, her doz yukarıda hazırlanmış tedavilerin 200 ul ilave edin.
  6. Sızdırmazlık bandı ile 24-iyi yüzeyleri ve 37 kültürler inkübe ° C hava içinde% 5 CO ile nemlendirilmelidir inkübatör 2.
  7. Gerekirse, 72-96 saat sonra tedavi dozu ile ilgili olarak, her sıra sferoidler çekilmek.

5.. Monitör 3D Sfero Kültürler

  1. T Her kuyu başında ilaç tedavileri sonrasında her seçilen zaman noktası (0, 24, 48, 72 saat) olarak, sferoidlero 24-iyi plaka 5x objektif kullanarak Zeiss Axiovert 200/M-based faz-kontrast mikroskobu ile görüntülenmesi işlemidir.

Not: Görüntüler mikron ve piksel arasında bir kalibre ölçekleme ile herhangi bir ışık mikroskobu alınabilir. Sferoidler hızlı bir şekilde 10x hedefi ile görüntüleme alanında büyümek çünkü 5x hedefi idealdir.

  1. Sfero analizi ile ham görüntüleri Zeiss AxioVision 4.8.2 Yazılımı kullanarak elle yapılabilir.
  2. Alternatif olarak, geliştirilmiş özel bir MATLAB programı otomatik / yarı-otomatik parçacıklarının boyutunu tahmin etmek için kullanılır. Otomatik program doğru verilen bir görüntüde sfero kontur bulmak ve otomatik olarak büyük (L) ve ikincil (W) eksenleri ölçmek için aktif kontur algoritması 4 uygular. Aynı algoritmasının bir yarı-otomatik versiyonu kullanıcılar kuvvetli dışlayıcı mevcut olduğunda programına başlatmak için olanak sağlar. Tüm görüntüleri TIFF veya JPEG dosya formatları olarak ihraç gerekirprogram tarafından okunacak ham görüntüleri. Sfero hacmi 0,5 x L x W 2 olarak tahmin edilmektedir.

6. NET 3D parçacıklarının HistoGel gömme

  1. 10-24 sferoidler, 2 saat süreyle% 10 formalin içinde çözülmüştür, iki kez PBS ile yıkandı, 24-kuyucuklu plaklar alınan% 50 ile yıkanır ve 15 dakika süreyle% 70 etanol iki kez, sırası ile, ve HistoGel gömme için hazırdır. Alternatif olarak, birkaç ay süreyle 4 ° C'de% 70 etanol içinde tutulabilir.
  2. Soğuk HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) bir tüp su dolu bir kabı konur. Kabı 1 dakika süreyle bir mikrodalga fırın içerisinde ısıtılması ve jel tamamen sıvılaştırılmış kadar, daha sonra her zaman aynı su dolu beher içinde tutulur.
  3. Yukarıdaki% 70 etanol içinde sferoidler bir kürdan kullanarak bir biyopsi cryomold (Doku-Tek, Sakura Finetek, 4565) aktarılır. Tüm sferoidler transfer olduğundan emin olun. Sferoidler biyo dibine batırmak için bir dakika bekletinpsy cryomold. Kimwipes ile biyopsi cryomold içinde sıvı kurtulmak ve bu arada, çok nazikçe atılabilir plastik Pasteur pipeti kullanarak biyopsi cryomold altındaki merkezine sferoidler itmeye çalışın. Bu aşama, bir mikroskop altında yapılabilir daha kolay olabilir.
  4. Isıtılmış HistoGel ince bir tabaka biyopsi cryomold altındaki sferoidler stabilize etmek için biyopsi cryomold ilave edilir, bu arada, kürdan çok yavaş bir şekilde biyopsi cryomold altındaki merkezinde sferoidler tutmak için kullanılır. Biyopsi cryomold altındaki sferoidler istikrar için yeterli çok HistoGel ekleyebilir ancak etmeyin.
  5. Sferoidler / HistoGel oda sıcaklığında veya HistoGel katılaşmış dek 1-2 dakika bekletin. Sonra ısıtılmış HistoGel ile biyopsi cryomold geri kalanını doldurun.
  6. Yaklaşık 10 dakika için oda sıcaklığında katılaşmaya izin verir.
  7. Hemen önce biyopsi cryomold, lea gelen sferoidler / HistoGel bloğu dışarı haşhaş içinbozulmadan sferoidler / HistoGel blok yuvalarından yardımcı 1 dakika, 4 ° C 'de bir ettik. Sferoidler / HistoGel blok sonra Bio-saran bir parça (Surgipath, 01.090) sarılmış ve bir doku ve biyopsi kaset (Fisher Scientific, 15-182-701D) konur. Doku ve biyopsi kaset% 70 etanol ile bir kap içinde saklanır. Daha sonra parafin gömme için rutin doku işleme prosedürleri takip edilmektedir. 5
  8. Parafin blok 3-mikron kalınlığında tabaka slaytlara kesitli olabilir. Slaytlar histolojik değişikliklerini belirlemek için hematoksilin ve Eozin ile boyanmış edilebilir ve ayrıca immünohistokimyasal boyama için de kullanılabilir.

7. Temsilcisi Sonuçlar

İnsan pankreas nöroendokrin tümör hücre hatları BON-1 (Kjell oberg, Uppsala Üniversitesi, İsveç tarafından Verto Enstitüsü sağlanan), QGP-1 (Japon Sağlık Bilimleri Vakfı, Osaka, Japonya), ve insan akciğer nöroendokrin tümör hücre hattı H727 (ATCC) idi Bir agaros üzerinde yetiştirilene-kaplı 24-kuyulu plakalı. Şekil 1 'de görüldüğü gibi, üç hücre çizgileri, farklı morfolojisi göstermektedir. BON-1 ve H727 hücreleri 3D sferoidler oluşmuştur. Mikroskop altında, H727 hücreleri BON-1 hücrelerden daha sıkı ve daha kompakt sferoidler gösterdi. Biz, H727 hücreleri hücre-hücre yapışması için artan bir kapasiteye sahip ve bir sonuç olarak daha sıkı bir birleşme oluştururlar hipotez. QGP-1 hücreleri sferoidler olarak kabul edilmemekte, büyük üzüm benzeri gözenekli kitleler, göstermektedir. Son yıllarda pankreas nöroendokrin tümör araştırma yükselen ilgi nedeniyle, BON-1 hücreleri rakamlar geri kalanı için kullanılır. Agaroz kaplı 24-iyi plaka üzerinde BON-1 hücreleri tohumlama sonra, çok hücreli sferoidler oluşumu genellikle 3. veya 4. gün ile oluşur sferoidler 6. gün yuvarlak olurlar. Besin ve oksijen sınırlaması nedeniyle, parçacıklarının yoğun çekirdekli hücreler günde 10 civarında ve günde 17 ile ölmeye başlar, sferoidler nedeniyle büyük olması ya da öylesine dağılmaya başlayabilirBana durumlarda nekrotik çekirdek ejeksiyon. Sferoidler genellikle çapı 1.000 mikron kadar büyüyebilir. Şekil 2 BON-1 3D parçacıklarının oluşumu, büyüme ve dağılma bölümlerini gösterir.

Sferoidler 300-400 mikron çapında ve hücreler yüksek canlılığı (lığa) muhafaza olduğumuzda İlaç tedavileri başlandı. Gün 6 3D sferoidler ilaç tedavileri için başlangıç ​​noktası olarak seçilmiştir. Bu histon deasetilaz inhibitörleri NET hücreleri üzerinde antiproliferatif ve proapoptotik etkiler göstermiştir olduğu rapor edilmiştir. 6 We A (TSA) 3D NET sferoidler üzerine ilaç tedavileri etkisini göstermek için bir örnek olarak kullanılabilir. Şekil 3A gösterir histon-deasetilaz inhibitörü-trichostatin tercih TSA. Şekil 3B, tedavi etmeye 3D parçacıklarının morfolojisi TSA (Sigma, T8552) tedavisi üzerine 3D parçacıklarının hacmi gösterir. Her bir steoid boyutu, bir cus tarafından otomatik olarak tahmin edildiMATLAB bilgisayar programı tom-geliştirdi. 4 A elle çizim adım, verilen bir resimde Kenara yakın olan sferoidler, edinmelerine yardımcı eklendi. En az 8 sferoidler her bir zaman noktasında TSA tedavilerin doz başına ölçüldü. Her 3D sfero hacmi 0.5 x Uzunluk x Genişlik 2 olarak hesaplandı. Gibi taşıt göreli Şekil 3A ve 3B, görüldüğü gibi, şekillerde gösterildiği TSA her doz BON-1 3D parçacıklarının büyüme inhibisyonu bir dereceye göstermiştir. Bunların arasında, 125 nM ve TCD ile 250 nM arasında konsantrasyonları kuvvetli 3D sferoidler büyümesini bastırılmış ve 96-saatlik bir zaman noktasında hücre ölümüne yol açmıştır.

NET 3D parçacıklarının histoloji anlamak için, bir H & E ve immunohistokimyasal (İHK) boyama 17 gün kültüre edildi 3D sferoidler yapıldı. Şekil 4A önemli olan, HistoGel gömme için 3D sferoidler işlemek için bir yöntem gösterilmektedir 3D spher ait parafin gömme için adım kortikostereoidlerle. Şekil 4B H & E boyama, bölünmüş kaspaz-3 (apoptotik hücreleri için bir belirteç) ve Ki-67 immünohistokimyasal (hücreler prolifere için bir belirteç) 3D sferoidler üzerindeki antikorlar, 17 gün boyunca kültüre edilmiş gösterir . 3D sferoidler çekirdek içinde hücreleri çoğunlukla nekrotik / apoptotik ve dış katman etkin bir hücre proliferasyon edilir.

Şekil 1
Şekil 1.. NET 3D parçacıklarının morfolojisi. Üç insan tümör hücre çizgileri nöroendokrin gelen 3D sferoidler agaroz-kaplı 24 oyuklu plakalar üzerinde oluşturulmaktadır. 1000 BON-1, H727 ve QGP-1 hücreleri agaroz-kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine ekildi ve protokolü de gösterildiği gibi, normal bir fizyolojik durumların içinde büyütülmüştür. Bu 10 gün kültüre edildi QGP-1 için BON-1 ve H727 veya hücre agrega, 3D parçacıklarının görüntülerdir.

18/4218fig2.jpg "alt =" Şekil 2 "/>
Şekil 2. BON-1 3D parçacıklarının Büyüme Takibi BON-1 3D parçacıklarının büyüme izleme:. Oluşumu, büyüme ve 3D parçacıklarının parçalanması. Protokolü ayrıntılı olarak, 1000 BON-1 hücreleri agaroz-kaplı 24-iyi plaka üzerine kaplanır. Hücreler gecede fizyolojik bir durum bir çalkalamalı% 10 FBS ile standart bir DMEM/F12 ortamda üretilir, daha sonra istikrarlı bir platform üzerinde taşındı ve aynı şartlarda yetiştirilir. 3D hücrelerinin büyümesini izleme kaplama sonraki ilk saat boyunca 5 görüntüleme hücreler her saat takiben, ve daha sonra bir Zeiss Axiovert ile birlikte, her 1-3 günde bir 5x amacı kullanılarak faz kontrast mikroskobu 200/M-based edildi. İlk kitleler halinde toplu hücreler, sonra çok hücreli agrega, küçük sferoidler, büyük sferoidler ve sonunda sferoidler dağılacağı oluşturur.

Şekil 3
Şekil 3. BON-1 TSA Tedavi3D sferoidler. (A) TSA tedavisi üzerine 3D parçacıklarının Görüntüler. Tedavi grubu: V - Araç (0.0025% DMSO); D1 doz 1 (15.625 nM TSA), D2-2 doz (31,25 nM TSA), D3: doz 3 (62.5 nM TSA), D4: doz 4 (125 nM TSA ); D5: doz 5 (250 nM TSA). Tedavi Süresi: 0 H - Zaman noktaya günde 6 3D sferoidler başlayan tedaviler olduğunu, tedavi başladıktan sonra 24 H 48 H 72 H ve 96 H zaman noktaları vardır. 3D sferoidler her noktada daha önce olduğu gibi de görüntülendi. TSA tedavisi üzerine 3D parçacıklarının (B) Büyüme. (A) 'in 3D parçacıklarının majör (L) ve hafif (B) ekseni tedavisi, her bir zaman noktasında (0, 24, 48, 72 ve 96 saat) olarak Matlab programı tarafından otomatik olarak tahmin edildi. 3D parçacıklarının hacmi 0,5 x L x W 2 olarak tahmin edilmiştir. Grafikte steoid hacmi 8 ortalama çoğaltır olduğu ve bir hata çubuğu 8 çoğaltır baz hesaplandı.

Tablo 1
Tablo 1.Bir 24-kuyucuklu plak üzerinde ilaç tedavileri düzeni

Şekil 4A
Şekil 4A. HistoGel gömülmesi için 3D sferoidler Süreç bir Yöntemi İllüstrasyon. HistoGel gömme ve 3D sferoidler (A) HistoGel gömme için 3D sferoidler işlemek için bir yöntem genel bir bakış, immünohistokimyasal için 3D sferoidler işlemek için bir yöntem. 3D sferoidler biyopsi cryomold aynı düzeyde, daha sonra HistoGel / sferoidler blok Bio-atkıları mavi sarılmış ve parafine gömme için sarı biyopsi kaset aktarıldı olmak için bir HistoGel içinde muhafaza edildi.

Şekil 4B
Şekil 4B. H & E Boyama ve gün-17 3D parçacıklarının immünohistokimyasal boyanma. (B) H & E boyama, immünhistokimyasal Ki-67 boyanma ve 17 günlük 3D parçacıklarının parçalanabilen Kaspaz-3. Paraffin gömülü kesitli slaytlar deparaffinized olduğunu ve antijen alımı CCI (Hücre Kondisyon Çözüm, Verana Medical System, # 711-065-152) kullanılarak yapıldı. Tavşan poliklonal Ki-67 antikoru (Abcam. # Ab833) ve parçalanabilen kaspaz 3 antikoru (Celi Technology Sinyalleşme, # 9661), oda sıcaklığında 1 saat boyunca, sırasıyla, 1:75 ve 1:200 bir konsantrasyonda uygulanmıştır. Anti-tavşan sekonder antikoru (Jackson Immunolab, # 711-065-152) kromojenik saptama kiti DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124), ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1:500 uygulanmıştır. Slaytlar Hematoksilin ve susuz ile zıt ve Ksilen gelen coverslipping önce temizlendi.

Discussion

Biz, agaroz-kaplı 24-kuyucuklu plaklar kullanılarak insan nöroendokrin tümör hücrelerinden 3D çokhücreli steoid oluşturulması için basit, güvenilir, tekrar üretilebilir ve metodu göstermektedir. Bu tekniğin bir başarı homojen bir boyut ve hücrelerin sayısı sabit itibaren günde 6 tarafından üniform şekle sahip tek bir steoid elde etmek yeteneğidir. Anahtar adım kaplama sonraki ilk saat boyunca 16-24 NET hücreleri ile plakasının yavaş ajitasyon olup. Bu yöntem de uygulanabilir yaygın insan göğüs kanseri hücre hattı MCF-7 insan kolon kanseri hücre hattı HT-29 insan küçük olmayan hücreli akciğer kanseri hücre hattı H1299 ve insan embriyonik böbrek hücre çizgisi HEK-293. Hepsi terapötik ilaç ekranı (veri gösterilmemiştir) için üniforma ve kompakt 3D sferoidler oluşabilir. Çeşitli yöntemler 3D sferoidler üretmek üzerine bildirilmesine rağmen, 7-10 yöntemi özel plakalar veya reaktifler gerektirmez burada rapor ve böylece basit ve düşük maliyetlidir. Bizim yayınlanmamış veriler demonstratmonolayer 2D hücrelere kıyasla agaroz yetişen NET 3D sferoidler, geometrik ve moleküler vivo NET xenograft tümör taklit eden e. Bu, diğer insan kanser hücresi hatlarında yapılmış 3D sferoidler için rapor edilmiştir ne benzeridir. 3D hücre kültürü modeli 11,12 sınırlama tamamen herhangi bir ilaç ya da terapötik tedavinin etkinliğini in vivo test yerini olmasıdır çünkü 3D sferoidler bu açıdan vivo tümör farklı olan, avasküler tümör gibidir. Bununla birlikte, bu yöntem bazı açılardan in vivo in vitro gelen NET terapötik ilaçların boşluğu ve değerlendirmelerin köprü yardımcı olacaktır.

Çok hücreli sferoidler üzerine immünofloresan boyaması büyüklüğü ve geometri yüzen 3D parçacıklarının ve konfokal mikroskop sınırlaması nedeniyle gerçekleştirmek çok zordur. Burada parafin için HistoGel gömme işlemek için bir yöntem göstermek3D parçacıklarının seri kesitli slaytlar, immünohistokimyasal izin, gömme. Bunun yanı sıra, bizim özel geliştirilen MATLAB programı doğru ve tekrarlanabilir, parçacıklarının boyutunu tahmin etkili ilaç etkinliğini izlemenize yardımcı olur, ve NET hastalar için ilaç geliştirme Yüksek verimli bir ekran dahil edilebilir.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz içtenlikle MATLAB programı ve New Jersey histopatoloji tesis ve mikroskopi tesisin Kanser Enstitüsü ile ona yardım için Dr Wenjin Chen teşekkür ederim. Biz de onların görüş ve önerileriniz için teşekkür değerlendirenler. Bu çalışma, Raymond ve Beverly Sackler Araştırma Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Media Gibco 10565-018
TrypLE Gibco 12604
24-well plates Falcon 353047
70 mM cell strainer Fisher Scientific 22363548
Sterile sealing tape Nunc 236366
Trichostatin A Sigma T8552
Orbital Shaker Fisher Scientific 11-402-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taal, B. G., Visser, O. Epidemiology of neuroendocrine tumours. Neuroendocrinology. 80, 3-7 (2004).
  2. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
  3. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protocol. 4, 309-324 (2009).
  4. Chan, T. F., Vese, L. A. Active contours without edges. IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).
  5. Olert, J., Wiedorn, K. H., Goldmann, T., Kühl, H., Mehraein, Y., Scherthan, H., Niketeghad, F., Vollmer, E., Müller, A. M., Müller-Navia, J. HOPE Fixation: A Novel Fixing Method and Paraffin-embedding Technique for Human Soft Tissues. Pathology-Research and Practice. 197, 823-826 (2001).
  6. Baradari, V., Huether, A., Höpfner, M., Schuppan, D., Scherübl, H. Antiproliferative and proapoptotic effects of histone deacetylase inhibitors on gastrointestinal neuroendocrine tumor cells. Endocr. Relat. Cancer. 13, 1237-1250 (2006).
  7. Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  8. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
  9. Ivascu, A., Kubbies, M. Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis. J. Biomol. Screen. 11, 922-932 (2006).
  10. Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. Dynamics of the Self-Assembly of Complex Cellular Aggregates on Micromolded Nonadhesive Hydrogels. Tissue Engineering. 13, 2087-2094 (2007).
  11. do Amaral, J. B., Rezende-Teixeira, P., Freitas, V. M., Machado-Santelli, G. M. MCF-7 cells as a three-dimensional model for the study of human breast cancer. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 1097-1107 (2011).
  12. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics