استخدام الخلايا الليفية الإنسان الأساسية لرصد نمط ظاهري الميتوكوندريا في مجال مرض باركنسون

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

الخلايا الليفية من المرضى تحمل طفرات في الجينات المسببة للمرض باركنسون يمثل الوصول إليها بسهولة

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Burbulla, L. F., Krüger, R. The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (68), e4228, doi:10.3791/4228 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

مرض باركنسون (PD) هو الثاني الأكثر شيوعا اضطراب الحركة ويصيب 1٪ من الناس فوق سن ال 60 1. لأن الشيخوخة هي عامل خطر الأهم من ذلك، سوف زيادة حالات PD خلال العقود القادمة 2. بجوار طي البروتين المرضية وضعف مسارات تدهور البروتين، وأشار في وظيفة الميتوكوندريا التعديلات والتشكل على النحو السمة المميزة مزيد من تنكس عصبي في PD 3-11.

بعد سنوات من البحث في الخلايا السرطانية الفئران والإنسان ونماذج في المختبر لتشريح المسارات الجزيئية بمرض باركنسونز، أصبح استخدام الخلايا الليفية الإنسان من المرضى وضوابط ملائمة كنماذج فيفو السابقين أداة بحث قيمة، إذا أخذت في الاعتبار المحاذير المحتملة. غير خلد، ونماذج خلية اصطناعية بدلا من ذلك، الخلايا الليفية الأولية من المرضى تحمل المرض الطفرات المرتبطة تعكس على ما يبدو الميزات الهامة المرضية ياو هذا المرض الإنسان.

نحن هنا تحدد الإجراء أخذ خزعات الجلد، الخلايا الليفية الإنسان وزراعة باستخدام بروتوكولات مفصلة لتقنيات المجهرية ضرورية لتحديد الظواهر الميتوكوندريا. واستخدمت هذه الميزات للتحقيق المختلفة المرتبطة PD ذات الصلة وظيفة الميتوكوندريا وديناميكية. فيفو السابقين، يمكن تحليل الميتوكوندريا من حيث وظيفتها، مورفولوجيا، colocalization مع الجسيمات الحالة (الميتوكوندريا المختلة وظيفيا والعضيات المهينة) وتدهور عبر مسار الليزوزومية . هذه الظواهر هي ذات أهمية كبيرة للتعرف على العلامات المبكرة للPD قد يسبق الأعراض السريرية للسيارات في ناقلات للأمراض الجينات البشرية. وبالتالي، يمكن الاستفادة من المقايسات المقدمة هنا كأدوات قيمة للتعرف على الميزات المرضية من تنكس عصبي ويساعد على تحديد استراتيجيات علاجية جديدة في PD.

Protocol

1. خزعة الجلد وزراعة الخلايا الليفية الإنسان

  1. خزعة الجلد يجب أن يؤخذ من قبل الطبيب من ذوي الخبرة. الإجراء يتم في ظروف معقمة ويتطلب تخدير موضعي. مواقع المعتادة المستخدمة في الخزعة هي الجانب الداخلي للذراع العلوي، الكتف أو أسفل الظهر.
  2. يمكنك أن تأخذ 4x4mm أو 6x6mm عينة خزعة لكمة من قبل قطر للحصول على ما يكفي من الأنسجة الليفية للزراعة الإنسان.
  3. قطع الجلد خزعة الى قطع صغيرة متساوية في ظل ظروف معقمة للفصل بينهما في قوارير T25 2-4. يجب أن تحتوي كل قارورة 2-3 قطع من البشرة. وسائل الإعلام والثقافة يحتوي على 15٪ FCS، 1.1٪ البيروفات الصوديوم و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسط.
  4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. الوقت المتوقع نشر حتى تنمو الخلايا الليفية 1 من العينة البشرة هي 1-2 أسابيع. إذا واجهت مشاكل النمو، يمكنك الاستفادة من نمو الخلايا الليفية كرة القدمالمنشئ (5-10 نانوغرام / مل FGF2) لتعزيز نمو الخلايا.
  5. حالما يتم التوصل إلى confluency خلية من 50-70٪ يمكن أن يجمد أي الخلايا الليفية الأولية الإنسان. حلول وقت حتى confluency 50-70٪، يختلف بين خطوط الخلايا. تجميد الخلايا الليفية في 90٪ FCS سلفوكسيد ثنائي ميثيل بالإضافة إلى 10٪ (DMSO).

2. إعداد الخلايا الليفية الإنسان لايف خلية المجهر التصوير

بشكل عام، يجب أن أجرى تجارب مع الخلايا الليفية الإنسان مع مقاطع أقل من 10 والشيخوخة المرتبطة التعديلات يمكن تغيير خصائص الخلايا بعد مقاطع متعددة. في حالة الشك، يمكن استخدام بيتا غالاكتوزيداز المقايسات لتقييم عمليات تحريض الشيخوخة في الخلايا المعنية. عموما، لا تستخدم الخلايا الليفية العمر (انظر أعلاه). وعلاوة على ذلك، لمقارنة عدة خطوط الخلايا، والعمل مع مرور نفس عدد كل سطر الخلية. ويوصى المرضى مقارنة مختلفة متجانسة وراثيا مقارنة ضوابط صحية. ومع ذلك، في بعض الأحيانيمكن للمرضى تحمل طفرات معينة تكون نادرة، وهذا يمكن أن يعني أن خزعات الجلد من مريض واحد فقط مع عدد خطوط مرور معينة والتحكم المختلفة ليتم تضمينها - هنا لا بد من ضمان مرور عدد من نفس شملت كل الخطوط. اذا تم التوصل الى confluency خلية من 50-70٪ ولكن لا توجد خطط لتجربة يجب أن يجمد الخلايا الليفية.

  1. في اليوم الأول من التجربة، وغسل الخلايا الليفية المرفقة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. ثم حرر لهم من أسفل القارورة باستخدام الخلايا المفرزة حل من الإنزيمات المحللة للبروتين الدناز (أي AccuMax).
  2. عد الخلايا الخاصة بك والبذور 50،000-70،000 خلايا في كل بئر من ساترة 4-غرفة (1.8 سم مساحة 2 في الثقافة أيضا). وفقا لذلك، لcoverglas 8-الدائرة، نصف عدد الخلايا أو أقل قليلا من المناسب (0.8 سم مساحة 2 في الثقافة أيضا). من المهم أن البذور بدلا عدد صغير من الخلايا لأداء حقيقية وحيدة الخلية التحليل. أي طلاء محددة للدوائر طحاجة ثانية.
  3. بعد 24-48 ساعة، يمكن إجراء التصوير الخلية الحية التجربة. تأكد من أن تم تجهيز الخلية الحية التصوير المجهر مع حاضنة الذي يتحكم في درجة الحرارة ومستويات CO 2. خلال الحصول على الصور، جو من 37 ° C ينبغي و 5٪ CO 2 الإبقاء.
  4. ينبغي أن يتم كل خلية حية التصوير القياس في ما لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة. في المجموع، ينبغي تصوير ما لا يقل عن 50 خلية في كل سطر الخلية. الخلية الحية التصوير التجارب وكذلك التحليلات خارج الشبكة يجب أن يتم في ظل ظروف أعمى لضمان جمع البيانات غير منحازة.

3. وظيفة الميتوكوندريا قياس في الخلايا الليفية الإنسان المعيشة

التقليدية لقياس وظيفة الميتوكوندريا عبر غشاء الميتوكوندريا المحتملة (MMP) التي تعتمد على الأصباغ، فلوري الفرز الخلية تنشيط (FACS) هو الأسلوب الأساسي. في حالة الخلايا الليفية الإنسان الخلوية autofluoreويلاحظ في كثير من الأحيان قد يسبب مسرح الحادث ونتائج إيجابية كاذبة من التداخل مع إشارة تلطيخ الفعلية. تألق ذاتي يصبح عادة أكثر وضوحا مع مرور أرقام أعلى الخلايا الليفية. لذلك، نحن نفضل لتقييم وظيفة الميتوكوندريا من الخلايا الليفية الإنسان يعيش خلية التصوير المجهري.

  1. 24-48 ساعة بعد الغرس واحتضان الخلايا الليفية في 50 نانومتر من MMP التي تعتمد على صبغ tetramethylrodamine اثيل استر (TMRE) في المتوسط ​​RPMI. يجب أن هذه الوسيلة RPMI تفتقر الحمراء الفينول وهذا يمكن أن يؤثر سلبا على جودة الصورة. وينبغي أن يضاف 1،6 ميكرومتر من تلطيخ هويشت لتصور نوى.
  2. احتضان الخلايا في حل تلطيخ المعدة محمية من الضوء لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  3. استبدال الحل مع تلطيخ المتوسطة RPMI (بدون أحمر الفينول). المضي قدما من دون خطوة الغسيل والخلايا الصورة على الفور. استخدام التكبير 63x ومتحد البؤر المجهري مجال تقنية المسح الضوئي ليزر (بدلا من استخدام المجهر مضانApotome تقنية) لتحديد طبقات واحدة من الخلايا. تطبيق 37 ° C و 5٪ CO 2 إلى الخلايا خلال عملية التصوير.
  4. عندما تصوير الخلايا الليفية، وإيلاء الاهتمام لأقصى وقت التعرض للضوء الفلورسنت تطبيق كما يمكن تلوين TMRE التبييض بسرعة. تحديد وقتك التعرض المناسب بين 200 و 300 مللي وعدم تجاوز هذا الفاصل الزمني. والحصول على الصور تحت إعدادات موحدة مهم جدا، باعتبارها واحدة لن تكون قادرة على إجراء مقارنات على أساس كثافة إذا كانت الإعدادات تختلف بين خطوط الخلايا.
  5. كما هو ابيض دائرة نصف قطرها محدد حول الخلايا المصورة من بعد التعرض للضوء، والحفاظ على الحقل التالي البصرية على نحو كاف حتى الآن من قسم photobleached.
  6. يتم تنفيذ دون اتصال باستخدام يماغيج تحليلات البرمجيات (وين Rasband؛ المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة الأمريكية).
  7. حدد الخلية اهتمامك باستخدام أداة التحديد.
  8. تحويل الصورة إلى 8 بت (صورة <نوع <8 بت).
  9. الحد من الضوضاء غير محددة بذ باستخدام "تمويه داخلي" وظيفة (عملية <الضوضاء <تمويه داخلي).
  10. اختيار "جداول البحث - النار" حالة (صورة <النار <جداول البحث).
  11. التبديل في وظيفة العتبة "أكثر / أقل" وظيفة وضبط عتبة (صورة <عتبة <ضبط).
  12. حدد "تحليل الجزيئات" الخيار، والتي سوف تعطيك القيمة المتوسطة لكل الجسيمات الرمادية الميتوكوندريا كشف (تحليل <تحليل الجزيئات). حفظ قائمة نتيجة معينة على أنها جداول البيانات إكسل.
  13. فتح ملف في برنامج Excel نتيجة وحساب متوسط ​​قيمة الرمادي متوسط ​​الهياكل الميتوكوندريا (المشار إليها باسم 'يعني' في القائمة نظرا نتيجة التفوق).
  14. لإنشاء مخطط السطح، اختيار المساعد "سطح 3D التفاعلية مؤامرة" في "3D" القسم المساعد. هنا، يمكنك ضبط المزيد من المؤامرة باستخدام خيارات عرض مختلفة. تغيير "الألوان الأصلية" إلى "LUT الطيف" يعطي شريط مقياس شدة لمؤامرة المناسبة.
  15. بدلا من ذلكلاستخدام TMRE لتحليل وظيفة الميتوكوندريا من الخلايا الليفية الإنسان عن طريق التصوير الخلية الحية، وهو مزيج من MMP مستقلة صبغة Mitotracker الخضراء FM وMitotracker MMP التي تعتمد على الصبغة يمكن استخدامها CM-H 2 XRos. مرة أخرى، ليعيش الإنسان الخلايا الليفية ويفضل الخلية المجهر والتصوير، ولكن بصفة عامة كما تم استخدام هذا البديل باستخدام تحليل FACS في نوع آخر من الخلايا 12. ينبغي أن تطبق عند استخدام هذا النهج البديلة لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا الليفية الإنسان، الخطوة 3-7 من قسم البروتوكول 5 "قياس mitochondrio-الليزوزومية colocalization في الكائنات الخلايا الليفية الإنسان". بذلك، يتم حساب تراكب الإشارات، وكلاهما من الميتوكوندريا إيجابية لMitotracker الخضراء FM وMitotracker CM-H XRos 2 و يدل على كمية من الميتوكوندريا وظيفية ونسبة لجميع الحاضرين الميتوكوندريا.

4. قياس الصرف الميتوكوندريا في الخلايا الليفية الإنسان المعيشة

  1. 24-48ساعة بعد البذر، وخلايا احتضان في 200 نانومتر الأخضر Mitotracker FM في المتوسط ​​RPMI (لا أحمر الفينول) محمية من الضوء لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. وينبغي أن تستخدم 1،6 ميكرومتر من تلطيخ هويشت لتسليط الضوء على النوى. Mitotracker الخضراء FM هو صبغة MMP المستقلة، التي بقع جميع الهياكل الميتوكوندريا الآن.
  2. يغسل بلطف خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  3. إضافة جديدة RPMI متوسطة (بدون أحمر الفينول) إلى الخلايا والخلايا الصورة على الفور. استخدام التكبير 63x ومتحد البؤر المجهري مجال تقنية المسح الضوئي ليزر (مضان المجهري باستخدام تقنية بدلا من Apotome) لتحديد طبقات واحدة من الخلايا.
  4. تؤخذ دون اتصال التحاليل عن طريق استخدام برمجيات يماغيج.
  5. حدد الخلية اهتمامك باستخدام أداة التحديد.
  6. تحويل الصورة إلى 8 بت (صورة <نوع <8 بت).
  7. الحد من الضوضاء غير محددة باستخدام "تمويه داخلي" وظيفة (عملية <الضوضاء <تمويه داخلي).
  8. استخدام فلتر التفاف لتسليط الضوء على mitochondrial الهياكل (عملية <مرشحات <لف).
  9. ضبط عتبة الباب حتى نسبة الإشارة إلى الضوضاء هو المناسب (صورة <عتبة <ضبط).
  10. باستخدام "تحليل الجزيئات" الخيار، يبدأ التعرف الآلي الهياكل الميتوكوندريا استنادا إلى حجم بكسل المختار (تحليل <تحليل الجزيئات). وتحسب بعد ذلك العديد من المعلمات مثل الميتوكوندريا المنطقة، المحيط، محاور صغرى وكبرى أو دائرية. يمكن تعيين هذه القياسات بشكل فردي (تحليل القياسات مجموعة <). حفظ قائمة نتيجة معينة على أنها جداول البيانات إكسل.
  11. فتح ملف في برنامج Excel نتيجة. مع استخدام مثل هذه المعايير، يمكن أن يتم تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا بها. ويشمل هذا التعريف للعامل الشكل مما يدل على درجة المتفرعة من شبكة الميتوكوندريا [الصيغة: (محيط 2) / (4 * PI () * منطقة)] وكذلك تحديد نسبة الارتفاع على طول الصيغة (الميتوكوندريا: الرئيسية محاور / محاور التعديلات).

5. قياس Mitochondrio-الليزوزومية Colocalization في الخلايا الليفية الإنسان المعيشة

  1. 24-48 ساعة بعد البذر، وخلايا احتضان في 200 نانومتر الأخضر Mitotracker FM و 100 نانومتر Lyostracker الأحمر DND-99 في المتوسط ​​RPMI (بدون أحمر الفينول) محمية من الضوء لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. 1،6 ميكرومتر يستخدم من تلطيخ هويشت لتسليط الضوء على النوى.
  2. استبدال المتوسطة المتوسطة مع RMPI الطازجة (بدون أحمر الفينول) التي تحتوي على 100 نانومتر الأحمر Lyostracker DND-99. هذه الصبغة أن تكون موجودة خلال الدورة التصوير بالكامل. لا يغسل الخلايا بعد فترة الحضانة. الصورة فورا الخلايا. استخدام التكبير 63x وتقنية مبائر (تقنية Apotome بدلا من) لتحديد طبقات واحدة من الخلايا.
  3. تؤخذ دون اتصال التحاليل عن طريق استخدام برمجيات يماغيج.
  4. فتح الصورتين منها كنت ترغب في تحليل الوضع من حيث colocalization.
  5. تحويل الصورة إلى 8 بت (صورة <نوع <8 بت). الحد من الضوضاء غير محددة باستخدام "تمويه داخلي" وظيفة في كل من الصور (عملية <الضوضاء <تمويه داخلي).
  6. اختيار البرنامج المساعد "JACoP" كأداة تحليل colocalization، والتي تعطيك القيم للقنوات المعنية وبحساب معامل بيرسون، ومعامل معامل تداخل Manders '(الإضافات <JACoP).

6. ممثل النتائج

ويمكن تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا الليفية الإنسان يعيش يعيش الخلية عبر تقنية التصوير. لالمقايسات الفنية، إشارة مضان TMRE يرتبط مع احتمال غشاء الميتوكوندريا (MMP). في ظل ظروف طبيعية MMP، ومضان TMRE أعلى بكثير (الشكل 1A، الصف العلوي) من الحالات المرضية تحت يتميز MMP انخفاض (الشكل 1A، الصف السفلي). يتم قياس كثافة مضان هذا عن طريق حساب متوسط ​​قيمة الرمادي يعني كل بنية الميتوكوندريا ( (الشكل 1A، الجانب الأيمن).

إلى جانب تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا الليفية الإنسان، يمكن استخدام المجهر التصوير الحية الخلية لتعريف المعلمات مختلفة من التشكل الميتوكوندريا. باستخدام Mitotracker وتصور الخضراء FM الهياكل الميتوكوندريا صبغة مستقلة عن كل منها MMP (الشكل 2). هذا مهم لضمان إدراج جميع الهياكل الميتوكوندريا موجودة في التحليلات. باستخدام البرمجيات يماغيج، ويتم تحليل مورفولوجية على أساس أرقام ثنائية، ويمكن تقييم المعلمات فقط مورفولوجيا الميتوكوندريا هنا (الشكل 2، "ثنائي"). ونشرت مؤخرا أمثلة لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا من حيث شكل عاملا وكذلك نسبة الارتفاع 6، 13. ميزة أخرى هامة التي يمكن قياسها في الخلايا الليفية الإنسان يعيش هو تدهور الهياكل الميتوكوندريا. ويمكن تقييم الخطوة الأولى في هذا التقدم من mitochondrio-الليزوزومية colocalization في حي الخلية المجهر التصوير. نتيجة مرضية شروط معينة في colocalization زيادة الميتوكوندريا مع الجسيمات الحالة (الشكل 3A). مرة أخرى، يتم استخدام Mitotracker الخضراء FM وصمة عار الهياكل الميتوكوندريا مستقلة عن MMP كل منهما. وبالإضافة إلى ذلك، وتلطيخ مع الأحمر Lysotracker DND-99 يسمح تصور هياكل الليزوزومية. فمن الأهمية بمكان أن الصبغة الحمراء Lysotracker موجودا أثناء عملية التصوير، والخطوات غسل تقليل إشارة إلى أن تصبح منخفضة جدا لرؤية. ويمثل إشارات واضحة من قبل Colocalization مضان الأصفر بسبب تداخل الأخضر (جرين Mitotracker FM) والأحمر (الأحمر Lysotracker DND-99) تلطيخ (الأسهم البيضاء، 3A الشكل) وتحددها حساب مجلس أوروبا بيرسونfficient (الشكل 3B).

بشكل عام، لخارج الشبكة مع برنامج يماغيج التحليلات، فإنه من المفيد أن تصور خلية واحدة لكل صورة، بحيث يمكن تجنب تعريف منطقة معينة من الفائدة (ROI).

الشكل 1
الشكل 1. قياس إشارة مضان TMRE يدل على احتمالية غشاء الميتوكوندريا (MMP) في الكائنات الحية الخلايا الليفية الإنسان من قبل خلية تقنية التصوير. (A) TMRE هو الفلورسنت MMP التي تعتمد على الصبغة، التي مضان كثافة يرتبط مع MMP. تم استخدام صبغة لصبغ هويشت نواة (الأزرق). في ظل ظروف طبيعية MMP (الصف العلوي)، ومضان TMRE هو أعلى بكثير مما كان في ظل ظروف مرضية تتميز MMP مخفضة (الصف السفلي). بالإضافة إلى ذلك يتم عرض كثافة مضانكما مؤامرة سطح كثافة. شريط مقياس يشير إلى 10 ميكرومتر. (B) التحليلات الإحصائية من الخلايا الليفية المثالي هو مبين في (A). في ظل ظروف مرضية، ويقاس على مضان TMRE انخفاض الميتوكوندريا بالمقارنة مع حالة MMP العادية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. قياس مورفولوجية الميتوكوندريا في الخلايا الليفية الإنسان يعيش يعيش خلية تقنية التصوير. يستخدم Mitotracker الخضراء FM (الأخضر) لتصور هياكل الميتوكوندريا، لأنه مستقل عن MMP. تم استخدام صبغة لصبغ هويشت نواة (الأزرق). باستخدام البرمجيات يماغيج، يمكن تحليل مورفولوجيا على الأرقام الثنائية. شريط مقياس يشير إلى 10 ميكرومتر. انقر هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

الشكل 3
الشكل 3. القياس من colocalization من الميتوكوندريا مع الجسيمات الحالة في الكائنات الحية الخلايا الليفية الإنسان من قبل خلية تقنية التصوير. (A) يستخدم Mitotracker الخضراء FM (الأخضر) إلى وصمة عار الهياكل الميتوكوندريا، Lyostracker الأحمر DND-99 (الحمراء) يتصور الهياكل الليزوزومية. تم استخدام صبغة لصبغ هويشت نواة (الأزرق). يشار colocalization ناجحة في ظل ظروف مرضية من إشارة الصفراء وذلك بسبب التداخل من الأحمر وLysotracker Mitotracker تلطيخ الأخضر (الأسهم البيضاء). شريط مقياس يشير إلى 10 ميكرومتر. (B) التحليلات الإحصائية من الخلايا الليفية المثالي هو مبين في (A). A درجة أعلى من النتائج colocalization mitochondrio-الليزوزومية في قيمة معامل بيرسون مرتفعة./ 4228/4228fig3large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخلايا الليفية الجلد المريض كنماذج فيفو السابقين تمثل أداة مهمة لوصف المرض المرتبطة عيوب وراثية. وبالإضافة إلى ذلك، والجلد المستمدة من الخلايا الليفية يمكن الحصول عليها بسهولة ويمكن توسيعها عند زراعة. ولذلك، الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها من المرضى تحمل PD-الطفرات الجينية المرتبطة بها هي الأفضل على استخدام خطوط الخلايا السرطانية حيث أنها تحتوي على ليس فقط المحلية الجينات المسببة للأمراض، ولكن الخلفية كلها الجيني للفرد المتضررة. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت أن الخلايا الليفية لتعكس ملامح مرضية هامة من ضعف الميتوكوندريا خلال تنكس عصبي. التجارب المبينة في هذا البروتوكول هي مفيدة بشكل خاص للدراسة الظواهر بما في ذلك وظيفة الميتوكوندريا، مورفولوجيا وكذلك تقييم colocalization من الميتوكوندريا مع الجسيمات الحالة عن طريق خلية حية تقنية التصوير. بذلك، بصمات الرئيسي للمرض، أي ضعف الميتوكوندريا واملهينة لاحقةأوجه هذه العضيات غير وظيفية، ويمكن تصور وتحليل صحيح 6 و 13. وظيفة الميتوكوندريا التعديلات ومورفولوجيا وغالبا ما تكون الخطوة الأولى لعلم الأمراض المرض. على سبيل المثال، زيادة تفتيت شبكة الميتوكوندريا يمكن أن يكون شرطا مسبقا لتعزيز عمليات autophagic وmitophagic 6،12. لذلك، قد colocalization من الميتوكوندريا مع الجسيمات الحالة تساعد على تقييم تدهور الميتوكوندريا (mitophagy) 6. ويمكن لنقص هذه colocalization فضلا عن تراكم الميتوكوندريا مع الجسيمات الحالة تعكس عيوب في مسار تدهور الليزوزومية ويجب أن يكون التصديق عليها من قبل تدفق autophagic تحوير 6. وفي هذا السياق، يماغيج البرمجيات يمثل أداة هامة لتوليد مجموعات البيانات المدققة من قبل وظائف غير منحازة نصف أوتوماتيكي تحليل.

خيار الإضافية التي تمتد استخدام الخلايا الليفية الإنسان إلى نماذج أكثر الأمراض ذات الصلة المحتملة هو generatأيون الخلايا المحفزة التي يسببها (آي بي إس) الجذعية، والتي يمكن أن تكون متباينة في أنواع الخلايا التي هي متميزة الهدف الرئيسي للعملية المرض 14. في حالة مرض باركنسون، والتفريق بين الخلايا الليفية الخلايا العصبية الدوبامين في هذا النموذج يجعل الخلوية أداة واعدة للبحث في المستقبل في هذا اضطراب الاعصاب 15،16. الأهم، يمكن للجميع المقايسات التي يعالجها البروتوكول هنا ترجمتها بسهولة إلى الاجهزة التجريبية للتحقيق في التعديلات الميتوكوندريا داخل الخلايا العصبية الدوبامين. بالطبع، يمكن تطبيق أكثر الخلايا العصبية الخاصة الخلية الحية التصوير التجارب أيضا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة فريتس تيسن (10.11.2.153 إلى RK)، ومجلس البحوث الألمانية (DFG، وKR2119/3-2 KR2119/8-1 إلى RK)، والوزارة الاتحادية للتعليم والبحث (BMBF ، NGFNplus؛ 01GS08134 إلى RK) ومنحة دراسية من مؤسسة الدكتوراه هرتي الخيرية [لLFB]. نشكر كارولين OBERMAIER وWestermeier جوليا لما قدموه من دعم خلال تبادل لاطلاق النار الفيديو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Invitrogen 52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red Invitrogen 11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Invitrogen 14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 100-18B
AccuMax (detachment solution) PAA L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses Nalge Nunc International 115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) Invitrogen T-669
Mitotracker Green FM Invitrogen M-7514
Mitotracker CM-H2XRos Invitrogen M-7513
Lyostracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
H–chst 33342 Invitrogen H-3570

Table 1. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Rijk, M. C., Launer, L. J., Berger, K., Breteler, M. M., Dartigues, J. F., Baldereschi, M., Fratiglioni, L., Lobo, A., Martinez-Lage, J., Trenkwalder, C. Prevalence of Parkinson's disease in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 21-23 (2000).
  2. Dorsey, E. R., Constantinescu, R., Thompson, J. P., Biglan, K. M., Holloway, R. G., Kieburtz, K., Marshall, F. J., Ravina, B. M., Schifitto, G., Siderowf, A. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations. Neurology. 68, 384-386 (2005).
  3. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
  4. Chung, K. K., Zhang, Y., Lim, K. L., Tanaka, Y., Huang, H., Gao, J., Ross, C. A., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease. Nature. 7, 1144-1150 (2001).
  5. Kruger, R., Eberhardt, O., Riess, O., Schulz, J. B. Parkinson's disease: one biochemical pathway to fit all genes. Trends Mol. Med. 8, 236-240 (2002).
  6. Krebiehl, G., Ruckerbauer, S., Burbulla, L. F., Kieper, N., Maurer, B., Waak, J., Wolburg, H., Gizatullina, Z., Gellerich, F. N., Woitalla, D. Reduced basal autophagy and impaired mitochondrial dynamics due to loss of Parkinson's disease-associated protein DJ-1. PLoS One. 5, e9367 (2010).
  7. Exner, N., Treske, B., Paquet, D., Holmstrom, K., Schiesling, C., Gispert, S., Carballo-Carbajal, I., Berg, D., Hoepken, H. H., Gasser, T. Loss-of-function of human PINK1 results in mitochondrial pathology and can be rescued by parkin. J. Neurosci. 27, 12413-12418 (2007).
  8. Burbulla, L. F., Krebiehl, G., Kruger, R. Balance is the challenge--the impact of mitochondrial dynamics in Parkinson's disease. European journal of clinical investigation. 40, 1048-1060 (2010).
  9. Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z., Muller, T., Bornemann, A. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Human molecular genetics. 14, 2099-2111 (2005).
  10. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of cell biology. 183, 795-803 (2008).
  11. Dagda, R. K., Cherra, S. J. 3rd, Kulich, S. M., Tandon, A., Park, D., Chu, C. T. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. The Journal of biological chemistry. 284-13843 (2009).
  12. Kieper, N., Holmstrom, K. M., Ciceri, D., Fiesel, F. C., Wolburg, H., Ziviani, E., Whitworth, A. J., Martins, L. M., Kahle, P. J., Kruger, R. Modulation of mitochondrial function and morphology by interaction of Omi/HtrA2 with the mitochondrial fusion factor OPA1. Experimental cell research. 316, 1213-1224 (2010).
  13. Burbulla, L. F., Schelling, C., Kato, H., Rapaport, D., Woitalla, D., Schiesling, C., Schulte, C., Sharma, M., Illig, T., Bauer, P. Dissecting the role of the mitochondrial chaperone mortalin in Parkinson's disease: functional impact of disease-related variants on mitochondrial homeostasis. Human molecular genetics. 19, 4437-4452 (2010).
  14. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  15. Nguyen, H. N., Byers, B., Cord, B., Shcheglovitov, A., Byrne, J., Gujar, P., Kee, K., Schule, B., Dolmetsch, R. E., Langston, W. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
  16. Seibler, P., Graziotto, J., Jeong, H., Simunovic, F., Klein, C., Krainc, D. Mitochondrial Parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5970-5976 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics