El uso de fibroblastos humanos primarios para la Supervisión de fenotipos mitocondriales en el campo de la enfermedad de Parkinson

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Summary

Los fibroblastos de pacientes portadores de mutaciones causantes de la enfermedad en el Parkinson genes representan un fácil acceso

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Burbulla, L. F., Krüger, R. The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (68), e4228, doi:10.3791/4228 (2012).

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Abstract

Enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno del movimiento más común y afecta a 1% de las personas mayores de 60 1. Debido a que el envejecimiento es el factor de riesgo más importante, los casos de PD aumentará durante las próximas décadas 2. Al lado de plegamiento de proteínas patológicas y deteriorados vías de degradación de proteínas, alteraciones de la función mitocondrial y la morfología fueron señalados como sello distintivo adicional de la neurodegeneración en la EP 3-11.

Después de años de investigación en células de cáncer murino y humano como en modelos in vitro para diseccionar las vías moleculares de parkinsonismo, el uso de fibroblastos humanos de pacientes y controles apropiados como modelos ex vivo se ha convertido en una valiosa herramienta de investigación, si se consideran posibles salvedades. Aparte de modelos celulares inmortalizadas, más bien artificiales, fibroblastos primarios de los pacientes portadores de enfermedades asociadas a mutaciones aparentemente reflejan importantes características patológicas of la enfermedad humana.

Aquí delinear el procedimiento de toma de biopsias de piel, los fibroblastos humanos cultivo y el uso de protocolos detallados para esenciales técnicas microscópicas para definir los fenotipos mitocondriales. Estos fueron usados ​​para investigar las características diferentes asociados con la EP que son relevantes para la función mitocondrial y la dinámica. Ex vivo, las mitocondrias pueden ser analizadas en términos de su función, la morfología, la colocalización con lisosomas (los orgánulos degradantes mitocondrias disfuncionales) y la degradación a través de la vía lisosomal . Estos fenotipos son altamente relevantes para la identificación de los signos iniciales de la EP y puede preceder a los síntomas clínicos de motor en genes humanos portadores de enfermedades. Por lo tanto, los ensayos presentados aquí pueden ser utilizados como herramientas valiosas para identificar las características patológicas de la neurodegeneración y ayudar a definir nuevas estrategias terapéuticas en la EP.

Protocol

1. Biopsia de la Piel y el cultivo de fibroblastos humanos

  1. La biopsia de piel tiene que ser tomada por un médico experimentado. El procedimiento se lleva a cabo bajo condiciones estériles y se requiere anestesia local. Los sitios típicos para biopsia son el lado interior de la parte superior del brazo, hombro o espalda baja.
  2. Usted puede tomar muestras diámetro 4x4mm 6x6mm o por biopsia por punción para obtener suficiente tejido para cultivo de fibroblastos humanos.
  3. Cortar la biopsia de la piel en la igualdad de las piezas pequeñas bajo condiciones estériles para separarlos en 2-4 matraces T25. Cada frasco debe contener 2-3 piezas de epidermis. El medio de cultivo contiene 15% de FCS, 1,1% de piruvato de sodio y 1% de penicilina / estreptomicina en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio.
  4. Se incuban las células a 37 º C y 5% CO 2. El tiempo de propagación de espera hasta que los fibroblastos primero crecen fuera de la muestra de la epidermis es de 1-2 semanas. Si los problemas de crecimiento se encuentra, usted puede hacer uso de fa de crecimiento de fibroblastosctor (5-10 ng / ml de FGF2) para mejorar el crecimiento de las células.
  5. Una vez que una confluencia de células de 50-70% se alcanza, los fibroblastos humanos primarios se pueden congelar. El tiempo de hasta 50-70% de confluencia se alcanza, se diferencia entre las líneas celulares. Congelar los fibroblastos en FCS 90% más 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO).

2. Preparación de fibroblastos humanos para microscopía en vivo imágenes de la célula

En general, los experimentos con los fibroblastos humanos se debe realizar con pasajes debajo de 10 como la senescencia asociada a alteraciones pueden cambiar las propiedades de las células después de múltiples pases. En caso de duda, beta-galactosidasa ensayos pueden usarse para evaluar la inducción de procesos de envejecimiento en las células respectivas. En general, no utilizan fibroblastos envejecidos (véase más arriba). Además, para comparar varias líneas celulares, trabajar con el número mismo paso de cada línea celular. Comparación de los diferentes pacientes genéticamente homogéneos en comparación con los controles sanos se recomienda. Sin embargo, como a vecespacientes portadores de mutaciones específicas pueden ser raras, esto puede significar que las biopsias de piel de un solo paciente con un número determinado pasaje y las diferentes líneas de control tienen que ser incluidos - aquí es esencial para asegurar el pasaje mismo número de todas las líneas incluidas. Si una célula confluencia de 50-70% que se alcanza pero está previsto ningún experimento, los fibroblastos se debe congelar.

  1. En el primer día del experimento, se lavan los fibroblastos adjuntos una vez con PBS. A continuación, liberarlos de la matraz de fondo mediante el uso de una solución de desprendimiento celular de enzimas proteolíticas DNasa (es decir AccuMax).
  2. Cuenta tus células y semillas de 50.000-70.000 células en cada pocillo de un cubreobjetos de 4 cámaras (1,8 cm 2 área cultural por pocillo). Por consiguiente, para los coverglas 8-cámara, media del número de células o un poco menos es apropiado (0,8 cm 2 área de cultivo por pocillo). Es importante semillas en lugar de un pequeño número de células para llevar a cabo verdadero sola célula de análisis. Sin revestimiento específico para las cámaras is necesario.
  3. Después de 24-48 hr, el experimento de formación de imágenes en vivo de células se puede realizar. Asegúrese de que el microscopio de células de imágenes en vivo está equipado con una incubadora que controla la temperatura y los niveles de CO 2. Durante la adquisición de la imagen, una atmósfera de 37 ° C y 5% CO 2 debe mantenerse.
  4. Cada medición de células de imágenes en vivo debe llevarse a cabo en al menos tres experimentos independientes. En total, un mínimo de 50 células por línea celular debería ser reflejado. Los experimentos de formación de imágenes de células vivas, así como el análisis fuera de línea tienen que realizarse de forma ciega para garantizar datos recomendaciones de recogida.

3. Medición de la función mitocondrial en fibroblastos humanos Living

Para la medición convencional de la función mitocondrial a través de potencial de membrana mitocondrial (MMP)-dependientes colorantes, clasificación de células activadas fluorescentes (FACS) es el método principal. En el caso de los fibroblastos humanos, celular autofluorescence se observa con frecuencia y puede causar resultados falsos positivos por la interferencia con la señal de tinción real. Autofluorescencia típicamente se hace más pronunciada con números de paso superiores de los fibroblastos. Por lo tanto, se prefiere para evaluar la función mitocondrial de fibroblastos humanos por microscopía en vivo de imágenes de células.

  1. 24-48 h después de la siembra, incubar los fibroblastos en 50 nM de la MMP-dependiente colorante tetramethylrodamine éster etílico (TMRE) en medio RPMI. Este medio RPMI debería carecer de rojo de fenol como esto puede afectar negativamente la calidad de imagen. 1,6 M de tinción Hoechst debe añadirse para visualizar los núcleos.
  2. Se incuban las células en solución de tinción preparado protegido de la luz durante 15 min a 37 ° C y 5% CO 2.
  3. Reemplazar la solución de tinción con medio RPMI (sin rojo de fenol). Proceder sin una etapa de lavado y de inmediato celdas de imagen. Uso de ampliación 63x y confocal de barrido láser técnica de microscopía (microscopía de fluorescencia utilizando alternativamenteApótoma técnica) para definir una sola capa de células. Aplicar 37 ° C y 5% CO 2 a las células durante el proceso de formación de imágenes.
  4. Cuando la imagen de los fibroblastos, preste la máxima atención al tiempo de exposición aplicado de luz fluorescente como la tinción TMRE puede blanquear rápidamente. Defina su tiempo de exposición adecuado entre 200 y 300 ms y no exceden este intervalo. La adquisición de la imagen en virtud de ajustes estandarizados es muy importante, como uno sería incapaz de hacer comparaciones basadas en intensidad si la configuración es diferente entre las líneas celulares.
  5. En un radio definido alrededor de las células con imagen se blanquea a cabo después de la exposición a la luz, mantener el campo visual próximo suficientemente lejos de la sección photobleached.
  6. Off-line los análisis se realizaron utilizando el software ImageJ (Wayne Rasband; Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.).
  7. Seleccione la celda de interés mediante el uso de una herramienta de selección.
  8. Convierte la imagen a 8 bits (Imagen <Escriba <8-bit).
  9. Reducir el ruido b inespecíficay utilizando el "Limpiar" la función (Proceso <Ruido <Eliminar manchas).
  10. Elija la opción "tablas de búsqueda - Fire" estado de presentación (Imagen <tablas de búsqueda Fire <).
  11. Interruptor en el umbral de la función "Más / Menos" Función y ajuste de umbral (Imagen <Ajuste del umbral <).
  12. Seleccione la opción "analizar partículas", la cual le dará el valor medio para cada partícula gris mitocondrial detectable (<Analizar analizar partículas). Guarde la lista de resultados dado como una hoja de cálculo Excel.
  13. Archivo de los resultados en el programa Excel y calcular el promedio del valor de gris medio de las estructuras mitocondriales (indicado como 'media' en la lista de resultados dado excel).
  14. Para crear un gráfico de superficie, elija el plugin "trama de superficie 3D interactivo" en la sección "3D" plugin. En este caso, se puede ajustar más la trama con diferentes opciones de visualización. "Cambio de los colores originales" a "Spectrum LUT" da la barra de la escala de intensidad de la parcela correspondiente.
  15. Alternativamenteal uso de TMRE para analizar la función mitocondrial de fibroblastos humanos a través de imágenes de células vivas, una combinación de la MMP-independiente colorante Mitotracker FM Green y el colorante Mitotracker MMP-dependiente CM-H 2 Xros se puede utilizar. De nuevo, para los fibroblastos humanos viven microscopía imágenes de células se prefiere, pero, en general, esta alternativa también se ha utilizado usando análisis FACS en otro tipo de células 12. Cuando se utiliza este método alternativo para medir la función mitocondrial en fibroblastos humanos, paso 3.7 de la sección de protocolo 5 "Medición de mitochondrio-lisosomal colocalización de vida fibroblastos humanos" debe ser aplicado. Con ello, la superposición de señales, tanto de positivo mitocondrias para Mitotracker Green FM y Mitotracker CM-H Xros 2 se calcula y se indica la cantidad de mitocondrias funcionales como relación a todos los presentes las mitocondrias.

4. La medición de la morfología mitocondrial en fibroblastos humanos Living

  1. 24-48hr después de la siembra, las células se incuban en 200 nM Mitotracker FM Green en medio RPMI (sin rojo fenol) protegido de la luz durante 15 min a 37 ° C y 5% CO 2. 1,6 M de tinción Hoechst se debe utilizar para resaltar los núcleos. Mitotracker Green FM es un colorante MMP-independiente, que tiñe todas las estructuras mitocondriales presentan.
  2. Lavar suavemente las células una vez con PBS.
  3. Añadir medio RPMI (sin rojo fenol) a las células e inmediatamente celdas de imagen. Utilice ampliación 63x y el escaneo láser confocal técnica de microscopía (microscopía de fluorescencia utilizando una técnica alternativa apótoma) para definir una sola capa de células.
  4. Off-line análisis se extraen mediante el uso de software ImageJ.
  5. Seleccione la celda de interés mediante el uso de una herramienta de selección.
  6. Convierte la imagen a 8 bits (Imagen <Escriba <8-bit).
  7. Reducir el ruido no específica mediante la opción "Limpiar" la función (Proceso <Ruido <Eliminar manchas).
  8. Utilice el filtro de convolución para resaltar mitoconestructuras drial (Proceso <Filtros <convolución).
  9. Ajuste del umbral de forma que la relación señal-a-ruido es apropiado (Imagen <Ajuste <umbral).
  10. Mediante el uso de la "analizar partículas" opción, la identificación automática de las estructuras mitocondriales se inicia sobre la base de un tamaño de píxel escogido (<Analizar analizar partículas). Varios parámetros mitocondriales posteriormente se calcula como el área, perímetro, ejes menor y mayor o circularidad. Estas medidas se pueden ajustar individualmente (<Analizar Medidas Set). Guarde la lista de resultados dado como una hoja de cálculo Excel.
  11. Abrir archivo de resultados en el programa Excel. Con el uso de tales parámetros, el análisis de la morfología mitocondrial puede llevarse a cabo. Esto incluye la definición del factor de forma que indica el grado de ramificación de una red mitocondrial [fórmula: (perímetro 2) / (4 * PI () * área)], así como la relación de aspecto que define la longitud de las mitocondrias (fórmula: major Ejes / ejes menores).

5. Medición de Mitochondrio-lisosomal Colocalización Vivir en fibroblastos humanos

  1. 24-48 horas después de la siembra, las células se incuban en 200 nM Mitotracker FM Green y 100 nM Lyostracker Red DND-99 en medio RPMI (sin rojo fenol) protegido de la luz durante 15 min a 37 ° C y 5% CO 2. 1,6 M de tinción Hoechst se utiliza para resaltar los núcleos.
  2. Sustituir el medio con medio RPMI (sin rojo fenol) que contenía 100 nM Lyostracker Red DND-99. Este colorante tiene que estar presente durante la sesión de formación de imágenes completo. No lave las células después del período de incubación. Inmediatamente imagen de las células. Uso de ampliación 63x y técnica confocal (técnica alternativamente apótoma) para definir capas individuales de células.
  3. Off-line análisis se extraen mediante el uso de software ImageJ.
  4. Abra las dos respectivas imágenes que le gustaría analizar en términos de estado de colocalización.
  5. Convierte la imagen a 8 bits (Imagen <Escriba <8-bit). Reducir el ruido no específica utilizando la opción "Eliminar manchas" en función de las dos imágenes (Proceso <Ruido <Eliminar manchas).
  6. Elija el plugin "JACOP" como herramienta de análisis de colocalización, que te da los valores de los respectivos canales y calcula el coeficiente de Pearson, coeficiente se superponen y el coeficiente Manders (Plugins <JACOP).

6. Los resultados representativos

La función mitocondrial en fibroblastos humanos viviendo se puede evaluar a través de la técnica de imágenes de células en vivo. Para los ensayos funcionales, la señal TMRE fluorescencia se correlaciona con el potencial de membrana mitocondrial (MMP). En condiciones normales de MMP, la fluorescencia TMRE es significativamente mayor (Figura 1A, fila superior) que en condiciones patológicas caracterizadas por una reducción de MMP (Figura 1A, fila inferior). Esta intensidad de fluorescencia se mide calculando la media del valor de gris medio de cada estructura mitocondrial ( (Figura 1A, derecha).

Junto a la evaluación de la función mitocondrial en fibroblastos humanos, microscopía en vivo de imágenes de células se puede utilizar para definir diferentes parámetros de la morfología mitocondrial. Mediante el uso de la Mitotracker FM Verde estructuras de colorante mitocondrial se visualizan independiente de su MMP respectivo (Figura 2). Esto es importante para garantizar la inclusión de todas las estructuras mitocondriales presentes en los análisis. Usando el software ImageJ, la morfología es analizada sobre la base de cifras binarias, como sólo parámetros aquí morfología mitocondrial puede ser evaluado (Figura 2, "binario"). Ejemplos de análisis de la morfología mitocondrial en términos de factor de forma, así como la relación de aspecto se han publicado recientemente 6, 13. Otra característica importante que se puede medir en fibroblastos humanos vivos es la degradación de las estructuras mitocondriales. El primer paso en este progreso se puede evaluar por mitochondrio-lisosomal colocalización en microscopía en vivo de imágenes de células. Ciertas condiciones patológicas resultan en un aumento de las mitocondrias colocalización con lisosomas (Figura 3A). Una vez más, Mitotracker Green FM se utiliza para teñir estructuras mitocondriales independientes de su respectivo MMP. Además, la tinción con Lysotracker Red DND-99 permite visualizar estructuras lisosomales. Es crítico que el colorante Lysotracker Red está presente durante el proceso de formación de imágenes, como los pasos de lavado reducir la señal que llega a ser demasiado bajo para la visualización. Colocalización está representada por claras señales de fluorescencia amarilla debido a la superposición de la luz verde (Green Mitotracker FM) y rojo (Lysotracker Red DND-99) de tinción (flechas blancas, Figura 3A) y se determinan mediante el cálculo del coe Pearsonfficient (Figura 3B).

En general, para el análisis fuera de línea con el software ImageJ, es útil para visualizar una célula por imagen, por lo que la definición de una región específica de interés (ROI) puede ser evitado.

Figura 1
Figura 1. Medición de la señal de fluorescencia TMRE indique el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en sala de fibroblastos humanos mediante la técnica de formación de imágenes en vivo de células. (A) es un TMRE fluorescente MMP-dependiente colorante, cuya intensidad de fluorescencia se correlaciona con la MMP. Colorante Hoechst se usó para teñir los núcleos (azul). En condiciones normales de MMP (fila superior), la fluorescencia TMRE es significativamente mayor que en condiciones patológicas caracterizadas por una reducción de MMP (fila inferior). La intensidad de fluorescencia se muestra adicionalmentecomo argumento intensidad superficie. La barra de escala indica 10 m. (B) Los análisis estadísticos de los fibroblastos de ejemplo mostrada en (A). En condiciones patológicas, una fluorescencia TMRE disminución de las mitocondrias se mide en comparación con la condición de MMP normal. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 2
Figura 2. Medición de la morfología mitocondrial en fibroblastos humanos vivos por la técnica de formación de imágenes en vivo de células. Mitotracker FM Green (verde) se utiliza para visualizar las estructuras mitocondriales, para que sea independiente de la MMP. Colorante Hoechst se usó para teñir los núcleos (azul). El uso del software ImageJ, la morfología se puede analizar en cifras binarias. La barra de escala indica 10 m. Click aquí para ampliar la figura.

Figura 3
Figura 3. Medición de la colocalización de las mitocondrias con lisosomas en los fibroblastos humanos vivos por la técnica de formación de imágenes en vivo de células. (A) Mitotracker FM Green (verde) se usa para teñir estructuras mitocondriales, Lyostracker Red DND-99 (rojo) visualiza estructuras lisosomales. Colorante Hoechst se usó para teñir los núcleos (azul). Colocalización con éxito bajo condiciones patológicas se indica por una señal de color amarillo debido a la superposición de Red Lysotracker y tinción Mitotracker Green (flechas blancas). La barra de escala indica 10 m. (B) Los análisis estadísticos de los fibroblastos de ejemplo mostrada en (A). Un mayor grado de colocalización resultados mitochondrio-lisosomales en un valor elevado coeficiente de Pearson./ 4228/4228fig3large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ampliar la figura.

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Discussion

Fibroblastos de la piel del paciente como modelos ex vivo representan una herramienta importante para caracterizar la enfermedad asociada a defectos genéticos. Además, la piel derivados de fibroblastos son fácilmente accesibles y se pueden expandir en cultivo. Por lo tanto, las células primarios obtenidos de pacientes portadores de PD asociadas a mutaciones genéticas son preferibles a la utilización de líneas de células tumorales, ya que contienen no sólo el endógeno gen causante de enfermedad, pero todo el trasfondo genético de la persona afectada. Además, los fibroblastos se ha demostrado que reflejan importantes características patológicas de la disfunción mitocondrial durante la neurodegeneración. Los experimentos descritos en este protocolo son especialmente útiles para estudiar los fenotipos mitocondriales incluyendo la función, morfología, así como la evaluación de colocalización de las mitocondrias con los lisosomas a través de técnica de formación de imágenes en vivo de células. Con esto, características principales de la enfermedad, a saber, la disfunción mitocondrial y degradantes subsiguienteación de estos orgánulos no funcionales, puede ser visualizado y analizado correctamente 6, 13. Las alteraciones de la función mitocondrial y la morfología son a menudo una primera etapa de patología de la enfermedad. Por ejemplo, el aumento de la fragmentación de la red mitocondrial puede ser un requisito previo de la mejora de los procesos y autofágicas mitophagic 6,12. Por lo tanto, la colocalización de las mitocondrias con los lisosomas pueden ayudar a evaluar la degradación mitocondrial (mitophagy) 6. A falta de esta colocalización así como una acumulación de mitocondrias con los lisosomas podría reflejar defectos en la ruta de degradación lisosomal y tiene que ser validado por el flujo modulando autophagic 6. En este contexto, ImageJ software representa una importante herramienta para generar conjuntos de datos homologados por medio automáticas de funciones de análisis sesgados.

Una opción adicional que amplía el uso de fibroblastos humanos a un mayor número de enfermedades relacionadas con los modelos es la generadora potencialion de pluripotentes inducidas (iPS), células que pueden diferenciarse en tipos de células distintas que son el objetivo principal del proceso de la enfermedad 14. En el caso de la enfermedad de Parkinson, la diferenciación de los fibroblastos en neuronas dopaminérgicas que hace que este modelo de celular una herramienta prometedora para la investigación futura en este trastorno neurodegenerativo 15,16. Cabe destacar que todos los ensayos descritos en el protocolo aquí puede ser fácilmente traducido a configuraciones experimentales para la investigación de alteraciones mitocondriales dentro de las neuronas dopaminérgicas. Por supuesto, aún más específico de neuronas experimentos en vivo de imágenes de células se puede aplicar, también.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Fritz Thyssen (10.11.2.153 a RK), el Consejo Alemán de Investigación (DFG, KR2119/3-2 y KR2119/8-1 a RK), el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 a RK) y por una beca doctoral de la Fundación Hertie caridad [a LFB]. Damos las gracias a Carolin Obermaier y Westermeier Julia por su apoyo durante la filmación del video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Invitrogen 52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red Invitrogen 11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Invitrogen 14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 100-18B
AccuMax (detachment solution) PAA L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses Nalge Nunc International 115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) Invitrogen T-669
Mitotracker Green FM Invitrogen M-7514
Mitotracker CM-H2XRos Invitrogen M-7513
Lyostracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
H–chst 33342 Invitrogen H-3570

Table 1. Specific reagents and equipment.

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References

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